應(yīng)用噬菌體展示肽庫技術(shù)淘選大鼠CCR5膜外第一、二胞外環(huán)特異性結(jié)合的活性拮抗肽與初步鑒定*

劉思雪，胡　梅，葉小研，黃花榮，鐘英強(qiáng)(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院消化內(nèi)科，兒科，廣東廣州500;廣東藥學(xué)院附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東廣州50080)

應(yīng)用噬菌體展示肽庫技術(shù)淘選大鼠CCR5膜外第一、二胞外環(huán)特異性結(jié)合的活性拮抗肽與初步鑒定*

劉思雪1▲，胡梅1▲，葉小研1，3，黃花榮2△，鐘英強(qiáng)1△
(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院1消化內(nèi)科，2兒科，廣東廣州510120;3廣東藥學(xué)院附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東廣州510080)

［摘要］目的:利用噬菌體展示肽庫技術(shù)淘選與大鼠CC趨化因子受體5( CCR5)膜外第一、二胞外環(huán)特異性結(jié)合的短肽，并鑒定其與CCR5的結(jié)合能力。方法:在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中查得大鼠CCR5第一、二胞外環(huán)的氨基酸序列，合成相應(yīng)的線性短肽作為淘選的靶分子，利用噬菌體展示7肽文庫進(jìn)行3～4輪淘選，用ELISA法鑒定所選肽與靶分子的結(jié)合，并測定其與濃度的關(guān)系。結(jié)果:與CCR5第一、二胞外環(huán)特異性結(jié)合的噬菌體展示的短肽序列分別為GHWKVWL和HYIDFRW，ELISA鑒定呈陽性反應(yīng)，且短肽與靶分子的結(jié)合具有濃度依賴性和可飽和性。結(jié)論:利用噬菌體展示技術(shù)成功獲得了2條CCR5特異性結(jié)合的短肽，并在體外證明其可與CCR5第一、二胞外環(huán)具有結(jié)合能力。

［關(guān)鍵詞］CC趨化因子受體5;拮抗肽;噬菌體展示

▲并列第1作者

CC趨化因子受體5( CC chemokine receptor 5，CCR5)是趨化因子受體超家族的重要成員之一，屬于G蛋白偶聯(lián)受體，具有典型的7次跨膜區(qū)段( transmembrane region)和3個胞外環(huán)( extracellular loop，ECL)及3個胞內(nèi)環(huán)( intracellular loop，ICL)，其胞外部分可與配體結(jié)合而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)［1］。CCR5主要分布于炎癥細(xì)胞表面，如淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等，參與炎癥細(xì)胞在體內(nèi)的趨化性遷移，在炎癥性腸病( inflammatory bowel disease，IBD)的免疫炎癥反應(yīng)中起重要作用，其可能為IBD治療的新靶點(diǎn)［2］，而針對CCR5的各類拮抗劑可用于人類多種自身免疫性疾病、器官移植后排斥反應(yīng)和艾滋病等的治療，具有廣闊的應(yīng)用前景。我們擬應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)淘選能與大鼠CCR5第一、二胞外環(huán)特異性結(jié)合的活性拮抗短肽，并在體外對其結(jié)合能力作了初步鑒定。

材料和方法

1主要材料和試劑

噬菌體表面展示肽庫試劑盒Ph.D.TM-7(隨機(jī)7肽庫)購自New England BioLabs，庫容1×1016pfu/L，宿主菌E.coli ER2738，-96 gⅢ測序引物5’-OHCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’。辣根過氧化物酶( horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的抗M13單克隆抗體( HRP/anti-M13)購自GE Healthcare。HRP底物2，2-聯(lián)氮-二( 3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽［2，2-azino-bis( 3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt，ABTS］購自Sigma。大鼠CCR5第一、二胞外環(huán)( ECL1、ECL2)的氨基酸序列在OWL蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中查得，ECL1為AANEW VFGNI MCK ( 13 aa)，ECL2為MRSQK EGSHY TCSPH FLHIQ YRFWK HFQTL KM ( 32 aa)，交由中國上海吉爾生化有限公司合成，純度為95%。異丙基-β-D-硫代半乳糖苷( isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG) 和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷( 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside，X-Gal)即用型溶液購自AMRESCO。

