單點(diǎn)式位移平臺(tái)激光共聚焦掃描熒光顯微鏡

陶振強(qiáng)　賈南南　阮斌

摘要： 為了獲得細(xì)胞圖像，利用Visual Studio C#開發(fā)了移動(dòng)位移平臺(tái)的控制程序，使用位移平臺(tái)單點(diǎn)掃描的方式設(shè)計(jì)激光共聚焦掃描顯微鏡（laser confocal scanning microscope，LCSM）。為了獲得高分辨率的位移，位移由精度可以達(dá)到1 nm的壓電陶瓷驅(qū)動(dòng)器驅(qū)動(dòng)。設(shè)計(jì)了梳狀和矩形兩種掃描路徑，通過程序設(shè)計(jì)位移補(bǔ)償?shù)姆椒◤浹a(bǔ)了機(jī)械運(yùn)動(dòng)的偏差。利用算術(shù)平均值的數(shù)字濾波方法處理數(shù)據(jù)采集卡采集的數(shù)據(jù)以減小隨機(jī)噪聲的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，利用C#程序控制的單點(diǎn)式平臺(tái)掃描LCSM具有較好地測量效果。

關(guān)鍵詞： 共聚焦； 熒光顯微鏡； 數(shù)字濾波； 平臺(tái)掃描； C#程序控制； 位移補(bǔ)償

中圖分類號(hào)： Q 631文獻(xiàn)標(biāo)志碼： Adoi： 10.3969/j.issn.10055630.2015.02.017

Singlepoint displacement of the platform laser confocal scanning

fluorescence microscope

TAO Zhenqiang， JIA Nannan， RUAN Bin

（School of OpticalElectrical and Computer Engineering， University of Shanghai for

Science and Technology， Shanghai 200093， China）

Abstract： In order to obtain cells image， we use Visual Studio C# to develop the control program of the mobile displacement platform， and use displacement singlepoint scanning way to design laser confocal scanning microscope （LCSM）. In order to obtain high resolution displacement， displacement of the platform with piezoelectric ceramic actuator is used and the highest accuracy can reach 1 nm. Both comb and rectangle scanning paths are designed， by programming the displacement compensation method to make up the mechanical movement deviation. Digital filtering arithmetic average method of dealing with the data acquisition card is used to collect data to reduce the influence of random noise. Experimental results show that singlepoint platform using C# program LCSM has a very good effect.

Keywords： confocal； fluorescence microscopy； digital filtering； displacement of the platform； C# control program； displacement compensation

引言激光共聚焦掃描顯微鏡[1]（laser confocal scanning microscope，LCSM）高度結(jié)合光、機(jī)、電、計(jì)算機(jī)和圖像處理等技術(shù)，使其在光學(xué)顯微領(lǐng)域具有極其重要的地位。與傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡相比其具有很高的橫向和縱向分辨率[23]，光學(xué)切片式的測量方式可以觀測物體的三維結(jié)構(gòu)。其優(yōu)良的性能在半導(dǎo)體[4]、材料科學(xué)[5]、生物醫(yī)學(xué)[6]領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。激光共聚焦掃描熒光顯微鏡是結(jié)合激光共聚焦掃描顯微鏡和激光誘導(dǎo)熒光成像技術(shù)[7]的用于觀察細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的儀器。激光共聚焦掃描顯微鏡以光學(xué)共軛焦點(diǎn)（簡稱共焦）成像技術(shù)[8]為基礎(chǔ)，相比傳統(tǒng)的熒光顯微鏡最大的優(yōu)點(diǎn)在于加上了掃描系統(tǒng)，通過掃描可以對(duì)物體進(jìn)行三維動(dòng)態(tài)檢測。掃描系統(tǒng)通常有兩種工作方法[9]：光束掃描和物體掃描。光束掃描就是被掃描物體不動(dòng)光束運(yùn)動(dòng)；物體掃描就是被掃描物體運(yùn)動(dòng)光束不動(dòng)。光束掃描的優(yōu)點(diǎn)是掃描速度快、精度高；物體掃描的優(yōu)點(diǎn)是視場大、光學(xué)畸變小。圖1激光共聚焦掃描顯微鏡原理圖

