基因芯片表達(dá)分析4Gyγ射線對小鼠骨髓c-kit陽性細(xì)胞影響

張俊伶 路璐 李德冠 孟愛民

·論著·

基因芯片表達(dá)分析4Gyγ射線對小鼠骨髓c-kit陽性細(xì)胞影響

張俊伶 路璐 李德冠 孟愛民

目的 利用基因芯片技術(shù)分析經(jīng)4 Gyγ射線照射后c-kit（CD117，正常表達(dá)于干祖細(xì)胞表面的細(xì)胞因子受體）陽性細(xì)胞與代謝過程相關(guān)的基因及信號(hào)通路表達(dá)變化。方法 利用磁珠分選系統(tǒng)分選出骨髓c-kit陽性細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為對照組、4Gy照射組。取1×106個(gè)c-kit陽性細(xì)胞進(jìn)行照射，照射劑量率為0.99Gy/min。照射后將細(xì)胞培養(yǎng)18 h后取出，進(jìn)行全基因組的高通量基因芯片檢測，并進(jìn)行Gene Ontology聚類分析和Kyoto Encyclopedia ofGenesand Genomes信號(hào)通路分析。結(jié)果 4 Gyγ射線照射引起c-kit陽性細(xì)胞包括Pld5、Neu2、Bpgm、Alas2、Satl1、Rdh16、Mccc1、Sat2、Smug1、Cml5、Adhfe1、Idh3a、Slc27a5在內(nèi)的13個(gè)基因表達(dá)上調(diào)3倍以上，包括Acss2、Phgdh、Psat1、Glb1、Gpam、Dus3l、Fuca2、Impdh1、Dlat、Glb1、Enpp4、Prim2、Mettl10、Slc27a2、Dera、Qdpr、Dus1l、Cdyl2、Dhodh、Srr、Spr、Mical2在內(nèi)的22個(gè)基因表達(dá)下調(diào)3倍以上，這些基因主要參與嘌呤代謝、嘧啶代謝、三羧酸循環(huán)等信號(hào)通路。結(jié)論4Gyγ射線照射能引起c-kit陽性細(xì)胞中與代謝過程相關(guān)的許多基因表達(dá)發(fā)生變化，這些變化的基因有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

原癌基因蛋白質(zhì)c-kit；寡核苷酸序列分析；輻射，電離；細(xì)胞代謝

【Keywords】Proto-oncogene proteins c-kit;Oligonucleotide array sequence analysis;Radiation, ionizing;Metabolic process

電離輻射能夠引起造血系統(tǒng)損傷，包括急性骨髓抑制和持久性骨髓損傷，前者主要是快速增殖的造血祖細(xì)胞（hematopoietic progenitor cell，HPC）損傷所致，后者主要是由于電離輻射引起的造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell，HSC）損傷所致。已有的研究顯示，電離輻射引起HSC和HPC損傷的機(jī)制主要是細(xì)胞內(nèi)活性氧升高激活下游一系列信號(hào)通路，最終引起造血系統(tǒng)急性損傷和HSC、HPC衰老[1]。應(yīng)用系列抗氧化劑能夠部分緩解電離輻射引起的造血干祖細(xì)胞損傷。細(xì)胞內(nèi)活性氧水平升高同樣引起細(xì)胞代謝發(fā)生變化[2]，細(xì)胞代謝是近年研究的熱點(diǎn)，也是細(xì)胞最基本、最重要的活動(dòng)之一。代謝通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、糖尿病、衰老等病理生理過程中發(fā)揮著重要作用[3-5]，然而在電離輻射引起造血系統(tǒng)損傷中的作用卻少有研究。c-kit又稱為CD117，是正常表達(dá)于干祖細(xì)胞表面的細(xì)胞因子受體。c-kit陽性細(xì)胞是一群經(jīng)過富集的富含HPC和HSC的一類細(xì)胞，利用磁珠分選系統(tǒng)能在短時(shí)間內(nèi)快速分選出大量的c-kit陽性細(xì)胞，對c-kit陽性細(xì)胞電離輻射損傷的研究能夠初步反映HPC和HSC的損傷情況。因此，本研究以c-kit陽性細(xì)胞為對象，利用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)篩選出經(jīng)4Gyγ射線照射后在代謝過程中表達(dá)發(fā)生變化的基因，并分析這些基因的性質(zhì)和功能，為尋找電離輻射引起造血系統(tǒng)損傷的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

無血清擴(kuò)增培養(yǎng)基SFEM購自美國Stem Cell Technologies公司；c-kit磁珠和磁珠分選柱購自德國美天旎公司；137Csγ射線輻射源（型號(hào)USD，Autocell40）購自加拿大原子能有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

