氧化應(yīng)激激活JNK-MAPK參與波動(dòng)性高血糖誘導(dǎo)的大鼠肝細(xì)胞損傷*

李素娟，金可可，趙亞萍，王　鵬，趙文璽，高凱旋，楊文娟，王加林，吳德平△(中國人民解放軍第八十二醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇淮安300;溫州醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，浙江溫州35035)

氧化應(yīng)激激活JNK-MAPK參與波動(dòng)性高血糖誘導(dǎo)的大鼠肝細(xì)胞損傷*

李素娟1，金可可2，趙亞萍1，王鵬1，趙文璽1，高凱旋1，楊文娟1，王加林1，吳德平1△
(1中國人民解放軍第八十二醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇淮安223001;2溫州醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，浙江溫州325035)

［摘要］目的:探討波動(dòng)性高血糖引起糖尿病大鼠肝細(xì)胞凋亡的機(jī)制。方法: SD大鼠隨機(jī)均分為4組:正常對(duì)照組、穩(wěn)定高血糖組、波動(dòng)高血糖組和胰島素組。采用鏈脲佐菌素65 mg/kg腹腔注射誘發(fā)糖尿病，波動(dòng)高血糖組每天定時(shí)腹腔注射速效胰島素，并錯(cuò)時(shí)給予葡萄糖，造成1 d中血糖濃度大幅度波動(dòng)，12周內(nèi)波動(dòng)高血糖組每天血糖波動(dòng)模式相似，且HbA1c與穩(wěn)定高血糖組無顯著差異。12周后取血和肝臟組織，采用比色法檢測(cè)超氧化物歧化酶( SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶( GSH-Px)活性以及丙二醛( MDA)和一氧化氮( NO)含量，RT-PCR和Western blot檢測(cè)JNK、p-JNK、Bax和Bcl-2的含量。結(jié)果:與正常對(duì)照組比較，穩(wěn)定高血糖組、胰島素組和波動(dòng)高血糖組的食物量、飲水量和尿量增加，肝功能異常; MDA含量增多，SOD和GSH-Px活性降低，NO含量減少( P＜0. 05) ; JNK mRNA、p-JNK蛋白及Bax蛋白水平上調(diào)( P＜0. 05)，Bcl-2表達(dá)減少( P＜0. 01) ;且波動(dòng)高血糖組的以上變化均較穩(wěn)定高血糖和胰島素組更加明顯( P＜0. 05)。結(jié)論:波動(dòng)性高血糖較穩(wěn)定性高血糖更促進(jìn)糖尿病肝細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制與JNK-MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］肝細(xì)胞;血糖波動(dòng);氧化應(yīng)激; JNK-MAPK信號(hào)通路

慢性持續(xù)高血糖和波動(dòng)性高血糖對(duì)糖尿病的預(yù)后及慢性并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)［1］，而且糖尿病患者血糖波動(dòng)越大，慢性并發(fā)癥的發(fā)生率越高、預(yù)后就越差。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠明顯血糖波動(dòng)可加速腎小管上皮細(xì)胞凋亡［2-5］。研究表明，急性血糖波動(dòng)要比持續(xù)的高血糖狀態(tài)更能促進(jìn)氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，與JNK-MAPK通路密切相關(guān)［6-7］。因此，本研究旨在觀察氧化應(yīng)激和JNKMAPK在波動(dòng)性高糖誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡中的作用，以探討波動(dòng)性高糖比穩(wěn)定性高糖引起更嚴(yán)重的肝細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

材料和方法

1動(dòng)物

SPF級(jí)雄性Sprague-Dawley( SD)大鼠30只，體重( body weight，BW) 180～220 g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)為SYXK(浙2010-0150)。