2方法

2.1親和淘選分別將ECL1和ECL2凍干粉溶于0.1 mmol/L pH 8.6的NaHCO3溶液，ECL1用1%二甲基亞砜( dimethylsulfoxide，DMSO)助溶，制備100 μg/L的靶分子溶液包被6孔板，每孔0.5 mL，在增濕容器中4℃輕微振蕩，孵育過夜。第2天倒掉包被液，加滿封閉液( 1 mol/L pH 8.6 NaHCO3+5 g/L BSA)，4℃作用1 h。去除封閉液，用TBST緩沖液快速洗板6次。用350 μL的TBST緩沖液稀釋2 ×1011pfu的噬菌體，加到已包被好的孔中，室溫溫和搖動60 min。TBST緩沖液洗板10次，加入非特異性緩沖液( 0.2 mol/L pH 2.2的glycine-HCl +1 g/L BSA) 350 μL，室溫作用15 min，將洗脫液吸入另一干凈微量離心管中，用50 μL 1 mol/L Tris-HCl( pH 9.1)中和上述洗脫液。取1 μL測定洗脫物的滴度。剩余洗脫物加入20 mL ER2738培養(yǎng)物中(菌體應(yīng)處于對數(shù)前期，A600=0. 01～0. 05)，37℃劇烈搖動培養(yǎng)4. 5 h。將擴(kuò)增培養(yǎng)物經(jīng)聚乙二醇( polyethylene glycol，PEG) /NaCl兩次濃縮純化后得到噬菌體擴(kuò)增液，測定其滴度后可進(jìn)行下一輪淘選。如此共進(jìn)行3輪淘選，若第3輪淘選后沒有明顯的共有序列發(fā)現(xiàn)，按說明書要求繼續(xù)擴(kuò)增進(jìn)行第4輪淘選。其后的淘選中噬菌體投入量均為2×1011pfu，TBST洗滌濃度增至0.5%。

2.2噬菌體滴度測定接種ER2738單菌落于10 mL LB培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)5 h至對數(shù)中期( A600≈0. 5)。用LB系列稀釋噬菌體，淘選洗脫物稀釋度為101～104;擴(kuò)增后為108～1011。取10 μL稀釋的噬菌體與200 μL菌液混勻，37℃放置5 min，再將上述混合液與3 mL 45℃預(yù)熱的頂層瓊脂( LB培養(yǎng)基+7 g/L瓊脂粉+1g/L MgCl2·6H2O)混勻，立即平鋪于37℃預(yù)溫的LB/IPTG/X-Gal平板( LB培養(yǎng)基+15 g/L瓊脂粉，高壓滅菌，冷卻至70℃時加入1 mL IPTG/X-Gal即用型溶液)上，冷卻后倒置于37℃細(xì)菌培養(yǎng)箱中過夜。第2天檢查平板，計數(shù)有約100個藍(lán)色噬菌斑的平板上的斑數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)即為每10 μL噬菌體的滴度。

2.3噬菌斑擴(kuò)增測序挑一ER2738單克隆于LBTet培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，將過夜培養(yǎng)物按1∶100稀釋接種于LB培養(yǎng)基，分1 mL到每一個培養(yǎng)管中。在第3輪淘選洗脫物滴度測定的平板中，在總量不到100個噬菌斑的平板上隨機(jī)挑取15個克隆，分別接種到培養(yǎng)管中。37℃搖床培養(yǎng)4.5 h。14 000 r/min離心30 s，上清液轉(zhuǎn)入新鮮離心管中，再離心，取80%的上清到另一離心管，即為擴(kuò)增的噬菌體貯液。取200 μL由中國北京金唯智生物科技有限公司完成測序，測序成功的標(biāo)準(zhǔn):讀取序列長度大于800 bp，背景峰高度不高過主峰的1/3。

2.4ELISA鑒定陽性噬菌體克隆將過夜培養(yǎng)的ER2738按1∶100稀釋于20 mL LB培養(yǎng)基，于每管加入5 μL測序剩余的噬菌體上清，37℃通氣培養(yǎng)4.5 h，PEG/NaCl兩次濃縮純化后得到噬菌體擴(kuò)增液。測定噬菌體滴度。制備100 mg/L的ECL1、ECL2靶分子溶液(方法同淘選步驟)包被96孔酶標(biāo)板，150 μL/孔，每個待鑒定克隆1個包被孔及1個空白對照孔，4℃孵育過夜。第2天去除殘液，加滿封閉液4℃作用1.5 h。甩出封閉液，TBST洗板6次。包被孔和空白對照孔各加入5 μL噬菌體擴(kuò)增液，0.5% TBST稀釋至100 μL，室溫振蕩作用1.5 h。0.5% TBST洗板6次，每孔加入200 μL HRP/anti-M13抗體( 1∶5 000稀釋)，室溫振蕩作用1 h。0.5% TBST洗板6次，每孔加200 μL顯色底物ABTS-H2O2溶液，室溫作用30 min，酶標(biāo)儀讀取405 nm處的吸光度。每項實(shí)驗重復(fù)3次，陽性克隆定義為反應(yīng)孔吸光值高于陰性對照3倍［3-4］。