無特定病原體級(jí)C57BL/6雄性小鼠10只，體質(zhì)量21～23 g，8～10周齡，購自中國北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)SCXK（京）2012-0001。小鼠飼養(yǎng)于我所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3 c-kit陽性細(xì)胞分離

無菌分離小鼠雙側(cè)股骨脛骨，去除表面附著肌肉，將全部股骨脛骨放入研缽內(nèi)，輕輕研磨直至骨髓細(xì)胞完全釋放，裂解紅細(xì)胞后對獲取的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。按照每1×108個(gè)細(xì)胞加入20μl的c-kit磁珠，室溫孵育15min，孵育結(jié)束后加入5ml PBS，以離心半徑25 cm，1500 r/min，離心5min。離心完畢用10ml PBS重懸細(xì)胞，利用磁珠分選系統(tǒng)進(jìn)行c-kit陽性細(xì)胞分離[6]。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分為2組，其中，對照組：取含1×107個(gè)c-kit陽性細(xì)胞的懸液1ml加入至2ml離心管內(nèi)，作為未照射對照組；4 Gy照射組：在對照組基礎(chǔ)上進(jìn)行4Gyγ射線照射。每組設(shè)置6個(gè)平行孔。

1.5 基因芯片表達(dá)譜分析

照射組細(xì)胞照射后在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，之后取出，以離心半徑25 cm，1500 r/min，離心5min后棄上清。加入1ml體積的Trizol試劑，交由上?？党缮锕こ逃邢薰具M(jìn)行全基因組的基因芯片分析后，再進(jìn)行Gene Ontology（GO）聚類分析和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）信號(hào)通路分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

差異表達(dá)上調(diào)及下調(diào)3倍以上的參與代謝過程的基因帶入KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行信號(hào)通路分析，結(jié)果采用Fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因表達(dá)芯片散點(diǎn)圖

在基因表達(dá)芯片散點(diǎn)圖上，每個(gè)點(diǎn)代表1個(gè)基因探針，X軸表示對照組c-kit陽性細(xì)胞信號(hào)強(qiáng)度，Y軸表示照射組c-kit陽性細(xì)胞信號(hào)強(qiáng)度。散點(diǎn)圖中共有3條斜線，最上端的斜線代表上調(diào)超過2倍的差異基因，最下端的斜線代表下調(diào)超過2倍的差異基因，由圖1可見，電離輻射引起c-kit陽性細(xì)胞的許多基因的表達(dá)發(fā)生顯著改變。

2.2 電離輻射誘導(dǎo)與代謝過程相關(guān)的表達(dá)上調(diào)3倍以上的基因

GO聚類分析結(jié)果顯示，與對照組比較，照射組經(jīng)4 Gyγ射線照射后參與代謝過程（GO通路編號(hào)：0008152）的差異表達(dá)基因中，62個(gè)基因表達(dá)上調(diào)2倍以上，其中13個(gè)基因表達(dá)上調(diào)3倍以上（表1）。

圖1 c-kit陽性細(xì)胞基因表達(dá)譜芯片雜交信號(hào)散點(diǎn)圖Fig.1 Scatter plots for hybridization signals by gene expression in c-kitpositive cells

表1 4Gyγ射線照射后與代謝過程相關(guān)的表達(dá)上調(diào)3倍以上的基因Table1 Metabolic process related genesup-regulatedmore than 3 timesafter4Gyγ-ray irradiation

2.3 電離輻射誘導(dǎo)與代謝過程相關(guān)的表達(dá)下調(diào)3倍以上的基因

GO聚類分析結(jié)果顯示，與對照組比較，照射組經(jīng)4Gyγ射線照射后參與代謝過程（GO通路編號(hào)：0008152）的差異表達(dá)基因中，89個(gè)基因表達(dá)下調(diào)2倍以上，其中22個(gè)基因表達(dá)下調(diào)3倍以上（表2）。

2.4 電離輻射誘導(dǎo)的差異表達(dá)基因所在信號(hào)通路分析

將上述差異表達(dá)上調(diào)及下調(diào)3倍以上的參與代謝過程的基因帶入KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行信號(hào)通路分析（Fisher精確檢驗(yàn)，P＜0.05），涉及8條信號(hào)通路（表3）。