2主要試劑

鏈脲菌素( streptozotocin，STZ)及枸櫞酸鈉分析純購于Sigma;葡萄糖購于天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司;普通速效胰島素購于江蘇萬邦生化有限公司;強(qiáng)生穩(wěn)步倍加血糖儀及配套的試紙購于Johnson;丙二醛( malondialdehyde，MDA)測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶( superoxide dismutase，SOD)試劑盒及谷胱甘肽過氧化物酶( glutathione peroxidase，GSH-Px)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;兔抗大鼠JNK、磷酸化JNK、Bax、Bcl-2和內(nèi)參照GAPDH多克隆抗體均購自CST; TRIzol試劑購自Invitrogen;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自MBI。

3主要方法

3.1動(dòng)物模型制備及分組依據(jù)參考文獻(xiàn)方法建立糖尿病模型［8-9］，本實(shí)驗(yàn)雄性SD大鼠24只隨機(jī)均分為4組，每組8只:正常對(duì)照( normal control，N)組，穩(wěn)定性高血糖( stable high blood glucose，S)組，波動(dòng)性高血糖( fluctuant high blood glucose，F(xiàn))組，胰島素( insulin，I)組，S、F和I組均一次性腹腔內(nèi)注射STZ 65 mg/kg，N組給予同劑量的枸櫞酸鈉緩沖液。72 h后，尾部取血，測(cè)空腹血糖和刺激大鼠膀胱測(cè)尿糖，如果血糖＞16. 7 mmol/L、尿糖+ + +，則造模成功; F組每天3次腹部皮下注射胰島素20 U/kg，第1次注射時(shí)間是每天7: 30，第2次注射時(shí)間是每天11 ∶:30，第3次注射時(shí)間是每天15: 30;并每天3次腹腔注射葡萄糖2. 5 g/kg，第1次注射時(shí)間是每天10: 00，第2次注射時(shí)間是每天14: 00，第3次注射時(shí)間是每天18: 00，造成血糖波動(dòng)模型。F組大鼠每天給予胰島素時(shí)，I組給予同等劑量的胰島素，其它組給予等劑量的生理鹽水，F(xiàn)組給予葡萄糖時(shí)，N組、S組和F組均給予等劑量的生理鹽水。F組12周內(nèi)每天血糖波動(dòng)模式相似，且糖化血紅蛋白( glycosylated hemoglobin A1c，HbA1c)與S組無顯著差異，則說明波動(dòng)性高血糖造模成功。12周后腹主動(dòng)脈取血，用于生化指標(biāo)檢測(cè)，取肝臟用于肝臟指數(shù)測(cè)定，并觀察肝臟組織JNK-MAPK蛋白和mRNA的表達(dá)。

3.2一般情況記錄大鼠體質(zhì)量、飲水量、食物量和尿量。

3.3生化指標(biāo)的檢測(cè)采用Johnson穩(wěn)步倍加血糖儀測(cè)定血糖，親和層析-高效液相色譜法( HPLC)測(cè)定HbA1c的含量;采用雅培C8000生化分析儀檢測(cè)白蛋白( albumin，ALB)、白蛋白與球蛋白比值(白球比)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶( aspartate aminotransferase，AST)和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶( alanine aminotransferase，ALT)。

3.4肝指數(shù)的測(cè)定取出整個(gè)肝臟，濾紙吸干血跡后電子天平秤重得肝濕重，肝濕重與體重的比為肝指數(shù)。

3.5氧化應(yīng)激指標(biāo)的測(cè)定取肝臟組織均漿，化學(xué)比色法測(cè)定SOD和GSH-Px活性及MDA和NO含量，操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

3.6肝臟形態(tài)學(xué)的觀察取肝臟組織用4%多聚甲醛-PBS緩沖液固定，常規(guī)石蠟制片(厚度5 μm)，HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。另取肝臟組織行超微結(jié)構(gòu)觀察，用冷刀片取肝臟( 0. 5～1) mm×1 mm ×1 mm大小的組織塊，迅速用2. 5%的冷戊二醛溶液固定。經(jīng)過1% OsO4后固定、梯度丙酮脫水、環(huán)氧樹脂浸透、包埋、切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，透射電鏡下觀察。