2.5ELISA檢測噬菌體濃度與其結(jié)合能力的關(guān)系

將含有共有序列的噬菌體克隆進(jìn)行擴(kuò)增并測定滴度，在一個已封閉的酶標(biāo)板中稀釋噬菌體，第1孔加入約含5×1011個病毒子的噬菌體懸液，TBS稀釋至200 μL，吸取100 μL至第2孔，按此方法依次進(jìn)行2倍系列稀釋。將稀釋好的噬菌體全部轉(zhuǎn)移至包被有靶分子的酶標(biāo)板中，進(jìn)行定量ELISA，方法同2.4，分別讀取不同濃度的噬菌體與靶分子結(jié)合后的吸光度。

3統(tǒng)計學(xué)處理

定量數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差( mean±SD)表示，兩組均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗。應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析處理，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 親和淘選與CCR5第一、二胞外環(huán)特異性結(jié)合的噬菌體

以人工合成的CCR5第一、二胞外環(huán)氨基酸序列作為靶分子，對噬菌體7肽庫進(jìn)行淘選，隨著篩選輪次的增加，從固相平板洗脫的噬菌體數(shù)逐漸增加，回收率(回收/投入噬菌體量)逐輪升高，ECL1和ECL2特異性結(jié)合的噬菌體得到了選擇性富集，見表1。將第3輪淘選洗脫物測序后發(fā)現(xiàn)，ECL1已得到共有序列( 10/15)，而ECL2的一致率較低( 3/15)，故ECL2增加了第4輪淘選，共有序列即明顯出現(xiàn)( 11/15)。

表1　不同淘選輪次噬菌體淘選的回收率Table 1.Recovery rate of phages for each round of panning

2 淘選所得噬菌體克隆的氨基酸序列分析

最后一輪淘選物滴度測定時，從總量不到100個藍(lán)色噬菌斑的平板上隨機(jī)挑取15個克隆擴(kuò)增后測序，根據(jù)測序結(jié)果推斷噬菌體展示的氨基酸序列。ECL1和ECL2分別有10和11個噬菌體序列一致，見表2。其共有序列分別為GHWKVWL和HYIDFRW，基因測序圖見圖1、2。

表2　淘選所得噬菌體克隆的氨基酸序列Table 2.Exogenous amino acid sequences of selected phage clones

3 ELISA法鑒定噬菌體克隆與ECL1、ECL2的特異性結(jié)合

Figure 1.Gene sequencing of consensus peptide displayed on ECL1-specifically bound phage.圖1　ECL1特異性結(jié)合噬菌體克隆所展示的共有結(jié)合肽的基因測序圖

Figure 2.Gene sequencing of consensus peptide displayed on ECL2-specifically bound phage.圖2　ECL2特異性結(jié)合噬菌體克隆所展示的共有結(jié)合肽的基因測序圖

將噬菌體上清液擴(kuò)增后做ELISA檢測，除空白對照外，每個克隆均設(shè)置陰性對照(不包被靶分子、僅用牛血清白蛋白溶液進(jìn)行封阻)。ECL1結(jié)合的15個噬菌體克隆中，有4個為陰性克隆( P＞0. 05，或噬菌體A值＜陰性對照A值×3) ; 11個為陽性克隆( P＜0. 05，并且噬菌體A值＞陰性對照A值×3)，其中10個氨基酸序列為GHWKVWL，1個WHLSSWK，見表3。ECL2結(jié)合的15個噬菌體克隆全部為陽性克隆，其中11個氨基酸序列為HYIDFRW，2個 WSLSELH，1個QFWYFHP，1個LYADSVL，見表4。

表3　ELISA法鑒定ECL1淘選所得噬菌體克隆的結(jié)合能力Table 3.Identification of binding efficiency of selected phage clones targeting ECL1 by ELISA ( Mean±SD.n =3)

表4　ELISA法鑒定ECL2淘選所得噬菌體克隆的結(jié)合能力Table 4.Identification of binding efficiency of selected phage clones targeting ECL2 by ELISA ( Mean±SD.n =3)

4 共有序列噬菌體克隆與靶分子的結(jié)合能力與濃度的關(guān)系

與ECL1和ECL2特異性結(jié)合的共有序列為GHWKVWL和HYIDFRW，將其對應(yīng)的噬菌體克隆進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)行定量ELISA檢測。結(jié)果表明，在噬菌體濃度較低時，其與靶分子的結(jié)合能力隨濃度的增加呈線性上升趨勢;當(dāng)濃度達(dá)到3.125×1014pfu/L(第3孔)及以上時，其與靶分子的結(jié)合達(dá)到飽和，見圖3。