3 討論

電離輻射能夠引起骨髓HSC損傷，已有研究顯示，引起損傷的機(jī)制主要包括以下幾方面：①通過p53-p53 up-regulatedmodulatorofapoptosis（puma）途徑引起 HSC凋亡；②通過激活 Granulocyte colony-stimulating factor/Signal transducersand activators of transcription 3/basic leucine zipper transcription factor（G-CSF/Stat3/BATF）依賴的分化調(diào)控點(diǎn)促進(jìn)HSC分化；③通過 Reactive oxygen species-p38 mitogen-activated protein kinase（ROS-p38MAPK）途徑誘導(dǎo)HSC衰老；④HSC微環(huán)境損傷導(dǎo)致其損傷[7]。然而，應(yīng)用以上各種信號(hào)通路激活劑或抑制劑不能完全緩解電離輻射引起的HSC損傷，因此需要對電離輻射引起的其他信號(hào)通路變化進(jìn)行深入研究。細(xì)胞代謝是細(xì)胞生命活動(dòng)的重要形式之一，主要包括糖代謝、脂質(zhì)代謝、線粒體和三羧酸循環(huán)代謝、氧化還原代謝等代謝過程。成體干細(xì)胞通過代謝途徑及信號(hào)通路為自我更新與定向分化等功能提供能量，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞與周圍環(huán)境信號(hào)及營養(yǎng)信號(hào)的相互應(yīng)答，維持機(jī)體的生命活動(dòng)[8]。由于以往研究很少涉及到電離輻射后HSC代謝通路發(fā)生的變化，因此本研究利用高效基因芯片檢測技術(shù)，篩選出經(jīng)4Gyγ射線照射后的骨髓c-kit陽性細(xì)胞內(nèi)發(fā)生表達(dá)變化的參與代謝過程的相關(guān)基因，并分析這些基因參與的信號(hào)通路變化情況。0~10Gy的電離輻射主要引起造血系統(tǒng)損傷，低于3.5Gy的電離輻射主要引起成熟細(xì)胞及HPC等快速增殖細(xì)胞的損傷，當(dāng)骨髓細(xì)胞受到4Gyγ射線照射后，HSC及HPC均出現(xiàn)損傷[7]。因此選用4 Gyγ射線照射劑量才能同時(shí)反映出造血干祖細(xì)胞的損傷情況?；蛐酒夹g(shù)能夠同時(shí)、快速、準(zhǔn)確地分析數(shù)以千計(jì)的基因組信息，對所獲取的信息進(jìn)行分析后能夠得到表

達(dá)發(fā)生變化的基因以及信號(hào)通路的很多有意義的信息，縮短了基因篩選的時(shí)間，提高了效率，具有重要的意義。本研究提示，與對照組比較，照射組經(jīng)4Gyγ射線照射后差異表達(dá)基因共有6368個(gè)，差異表達(dá)2~3倍的上調(diào)基因比下調(diào)基因少740個(gè)，差異表達(dá)3倍以上的上調(diào)基因比下調(diào)基因少6個(gè)。經(jīng)4Gyγ射線照射后，參與代謝過程的62個(gè)基因表達(dá)上調(diào)2倍以上，其中13個(gè)基因表達(dá)上調(diào)3倍以上；89個(gè)基因表達(dá)下調(diào)2倍以上，其中22個(gè)基因表達(dá)下調(diào)3倍以上。將這些表達(dá)上調(diào)及下調(diào)3倍以上的基因進(jìn)行KEGG數(shù)據(jù)庫的信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)，表達(dá)上調(diào)3倍以上的基因Slc27a5參與到初級(jí)膽汁酸生物合成信號(hào)通路過程，表達(dá)下調(diào)3倍以上的基因Impdh1、Prim2、Dhodh、Dlat參與到嘌呤代謝、嘧啶代謝、三羧酸循環(huán)等代謝相關(guān)的信號(hào)通路，Nat10、Prim2、Dhodh基因參與到真核生物核糖體合成、DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)等細(xì)胞合成信號(hào)通路。說明受照射后的骨髓c-kit陽性細(xì)胞存在著代謝通路異常改變及DNA合成障礙。

表2 4Gyγ射線照射后與代謝過程相關(guān)的表達(dá)下調(diào)3倍以上的基因Table 2 Metabolic process related genes down-regulatedmore than 3 timesafter4Gyγ-ray irradiation

表3 差異表達(dá)基因的KEGG通路富集分析Table 3 KEGG pathway enrichment analysis of differentially expressed genes