3.7Western blot檢測(cè)蛋白含量取肝臟組織( 100 mg)剪碎轉(zhuǎn)移至玻璃勻漿器中，加入含PMSF的裂解液1 mL，勻漿以充分裂解腎組織，12 000×g離心，取上清用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。取100 μg蛋白上樣于12%聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1. 5 h，分別加入1∶1 000稀釋的抗兔多克隆抗體p-JNK、JNK、Bax、Bcl-2和GAPDH抗體，4℃靜置孵育過夜，TBST洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔II抗( 1∶3 000)，室溫孵育1. 5 h，膜于化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑反應(yīng)5 min，暗室中用X膠片感光、顯影1 min、定影15 min。掃描各種樣品的蛋白條帶的吸光度( A)，并分別算出與正常對(duì)照組A值的比值，以求出其活化倍數(shù)。

3.8RT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)各取約60～100 μg肝臟組織，采用Trizol試劑盒提取總RNA，再使用分光光度計(jì)在260/280 nm處檢測(cè)總RNA的質(zhì)量和純度之后，使用cDNA合成試劑盒將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，cDNA采用相應(yīng)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物由Invitrogen上海合成分部合成。PCR引物序列如下: JNK的上游引物為5’-AAC GAC CTT CTA CGA CGA TG-3’，下游引物為5’-GCA GCG TAT TCT GGC TAT GC-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物為367 bp［10-11］;β-actin的上游引物為5’-GAG ACC TTC AAC ACC CCA GCC-3’，下游引物為5’-TCG GGG GAT CGG AAC CGC TCA-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物為400 bp。行JNK和β-actin共擴(kuò)增，PCR反應(yīng)過程參數(shù)如下: 94℃5 min; 98℃10 s，54℃20 s，72℃50 s，共32個(gè)循環(huán)。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物8 μL，在20 g/L瓊脂糖凝膠上電泳45 min，圖像分析儀采集圖像，以內(nèi)參照β-actin為基準(zhǔn)，作半定量分析。目的基因相對(duì)表達(dá)量為目的基因條帶光密度與內(nèi)參照基因條帶光密度的比值。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析( one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法( LSD)法，以P＜0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1各組大鼠的體重及造模成功率

N組大鼠體型適中，精神狀況良好，動(dòng)作自如，反應(yīng)靈敏，毛發(fā)平伏有光澤，12周末各組大鼠的體重為( 521. 67±44. 71) g，造模成功率為100%。S組、I組和F組大鼠消瘦，精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，毛豎無光澤，動(dòng)作遲緩，弓背蜷體。S組體重為( 361. 00± 106. 68) g，造模成功率為80%; I組體重為( 341. 00± 65. 70) g，造模成功率為70%; F組體重為( 254. 17± 67. 69) g，造模成功率為60%。

2各組大鼠血糖濃度及HbA1c的范圍

N組血糖為5.40～6.25 mmol/L，S組為19.15～23.65 mmol/L，F(xiàn)組為6.17～30.33 mmol/L，I組血糖為12.17～23.83 mmol/L;波動(dòng)性高血糖組大鼠1 d中的血糖濃度出現(xiàn)明顯的波動(dòng)，穩(wěn)定性高血糖組大鼠1 d中的血糖濃度基本處于高水平狀態(tài)。HbA1c在N組為( 5.10 ±0.32) %，S組為( 10.50±0.69) %，F(xiàn)組為( 10.13± 0.96) %，I組為( 10.30±0.56) %，S組與F組比較無顯著差異( P＞0.05)，見圖1。

Figure 1.Blood glucose variation curve of different groups.Mean ±SD.n = 8.＊＊P＜0. 01 vs N group;#P＜0. 05，##P＜0. 01 vs S group;P＜0.05，P＜0.01 vs F group.圖1　各組大鼠血糖濃度的變化曲線