Figure 3.Relationship of concentration and binding efficiency of phage clones.Mean±SD.n =3.圖3　噬菌體濃度與結(jié)合能力的關(guān)系

討論

噬菌體展示技術(shù)是一種選擇技術(shù)，它利用基因重組的方法將大量隨機(jī)多肽與噬菌體的一種衣殼蛋白融合表達(dá)，將其展示在病毒顆粒的表面，在體外通過親和淘選的方法，可將與靶分子特異性結(jié)合的噬菌體從肽庫中淘選出來，經(jīng)擴(kuò)增后進(jìn)行序列測定可確定表達(dá)的肽的氨基酸序列。該技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的一種常用方法，可廣泛用于確定抗原表位、確定蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)、鑒定酶的底物或抑制物、鑒定受體激活物或抑制劑、開發(fā)多肽藥物、研制腫瘤疫苗等。

在本實(shí)驗中，我們首先進(jìn)行了常規(guī)的3輪淘選，在洗脫物培養(yǎng)平板上，隨機(jī)選取15個獨(dú)立克隆進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)ECL1有10個克隆所展示的外源肽序列完全一致，說明特異性短肽已得到選擇性富集，淘選成功。而ECL2的15個測序克隆中僅有3個序列一致，其它12個各不相同，增加了第4輪淘選后發(fā)現(xiàn)，相同的序列一致率從3/15上升到11/15，認(rèn)為淘選成功，這可能與ECL2氨基酸序列長、與其親和力高的短肽多而需要更強(qiáng)的淘選有關(guān)。

淘選得到的短肽應(yīng)用ELISA法進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)除了共有序列外，其它非特異性的序列也可表現(xiàn)出陽性反應(yīng)，說明與CCR5第一、二胞外環(huán)有親和力的7肽并不唯一，特別是具有32個氨基酸長度的ECL2，能與其隨機(jī)結(jié)合的七肽種類很多，而淘選之所以能使一種序列呈明顯優(yōu)勢，是因為這種短肽與靶分子的結(jié)合作用最強(qiáng)，能在數(shù)輪的洗脫中“幸存”下來。另外，我們將這6種陽性的多肽序列通過Gen-Bank的BLAST序列比對工具，在RefSeq protein數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性搜索，未發(fā)現(xiàn)其與大鼠趨化因子具有同源性，說明它們與CCR5第一、二胞外環(huán)的結(jié)合可能是通過模擬趨化因子的構(gòu)象表位而發(fā)揮作用的。噬菌體濃度定量的ELISA實(shí)驗中發(fā)現(xiàn)，噬菌體在體外與CCR5的親合力具有濃度依賴性和可飽和性，這跟受體與配體結(jié)合具有可飽和性的理論一致，推測飽和的主要原因是靶分子包被的數(shù)目有限。

在噬菌體展示肽庫的選擇上，美國New England Biolabs公司有7肽庫( Ph.D.TM-7)、12肽庫( Ph.D.TM-12)和環(huán)7肽庫( Ph.D.TM-C7C) 3種可供選擇。當(dāng)配體序列要求在一個短的區(qū)域內(nèi)有幾個結(jié)合位點(diǎn)時，Ph.D.TM-7肽文庫更好一些;當(dāng)配體序列不能以足夠強(qiáng)的親和力與靶分子結(jié)合而被篩選時，Ph.D.TM-C7C文庫會更好一些，因為此文庫中所有展示肽結(jié)構(gòu)均被局限于1個7殘基二硫環(huán)內(nèi)，其結(jié)合構(gòu)象比線性形式表達(dá)的肽文庫更有效、結(jié)合更緊密;而Ph.D.TM-12肽文庫提供了更大的隨機(jī)區(qū)域，會有利于選擇到有多個弱結(jié)合位點(diǎn)的序列，而不是只有少數(shù)幾個強(qiáng)結(jié)合位點(diǎn)的序列。因此，由于我們的實(shí)驗是以相對較短的線性氨基酸( 13 aa和32 aa)作為靶分子，淘選是為得到高親和力、高特異性的短肽，故選擇使用了結(jié)合位點(diǎn)密集、需要強(qiáng)淘選的7肽庫。Wang等［5］以細(xì)胞表達(dá)的人CCR5作為靶分子，用12肽庫也淘選到與其特異性結(jié)合的親和短肽，并在細(xì)胞水平上初步證明了該十二肽對其天然配體RANTES及CCR5單克隆抗體有競爭性結(jié)合作用，這項實(shí)驗以CCR5整體結(jié)構(gòu)作為靶點(diǎn)，12肽庫的選擇則可能更有利于特異性的提高。

