HME、AS在胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義

盧 杰，石 海，程 芃，張楠楠，許建明，胡乃中

胃癌是目前世界上最常見(jiàn)的致死原因［1－2］，由于目前胃癌發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，早期無(wú)特異性的癥狀和體征，所以患者的就診率低，早期胃癌檢出率低，死亡率高。故胃癌早期診斷和預(yù)后判定是胃癌研究急需解決的問(wèn)題。人巨噬細(xì)胞金屬?gòu)椓γ?human macrophage metalloelastase，HME)是胃癌細(xì)胞穿透基底膜和腫瘤浸潤(rùn)組織必不可少的一種活性物質(zhì)，部分腫瘤細(xì)胞也具有分泌巨噬細(xì)胞金屬?gòu)椓γ傅淖饔?，HME能分解纖溶酶原生成血管抑素(gngiostatin，AS)，其能抑制腫瘤的微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，對(duì)早期胃癌診斷及預(yù)后評(píng)估有重要意義。該研究對(duì)HME和AS在胃癌組織中的表達(dá)進(jìn)行探討，并分析兩者在胃癌組織中表達(dá)的關(guān)聯(lián)性及其意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 收集2007年6月～2008年1月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理確診的30例胃癌患者病理蠟塊標(biāo)本和癌旁正常胃黏膜;胃癌組織和癌旁組織均再次由病理科醫(yī)師經(jīng)HE染色鏡檢確認(rèn)診斷結(jié)果?；颊咝g(shù)前均未接受放化療，術(shù)后均經(jīng)病理證實(shí)，同時(shí)患者未合并其他惡性腫瘤。30例癌旁正常胃黏膜組織均取自距胃癌組織切緣5 cm以外的正常胃黏膜組織。所有病例臨床及病理資料完整，見(jiàn)表1。

1.2 主要試劑 兔抗人Anti－Angiomotin多克隆抗體購(gòu)自美國(guó) Abcam公司;基質(zhì)金屬蛋白酶－12(MMP－12)兔抗人多克隆抗體、免疫組化試劑盒、DAB顯色液、檸檬酸鹽及PBS均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 采用免疫組化SP法對(duì)石蠟切片進(jìn)行染色，石蠟包埋組織切片(厚為3 μm)經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化;按要求進(jìn)行抗原修復(fù)后，滴加羊血清封閉抗原，滴加一抗、生物素標(biāo)記的二抗及鏈霉素親和素－過(guò)氧化物酶，DAB顯色，常規(guī)梯度酒精脫水、封片、拍照;所用HME抗體的濃度為1∶50;所用AS抗體的濃度為1∶100。

1.4 結(jié)果判定 HME染色陽(yáng)性位于細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞膜中呈棕黃色，顯色較強(qiáng)時(shí)呈棕褐色。AS染色陽(yáng)性位于胞質(zhì)中呈棕黃色，顯色強(qiáng)時(shí)呈棕褐色，光鏡下用高倍鏡視野對(duì)每例胃癌組織及癌旁組織切片區(qū)域連續(xù)計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，計(jì)算胃癌細(xì)胞所占的陽(yáng)性比例，其中無(wú)細(xì)胞被染色的為陰性(－)，細(xì)胞染色陽(yáng)性占比例＜10%為(+)，細(xì)胞染色陽(yáng)性比例占10% ～50%為)，細(xì)胞染色陽(yáng)性＞50%為()。為便于統(tǒng)計(jì)描述，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行分類，0～+為弱染，定為陰性表達(dá);()～()為強(qiáng)染，定為陽(yáng)性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料分布采用χ2檢驗(yàn)分析進(jìn)行比較，HME和AS表達(dá)的關(guān)聯(lián)性采用2×2列聯(lián)分析進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 胃癌和癌旁組織中HME、AS的表達(dá) 胃癌組織和癌旁組織各30例。HME在正常的胃黏膜組織中大多部分表達(dá)為陰性，少部分表達(dá)為陽(yáng)性;在胃癌組織中表達(dá)主要分布在細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞膜中，染色后呈棕黃色。在癌旁組織中HME陽(yáng)性率為10.0%(3/30)，胃癌組織中陽(yáng)性率為 66.7%(20/30);明顯高于在癌旁中的表達(dá)(χ2=20.376，P ＜0.05)，見(jiàn)表1、圖1。AS在正常胃黏膜中少部分表達(dá)為陽(yáng)性，多部分表達(dá)為陰性;在胃癌組織中的表達(dá)主要位于胞質(zhì)中，其染色陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色顆粒。在癌旁組織中AS陽(yáng)性率為16.7%(5/30);胃癌組織中陽(yáng)性率為73.3%(22/30);顯著高于在癌旁中的表達(dá)(χ2=19.461，P ＜0.05)，見(jiàn)表1、圖1。