綜上所述，電離輻射能夠引起很多代謝相關(guān)的基因及信號(hào)通路發(fā)生改變，本研究初步篩選出了這些尚未在輻射引起HSC損傷領(lǐng)域研究過的代謝相關(guān)基因，這一研究結(jié)果為探討輻射引起HSC代謝變化的機(jī)制提供了思路。基因表達(dá)譜芯片分析是一種高通量的分析方法，具有高效、快速地獲取大量基因表達(dá)變化信息的特點(diǎn)，在確定基因與基因間的相互關(guān)系，揭示疾病發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制研究中起到了重要作用。然而，由于雜質(zhì)、背景、實(shí)驗(yàn)操作等一系列人為因素的影響，確實(shí)會(huì)出現(xiàn)部分結(jié)果假陽性的現(xiàn)象?？梢酝ㄟ^增加平行樣本及實(shí)驗(yàn)次數(shù)盡量減少假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。針對出現(xiàn)的陽性結(jié)果，需要使用實(shí)時(shí)PCR及Western blot等方法進(jìn)行mRNA水平和蛋白水平的驗(yàn)證，才能最終確定電離輻射引起了哪些代謝相關(guān)基因的變化，這也是筆者目前正在進(jìn)行的一項(xiàng)重要工作。

［1］Zhang H,ZhaiZ,Wang Y,etal.Resveratrolameliorates ionizing irradiation-induced long-term hematopoietic stem cell injury inmice [J].FreeRadic BiolMed,2013,54：40-50.

［2］Ghesquiere B,Wong BW,Kuchnio A,etal.Metabolism of stromal and immune cells in health and disease[J].Nature,2014,511（758）：167-176.

［3］De Mas IM,Aguilar E,Jayaraman A,etal.Cancer cellmetabolism as new targets for novel designed therapies[J].Future Med Chem, 2014,6（16）：1791-1810.

［4］Yun JS,Ko SH.Avoiding or coping with severe hypoglycemia in patients with type 2 diabetes[J].Korean J Intern Med,2015,30（1）：6-16.

［5］Kushiyama A,Tanaka K,Hara S,et al.Linking uric acid metabolism to diabetic complications[J].World JDiabetes,2014,5（6）：787-795.

［6］Ema H,Morita Y,Yamazaki S,et al.Adultmouse hematopoietic stem cells：purification and single-cellassays[J].NatProtoc,2006, 1（6）：2979-2987.

［7］Shao L,Luo Y,Zhou D.Hematopoietic stem cell injury induced by ionizing radiation[J].Antioxid Redox Signal,2014,20（9）：1447-1462.

［8］Vacanti NM,Metallo CM.Exploringmetabolic pathways that contribute to the stem cell phenotype[J].Biochim Biophys Acta, 2013,1830（2）：2361-2369.

Expression changes of genes in c-kit positive cells after 4 Gyγ-ray irradiation：a gene chipanalysis

Zhang Junling,Lu Lu,LiDeguan,Meng Aimin.Tianjin Key Laboratory of Radiation Medicine and Molecular NuclearMedicine,Institute of Radiation Medicine,Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin 300192,China

Meng Aimin,Email：ai_min_meng@126.com

Objective To analyze themetabolic process-related genes and pathway variations in the c-kit（CD117,a cytokine receptorexpressed on the surface ofhematopoietic stem cells）positive cells after 4 Gy irradiation by using gene chip technology.Methodsc-kit positive cells were sorted by microbead separation system.Two groupswere involved：controlgroup and 4Gy irradiation group.A total of 1×106c-kit positive cells received 4 Gy irradiation ata dose rate of 0.99 Gy/min.After the two groups were cultured for 18 h,all the cellswere collected and detected by gene chip arrays.Datawere processed and analyzed via Gene Ontology and Kyoto Encyclopedia ofGenesand Genomes pathways.ResultsAfter 4 Gyγ-ray irradiation,13 metabolic process-related genes were up-regulated more than 3 times：Pld5, Neu2,Bpgm,Alas2,Satl1,Rdh16,Mccc1,Sat2,Smug1,Cml5,Adhfe1,Idh3a,and Slc27a5.Additionally, 22 genes were down-regulated more than 3 times：Acss2,Phgdh,Psat1,Glb1,Gpam,Dus3l,Fuca2, Impdh1,Dlat,Glb1,Enpp4,Prim2,Mettl10,Slc27a2,Dera,Qdpr,Dus1l,Cdyl2,Dhodh,Srr,Spr,and Mical2.These geneswere involved in pyrimidinemetabolism,purinemetabolism,and citrate cycle（TCA cycle）pathways.ConclusionMany variations of genesand pathways in c-kitpositive cellsexisted after 4Gy irradiation.However,further laboratory technology is required to confirm these variations.

2015-01-21）

10.3760/cma.j.issn.1673-4114.2015.02.003

國家自然科學(xué)基金海外合作基金項(xiàng)目（81129020）；國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（“973”項(xiàng)目）重大專項(xiàng)（2011CB964800-G）；國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81372928）；國家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（81402633）；協(xié)和青年基金資助和中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目（33320140033）

300192，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，天津市放射醫(yī)學(xué)與分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

孟愛民（Email：ai_min_meng@126.com）