Fig.1Laser confocal scanning microscope principle1激光共聚焦掃描顯微鏡的原理激光共聚焦掃描顯微鏡采用共軛焦點(diǎn)技術(shù)，使用激光作為光源，被探測物體和探測器處于彼此對(duì)應(yīng)的共軛焦點(diǎn)位置。如圖1所示，激光器發(fā)出的激光光束通過擴(kuò)束鏡擴(kuò)束形成平行度好、直徑合適的平行光束，此光束被二向色鏡反射后進(jìn)入物鏡，被物鏡聚焦于載物臺(tái)上的被測物體（以細(xì)胞為例）上。被熒光染色的細(xì)胞受激光照射后發(fā)出另外一種波長的光，反向通過物鏡形成和入射光束平行的熒光平行光，熒光可以通過二向色鏡而不被反射。通過二向色鏡的熒光被透鏡聚焦，在焦點(diǎn)處放置有針孔，此處針孔的作用是濾除非焦點(diǎn)處熒光的雜散光，針孔處放置有光電倍增管（PMT）以接收熒光信息。光學(xué)儀器第37卷

第2期陶振強(qiáng)，等：單點(diǎn)式位移平臺(tái)激光共聚焦掃描熒光顯微鏡

2激光共聚焦掃描熒光顯微鏡的關(guān)鍵因素

2.1針孔大小的選擇PMT前方針孔大小的選擇對(duì)LCSM成像影響極大，有關(guān)針孔大小該如何確定的研究有許多[1011]，研究表明，當(dāng)針孔直徑恰好等于一個(gè)愛里斑直徑時(shí)，探測器通過針孔接收的光能量最大，成像效果最好。愛里斑通過系統(tǒng)成像的直徑為D=β1.22λNA（1）式中：β為系統(tǒng)的放大倍率，即物鏡的焦距和透鏡焦距之比；λ為所用光波長；NA為物鏡數(shù)值孔徑。實(shí)驗(yàn)所用的λ=405 nm，NA=0.95，β=40，由此可知愛里斑成像直徑約為20.8 μm。

2.2數(shù)字濾波處理方法LCSM成像數(shù)據(jù)是通過采集卡A/D轉(zhuǎn)換而來，通過采集卡把模擬信號(hào)轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)。由于通過采集卡采集轉(zhuǎn)換的數(shù)據(jù)沒經(jīng)過任何處理，會(huì)帶有許多干擾信號(hào)，噪聲較大。為了得到更好的數(shù)據(jù)使圖像更加清晰，就需要對(duì)采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，以濾除干擾信號(hào)。數(shù)據(jù)處理方法多種多樣[12]，最常用的有算術(shù)平均值數(shù)字濾波、加權(quán)平均值數(shù)字濾波、滑動(dòng)平均值濾波、中值濾波等。由于實(shí)驗(yàn)中會(huì)有各種隨機(jī)干擾（隨機(jī)噪聲），實(shí)驗(yàn)選用的是算術(shù)平均值數(shù)字濾波方法，按輸入的N個(gè)采樣數(shù)據(jù)xi（i=1，2，3，…，N），尋找y，使y與各采樣值間的偏差平方和最小，其公式為E=min∑Ni=1（y-xi）2（2）對(duì)式（2）求極值可得y=∑Ni=1xiN，該方法就是把N次采樣值相加，然后取其算術(shù)平均值為本次采樣值。實(shí)驗(yàn)是通過C#編寫程序[13]對(duì)采集卡采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，程序代碼如下：

sum=0；

{

for （int k=0；k

{

double[]data=reader.ReadSingleSample（）；讀取采集卡采集數(shù)據(jù)sum=sum+data[0]；對(duì)某一點(diǎn)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行累加

}

sampledata[i，columns -1 -j]= sum/GParameters.averages；i、j為行數(shù)和列數(shù)

}3位移平臺(tái)控制設(shè)計(jì)為了達(dá)到更好的實(shí)驗(yàn)效果，使用PI公司生產(chǎn)的壓電陶瓷驅(qū)動(dòng)的六軸納米位移平臺(tái)，型號(hào)是P562.6CD，x、y、z軸移動(dòng)范圍均為200 μm，位移精確度為1 nm，完全可以滿足高分辨率的需求。采用單點(diǎn)掃描方法控制平臺(tái)移動(dòng)，單點(diǎn)掃描就是把單一方向上的量程按要求分成等分點(diǎn)，位移平臺(tái)移動(dòng)時(shí)在每一個(gè)點(diǎn)上停一下，同時(shí)采集卡在此采集數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)采用每點(diǎn)采集1 000個(gè)數(shù)據(jù)，然后取平均值。