2.2 HME和AS在胃癌組織中表達(dá)的關(guān)聯(lián)性分析

在30例胃癌組織HME和AS的聯(lián)合檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)同時(shí)為陽(yáng)性的為63.3%(19/30)，同時(shí)為陰性的為23.3%(7/30);在HME表達(dá)陽(yáng)性的例數(shù)中AS同時(shí)表達(dá)為陽(yáng)性率95%(19/20)，在AS表達(dá)陽(yáng)性的例數(shù)中HME同時(shí)表達(dá)為陽(yáng)性的為86.4%(19/22);HME和AS在胃癌組織中表達(dá)存在關(guān)聯(lián) (r=0.570，P＜0.05)，見(jiàn)表2。

2.3 HME和AS在胃癌中的表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 HME的陽(yáng)性表達(dá)與胃癌的分化程度、血管浸潤(rùn)有關(guān)(P＜0.05)，與其他臨床病理參數(shù)無(wú)顯著相關(guān)性;AS的陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤大小、浸潤(rùn)程度、血管浸潤(rùn)、淋巴及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05)，與其他臨床病理參數(shù)無(wú)顯著相關(guān)性，見(jiàn)表1。

表1 胃癌組織中HME和AS的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

表2 HME和AS在30例胃癌組織中的表達(dá)情況

3 討論

惡性腫瘤的發(fā)生和致死主要是因?yàn)槠淠芮忠u正常組織并向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，降解破壞細(xì)胞外基質(zhì)是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的必要條件，大部分細(xì)胞外基質(zhì)的破壞是由基質(zhì)彈性金屬蛋白酶完成的?；|(zhì)金屬蛋白酶家族(matrix metalloproteinases family，MMPs)是一種細(xì)胞外基質(zhì)膚鏈內(nèi)切酶，其催化活性依賴于酶活性中心與金屬鋅離子的結(jié)合［3］;MMPs最初都是以細(xì)胞分泌無(wú)活性的酶前體形式存在，只有當(dāng)被激活時(shí)才發(fā)揮其作用，能影響機(jī)體多種生理和病理過(guò)程，如癌癥、創(chuàng)傷愈合、胚胎發(fā)育、組織形成、炎性疾病等疾?。?］。研究［5］表明，很多惡性腫瘤存在 MMPs高表達(dá)，MMPs通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)從而促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［6－8］。

HME由活化的巨噬細(xì)胞分泌，是MMPs中的一員，又稱為MMP－12，能降解多種細(xì)胞外和非細(xì)胞外成分，彈性蛋白是其主要底物。一方面HME可以通過(guò)分解纖溶酶原和Ⅲ型、V型、X型膠原而產(chǎn)生血管抑素，抑制腫瘤血管生成、腫瘤的侵襲及生長(zhǎng);另一方面其還能分解細(xì)胞外基質(zhì)，如Ⅳ型膠原和纖維蛋白，以促進(jìn)血管生成，促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移［9］。研究［10］顯示，與其他MMP家族成員具有促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的作用不同，HME具有獨(dú)特的抗腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的作用。AS并不是直接由腫瘤細(xì)胞分泌，而是腫瘤細(xì)胞可以產(chǎn)生或激活某種蛋白酶，這種蛋白酶可將體內(nèi)的前體分解為血管生成抑制劑［11］。國(guó)外研究［12－14］顯示，HME 可分解纖溶酶原，從而促進(jìn)AS生成，抑制腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤浸潤(rùn)。HME在AS生成的過(guò)程中直接作為關(guān)鍵分子發(fā)揮作用，使得HME與腫瘤的關(guān)系備受關(guān)注。