34組大鼠飲食量、飲水量、尿量每日的變化情況

與N組比較，S組、F組和I組的飲食量、飲水量、尿量的每日變化都明顯增加( P＜0. 05)，與S組比較，F(xiàn)組的變化最明顯( P＜0. 05)，見表1～3。

表1　各組大鼠飲食量的變化Table 1.The changes of the food intake in the rats with different treatments ( g·g－1·d－1.Mean±SD.n =8)

表2　各組大鼠飲水量的變化Table 2.The changes of the drinking volume in the rats with different treatments ( ml·g－1·d－1.Mean±SD.n =8)

表3　各組大鼠尿量的變化Table 3.The volumes of the urinary output in the rats with different treatments ( ml·g·－1·d－1.Mean±SD.n =8)

44組大鼠生化指標(biāo)及肝臟指數(shù)的的比較

與N組比較，S組、F組和I組的ALT、AST、 ALB、白球比及肝臟指數(shù)增高;與S組比較，F(xiàn)組和I組的數(shù)值較高，見表4。

表4　各組大鼠ALT、AST、ALB、白球比和肝臟指數(shù)的比較Table 4.The changes of ALT，AST，ALB，A/G and liver function in the rats with different treatments ( Mean±SD.n =8)

5波動(dòng)性高血糖對(duì)肝臟組織氧化應(yīng)激的影響

與N組比較，其它各組的SOD和GSH-Px活性及NO含量明顯降低，且F組更低于S組和I組( P＜ 0. 05) ; S組、F組和I組的MDA含量明顯升高，且F組高于S組和I組( P＜0. 05)，見表5。

表5　波動(dòng)性高血糖對(duì)肝臟組織SOD和GSH-Px活性以及MDA和NO含量的影響Table 5.The effects of glucose fluctuation on SOD and GSH-Px activity，and MDA and NO content in the liver of the rats with different treatments ( Mean±SD.n =8)

6各組大鼠肝臟形態(tài)觀察

HE染色光鏡(×40)觀察可見N組大鼠肝臟切片的肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完整，肝索排列整齊，肝細(xì)胞呈多邊形，胞漿豐富，核圓位于中央，肝細(xì)胞內(nèi)無脂肪空泡; F組大鼠肝板結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞排列紊亂、增大、核大小不等，細(xì)胞內(nèi)有明顯脂肪變性，胞漿內(nèi)可見大小不等、數(shù)量不一的脂肪空泡，有的較小為脂滴樣散布于核周，有的較大位于整個(gè)胞漿，嚴(yán)重者胞核被脂滴擠向一側(cè)，成印戒樣改變; S組和I組雖然也存在空泡和炎癥細(xì)胞，但較N組明顯減少，見圖2。

透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)可見N組的肝細(xì)胞核規(guī)則，線粒體有完整的膜和嵴，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列整齊; S組和I組的肝細(xì)胞核不規(guī)則，線粒體模糊，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增生，破裂，毛細(xì)膽管擴(kuò)張有淤膽現(xiàn)象，少量的儲(chǔ)脂細(xì)胞，有少量的顆粒沉積; F組肝細(xì)胞核不規(guī)則，線粒體腫脹、結(jié)構(gòu)不清，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富、脫顆粒，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，毛細(xì)膽管明顯擴(kuò)張，管壁增粗，腔內(nèi)可見非定形物質(zhì)，儲(chǔ)脂細(xì)胞明顯增生，脂質(zhì)顆粒沉積，毛細(xì)膽管增生，結(jié)構(gòu)紊亂，見圖2。

7波動(dòng)性高血糖對(duì)糖尿病大鼠臟臟Bcl-2和Bax表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果表明，與N組比較，各組大鼠肝臟組織Bax蛋白的表達(dá)水平上調(diào)( P＜0. 01)，Bcl-2蛋白下降( P＜0. 01)，其中，F(xiàn)組比S組表達(dá)明顯( P＜0. 05)，見圖3。