3.1掃描方式的選擇單點(diǎn)掃描可分為兩種掃描方式：梳狀波掃描和矩形波掃描。梳狀波掃描就是掃描沿著同一個(gè)方向進(jìn)行，也就是說沿x軸的方向不變，x的起始點(diǎn)是一定的；矩形波掃描就是雙向來回掃描，也就是說沿著x軸方向在起點(diǎn)和終點(diǎn)來回交替變化。圖2、圖3分別是梳妝波、矩形波掃描的局部路徑圖。

圖2梳狀波掃描局部路徑

Fig.2Comb wave scanning path

圖3矩形波掃描局部路徑

Fig.3Rectangular wave scanning path

梳狀波掃描程序?yàn)椋?/p>

for（int i=0；i

∥PI的y軸對(duì)應(yīng)圖像的y（行數(shù)）

{

for（int j=0；j

∥PI的x軸對(duì)應(yīng)圖像的x（列數(shù)）

{

goalPos[0]= goalPos[0]+x_grid；

}

∥移動(dòng)PI臺(tái)到新的一行

goalPos[0]= GParameters.nowPos[0]；

∥x軸返回起始位置

goalPos[1]=goalPos[1]+y_grid；

∥y軸移動(dòng)一個(gè)采集距離

}

矩形波掃描程序如下：

for（inti=0；i

{

if（（i+1）% 2 == 0）∥判斷奇偶行

{for（int j=0；j

-j*x_grid；}

}

else

{

for（int j=0；j

goalPos[1]=y_Initial+（i+1）*y_grid；∥y跳到新一行

3.2位置偏差的補(bǔ)償由圖2、圖3可以看出，掃描時(shí)位移臺(tái)移動(dòng)和設(shè)計(jì)會(huì)有偏差，這是由于位移臺(tái)移動(dòng)有加速和減速過程，所以采集卡在采集數(shù)據(jù)時(shí)就會(huì)有偏差，也就是說對(duì)于細(xì)胞上某一點(diǎn)（i，j）預(yù)期對(duì)應(yīng)的下一點(diǎn)（i，j+1）可能由于位移臺(tái)移動(dòng)時(shí)機(jī)械誤差的原因變成點(diǎn)（i，j+2），如圖4所示。這時(shí)可以在程序中彌補(bǔ)機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的位移偏差，增加代碼為：goalPos[0]=x_Initial+j*x_grid±n；其中n值隨實(shí)際情況選取，所得效果如圖5所示。

圖4實(shí)際帶有位置偏差的效果圖

Fig.4Position deviation圖5程序糾正的效果圖

Fig.5Correction by using program

4實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖6為所設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)裝置圖?？紤]熒光效率，激光器使用的是波長為405 nm的半導(dǎo)體激光器，為了得到大視場范圍我們使用了數(shù)值孔徑為0.95的物鏡，本實(shí)驗(yàn)所采用的樣品是老鼠的神經(jīng)細(xì)胞，其平均尺寸約為10 μm。圖7為本實(shí)驗(yàn)的掃描細(xì)胞效果圖，由圖像可以看出，用Visual Studio C#程序控制的掃描對(duì)于細(xì)胞的掃描成像具有很好的效果。

圖6實(shí)驗(yàn)裝置圖

Fig.6Experimental setup圖7掃描細(xì)胞成像圖

Fig.7Cell image5結(jié)論影響激光共聚焦掃描熒光顯微鏡系統(tǒng)圖像質(zhì)量的因素有很多，比如光路搭建是不是共軸，數(shù)據(jù)采集卡的增益系數(shù)穩(wěn)定性，光電倍增管（PMT）的驅(qū)動(dòng)電源的電流電壓值是否穩(wěn)定等等，若要得到好的實(shí)驗(yàn)效果需要綜合考慮這些因素。參考文獻(xiàn)：

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（編輯：劉鐵英）