前期的研究［15］顯示，人胃癌細(xì)胞能表達(dá)HME，并因此減少腫瘤微血管的形成;同時(shí)表明HME高表達(dá)與抑制胃癌的血管浸潤(rùn)及術(shù)后復(fù)發(fā)顯著相關(guān)，并可能減少淋巴管浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，提高患者術(shù)后生存率;HME的高表達(dá)可以降低腫瘤組織的血管密度，并與較好的預(yù)后有密切相關(guān)，對(duì)抑制腫瘤新生血管形成、抑制胃癌的進(jìn)一步發(fā)展及術(shù)后復(fù)發(fā)起著至關(guān)重要的作用，基于以上研究結(jié)果，設(shè)想HME抑制胃癌生長(zhǎng)可能與其影響腫瘤血管生成機(jī)制有關(guān)，本研究將在以往的工作基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討HME抑制胃癌生長(zhǎng)作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)顯示HME在胃癌組織中表達(dá)明顯高于正常的胃黏膜組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明HME蛋白過(guò)表達(dá)與胃癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有著密切的聯(lián)系，HME的陽(yáng)性表達(dá)與胃癌的分化程度、血管浸潤(rùn)有關(guān)，胃癌分化程度越高，HME表達(dá)的越高;有血管浸潤(rùn)組織的HME表達(dá)明顯低于無(wú)血管潤(rùn)的組織，與其他臨床病理參數(shù)無(wú)顯著相關(guān)性;AS在胃癌組織中表達(dá)明顯高于正常的胃黏膜組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明AS蛋白過(guò)表達(dá)也與胃癌的發(fā)生有著密切的聯(lián)系，AS的陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤的大小、浸潤(rùn)程度、血管浸潤(rùn)、淋巴及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，在腫瘤較大的組織中AS的表達(dá)低于腫瘤較小的組織，在腫瘤浸潤(rùn)程度較深，或者有血管浸潤(rùn)，淋巴及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的組織中陽(yáng)性表達(dá)低于腫瘤浸潤(rùn)程度淺，無(wú)血管浸潤(rùn)，淋巴及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的組織，與其他臨床病理參數(shù)無(wú)顯著相關(guān)性。通過(guò)對(duì)HME和AS在胃癌中表達(dá)的列聯(lián)分析表明HME和AS在胃癌組織表達(dá)存在相關(guān)性，說(shuō)明HME表達(dá)抑制胃癌生長(zhǎng)的機(jī)制可能是通過(guò)分解纖溶酶原生成AS所致，也為探討HME如何抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制提供了線索。以及進(jìn)一步研究胃癌生長(zhǎng)作用及其作用途徑，探討胃癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后機(jī)理、開(kāi)發(fā)判斷胃癌的早期診斷，分子靶向治療及預(yù)后等方面均具有重要意義。

［1］Hong L，Han Y，Liu J，et al.Fibroblast growth factor receptor 2:a therapeutic target in gastric cancer［J］.Expert Rev Gastroenterol Hepatol，2013，7(8):759 －65.

［2］Giordano A，Cito L.Advances in gastric cancer prevention［J］.World J Clin Oncol，2012，3(9):128 －36.

［3］Maréchal R，Demetter P，Nagy N，et al.High expression of CXCR4 may predict poor survival in resected pancreatic adenocarcinoma［J］.Br J Cancer，2009，100(9):1444 －51.

［4］Valdivia A，Peralta R，Matute－González M，et al.Co－expression of metalloproteinases 11 and 12 in cervical scrapes cells from cervical precursor lesions［J］.Int J Clin Exp Pathol，2011，4(7):674－82.

［5］Engers R，Gabbert H E.Mechanisms of tumor metastasis:cell biological aspects and clinical implications［J］.J Cancer Res Clin Oncol，2000，126(12):682 －92.

［6］Hagemann T，Gunawan B，Schulz M，et al.mRNA expression of matrix metalloproteases and their inhibitors differs in subtypes of renal cell carcinomas［J］.Eur J Cancer，2001，37(15):1839 －46.

［7］Kerkel? E，Ala－aho R，Klemi P，et al.Metalloelastase(MMP－12)expression by tumour cells in squamous cell carcinoma of the vulva correlates with invasiveness，while that by macrophages predicts better outcome［J］.J Pathol，2002，198(2):258 －69.

［8］Hofmann H S，Hansen G，Richter G，et al.Matrix metalloproteinase－12 expression correlates with local recurrence and metastatic disease in non－small cell lung cancer patients［J］.Clin Cancer Res，2005，11(3):1086 －92.

［9］Bradbury P A，Zhai R，Hopkins J，et al.Matrix metalloproteinase 1，3 and 12 polymorphisms and esophageal adenocarcinoma risk and prognosis［J］.Carcinogenesis，2009，30(5):793 －8.

［10］Fan J，Wang X，Wu L，et al.Macrophage－specific overexpression of human matrix metalloproteinase－12 in transgenic rabbits［J］.Transgenic Res，2004 13(3):261 －9.

［11］Houghton A M，Grisolano J L，Baumann M L，et al.Macrophage elastase(matrix metalloproteinase－12)suppresses growth of lung metastases［J］.Cancer Res，2006，66(12):6149 －55.

［12］O'Reilly M S，Holmgren L，Shing Y，et al.Angiostatin:a novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma［J］.Cell，1994，79(2):315 － 28.

［13］Cornelius L A，Nehring L C，Harding E，et al.Matrix metalloproteinases generate angiostatin:effects on neovascularization［J］.J Immunol，1998，161(12):6845 －52.

［14］Dong Z，Kumar R，Yang X，et al.Macrophage－derived metalloelastase is responsible for the generation of angiostatin in Lewis lung carcinoma［J］.Cell，1997，88(6):801 －10.

［15］Cheng P，Jiang F H，Zhao L M，et al.Human macrophage metalloelastase correlates with angiogenesis and prognosis of gastric carcinoma［J］.Dig Dis Sci，2010，55(11):3138 －46.