Figure 3.The protein levels of Bax and Bcl-2 in rat liver tissues detected by Western blot.Mean±SD.n = 8.*P＜0. 05 vs N group;#P＜0. 05，##P＜0. 01 vs S group;P＜0. 05，P＜0. 01 vs F group.圖3　Western blot檢測(cè)大鼠肝臟組織中Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)

8波動(dòng)性高血糖對(duì)糖尿病大鼠肝臟p-JNK蛋白水平的影響

與N組比較，各組大鼠肝臟組織p-JNK蛋白水平上調(diào)( P＜0. 01)，其中F組高于S組( P＜0. 05)，比I組高( P＜0. 01)，見圖4。

9波動(dòng)性高血糖對(duì)糖尿病大鼠肝臟JNK mRNA表達(dá)的影響

與N組比較，各組大鼠肝臟組織JNK mRNA表達(dá)均上調(diào)( P＜0. 01)，其中F組高于S組( P＜0. 05)，比I組高( P＜0. 01)，見圖5。

Figure 4.The protein level of p-JNK in rat liver tissues detected by Western blot.Mean±SD.n =8.*P＜0. 05，＊＊P ＜0. 01 vs N group;#P＜0. 05，##P＜0. 01 vs S group;P＜0. 05 vs F group.圖4　Western blot檢測(cè)大鼠肝臟組織p-JNK蛋白的表達(dá)

Figure 5.The mRNA expression of JNK in the rat liver tissues.Mean±SD.n = 8.*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs N group;#P＜0. 05 vs S group;P＜0. 01 vs F group.圖5　肝臟組織JNK mRNA的表達(dá)

討論

近年來研究表明，在HbA1c水平相同的情況下，血糖波動(dòng)較大者慢性并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)大大增加［12］，且由于胰島B細(xì)胞功能障礙，胰島素抵抗，飲食控制不佳，用藥的不合理等各種因素的存在，臨床上糖尿病患者的血糖波動(dòng)往往較大［13］;故本研究采用臨床實(shí)際的波動(dòng)性高血糖大鼠模型與穩(wěn)定性高血糖進(jìn)行對(duì)比，以期進(jìn)一步深入探討糖尿病肝病的發(fā)病機(jī)制。在動(dòng)物模型中，各組造模成功率不同，特別是波動(dòng)性高血糖組造模成功率僅為60%，其它組在80～100%之間，對(duì)于造模成功率低的原因，分析主要為低血糖造成的昏迷死亡，高血糖、感染等影響因素也會(huì)導(dǎo)致死亡。在造模成功的大鼠中，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠12周病程時(shí)出現(xiàn)了肝功能損害，同時(shí)伴有氧化應(yīng)激水平升高。而最近發(fā)現(xiàn)糖尿病發(fā)生的急性血糖波動(dòng)是觸發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)的一個(gè)額外因素［14］，即血糖波動(dòng)更容易引發(fā)氧化應(yīng)激［15］。氧化應(yīng)激在糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展過程中有著重要的作用［16-17］。本研究發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定性高血糖、波動(dòng)性高血糖誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡過程中均伴有SOD和GSH-Px活性及NO含量降低，MDA含量增加，且波動(dòng)性高血糖組的上述改變更加明顯，說明波動(dòng)性高血糖引發(fā)的肝細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)較穩(wěn)定性高血糖增強(qiáng)。

體外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)，氧化應(yīng)激能導(dǎo)致JNK激活，JNK又是細(xì)胞凋亡發(fā)生過程中的重要調(diào)控者。一般認(rèn)為，JNK被磷酸化激活后，能通過轉(zhuǎn)錄依賴或轉(zhuǎn)錄非依賴機(jī)制調(diào)控下游靶基因的表達(dá)或靶蛋白的活性而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，JNK激活后可從胞質(zhì)中轉(zhuǎn)位入核，通過磷酸化激活c-Jun、c-Fos等轉(zhuǎn)錄因子而調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。活化的JNK也可留在胞質(zhì)內(nèi)，催化Bcl-2家族的激活，調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組比較，穩(wěn)定高血糖組、胰島素組和波動(dòng)高血糖組肝臟JNK mRNA上調(diào)，p-JNK蛋白水平上調(diào)，Bax蛋白表達(dá)升高，Bcl-2蛋白下降。波動(dòng)組的變化更明顯。本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病持續(xù)性高血糖組和波動(dòng)性高血糖組肝臟組織中JNK蛋白的磷酸化水平均明顯高于正常對(duì)照組，且波動(dòng)性高血糖組較持續(xù)性高血糖組變化更為明顯，這與其氧化應(yīng)激水平和凋亡程度增加的趨勢(shì)一致，提示血糖波動(dòng)可能作為一種刺激信號(hào)，會(huì)引發(fā)較單純高血糖更加嚴(yán)重的氧化應(yīng)激反應(yīng)，通過激活JNK，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

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Oxidative stress-activated JNK-MAPK signaling pathway is involved in fluctuant high glucose-induced injury of hepatocytes

LI Su-juan1，JIN Ke-ke2，ZHAO Ya-ping1，WANG Peng1，ZHAO Wen-xi1，GAO Kaixuan1，YANG Wen-juan1，WANG Jia-lin1，WU De-ping1
(1Department of Endocrinology，The 82nd Hospital of PLA，Huaian 223001，China;2Department of Pathophysiology，Wenzhou Medical University，Wenzhou 325035，China.E-mail: 13952329182@139.com)

［ABSTRACT］AIM: To explore the mechanisms of fluctuant high blood glucose-induced apoptosis of hepatocytes.METHODS: SD rats were randomly divided into normal control group ( N)，stable high blood glucose group ( S)，fluctuant high blood glucose group ( F) and insulin group ( I).Diabetic rats were induced by intraperitoneal injection of streptozotocin ( 65 mg/kg)，and the fluctuant high blood glucose animal model was induced by intraperitoneal injection of ordinary insulin and glucose at different time points every day.The blood glucose fluctuation patterns of the animals in F group within 12 weeks were similar every day and no significant difference of the HbA1c concentration was observed compared with S group，indicating that the fluctuant hyperglycemia was successfully established in F group.The activity of superoxide dismutase ( SOD) and glutathione peroxidase ( GSH-Px)，and the content of malondialdehyde ( MDA) and nitric oxide ( NO) in the homogenate of the liver tissues were detected by colorimetry.The mRNA and protein levels of JNK，p-JNK，Bax and Bcl-2 were examined by RT-PCR and Western blot.RESULTS: After 12 weeks，the increases in the intakes of food and water，the urine output，and the abnormal liver function were observed in S group，I group and F group.Compared with N group，the MDA level was increased，the content of NO and the activity of SOD and GSH-Px were decreased，and up-regulation of JNK mRNA and p-JNK and Bax proteins，and down-regulation of Bcl-2 were also found in S group，I group and F group.The above effects were more obviously showed in F group.CONCLUSION: Oxidative stress activates JNK-MAPK signaling pathway，which is involved in fluctuant high glucose-induced apoptosis of hepatocytes.

［KEY WORDS］Hepatocytes; Blood glucose fluctuation; Oxidative stress; JNK-MAPK signaling pathway

通訊作者△Tel: 0517-83568807; E-mail: 13952329182@139.com

*［基金項(xiàng)目］浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目( No.Y207495) ;南京軍區(qū)科技創(chuàng)新課題項(xiàng)目( No.12MA026) ;淮安市內(nèi)分泌代謝性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)持續(xù)支持項(xiàng)目( No.HAP201273)

［收稿日期］2015-01-08［修回日期］2015-04-09

［文章編號(hào)］1000-4718( 2015)07-1259-07

［中圖分類號(hào)］R587. 1; R363

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.019