研究顯示CCR5主要表達(dá)于炎癥細(xì)胞表面，其天然配體包括趨化因子RANTES、MIP-1α和MIP-1β，CCR5的N端及第二胞外環(huán)是其與配體結(jié)合的主要位點(diǎn)［6-7］，結(jié)合后可誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞向特定組織和器官趨化遷移，從而參與機(jī)體免疫反應(yīng)，并在變態(tài)反應(yīng)性疾病中發(fā)揮重要作用，如IBD［8］、多發(fā)性硬化［9］、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎［10］等。另外，CCR5還是HIV-1感染靶細(xì)胞的輔助受體，已成為抗艾滋病藥物研發(fā)的理想靶點(diǎn)之一［11］。在CCR5拮抗劑的研發(fā)方面，小分子藥物馬拉維諾是目前FDA唯一批準(zhǔn)用于臨床的CCR5拮抗劑，主要用于艾滋病的治療。其它類型的CCR5拮抗劑包括趨化因子衍生物、單克隆抗體及肽類化合物等，尚在實(shí)驗室研究階段，有許多已在實(shí)驗室證明有效或進(jìn)入I期臨床試驗［12］，本實(shí)驗淘選的親和短肽即屬于肽類拮抗劑一類，這類多肽具有高親和力和特異性結(jié)合的特點(diǎn)，生產(chǎn)成本低、穩(wěn)定性好、副反應(yīng)發(fā)生率低，是蛋白制劑的一種可靠替代品，具有很大的研發(fā)空間。

在IBD的發(fā)病機(jī)制中，CC趨化因子與相應(yīng)的受體結(jié)合后可觸發(fā)多種炎癥反應(yīng)，包括白細(xì)胞的激活、趨化、胞吐作用，產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶降解基質(zhì)、上調(diào)炎癥的級聯(lián)反應(yīng)等。研究證明IBD患者病變黏膜中CCR5+細(xì)胞浸潤顯著，與UC疾病活動度呈正相關(guān)［13］，并與CD患者非干酪性肉芽腫形成有關(guān)［14］。Ajuebor等［8］及Kucuk等［15］用RANTES受體拮抗劑Met-RANTES分別治療三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的小鼠、大鼠結(jié)腸炎，發(fā)現(xiàn)病變黏膜的炎癥反應(yīng)可明顯減輕、腸內(nèi)細(xì)菌異位明顯下降。Katchar等［16］用MIP-3α單克隆抗體治療小鼠結(jié)腸炎后，也可發(fā)現(xiàn)結(jié)腸損傷明顯減輕。由此推斷，趨化因子受體拮抗劑可能是IBD治療的有效方法之一。本實(shí)驗淘選得到針對大鼠的2個CCR5拮抗短肽，可進(jìn)一步在構(gòu)建結(jié)腸炎的大鼠模型中來驗證其生理作用。

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Panning and identification of antagonistic active peptides specifically binding to the first and second extracellular membrane loops of rat CCR5 by technique of phage display peptide library

LIU Si-xue1，HU Mei1，YE Xiao-yan1，3，HUANG Hua-rong2，ZHONG Ying-qiang1
(1Department of Gastroenterology，2Department of Pediatric，Sun Yat-sen Memorial Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510120，China;3The First Affiliated Hospital of Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510080，China.E-mail: zhongyingqiang@21cn.com; hhrvivi@21cn.com)

［ABSTRACT］AIM: To pan the active peptides which specifically bound to the first and second extracellular membrane loops of rat CC chemokine receptor 5 ( CCR5).METHODS: The technique of phage display peptide library was used and binding ability of the peptides was identified.The amino acid sequences of the first and second extracellular loops of rat CCR5 were searched in the protein database and chemically synthesized corresponding linear peptides were used as targets in the biopanning.After 3 to 4 rounds of screening with Ph.D.(TM)-7 Phage Display Peptide Library were performed，the specific phages were collected and primarily identified by ELISA.RESULTS: The sequences of the peptides displayed on the selected phages were GHWKVWL and HYIDFRW，both of them exhibited positive in phage binding ELISA and the binding to phages and targets were concentration dependent and saturable.CONCLUSION: Two antagonistic active peptides specifically binding to CCR5 were successfully obtained by the technique of phage display peptide library，and the binding ability to the first and second extracellular membrane loops of rat CCR5 were proved in vitro.

［KEY WORDS］CC chemokine receptor 5; Antagonistic peptide; Phage display

通訊作者△鐘英強(qiáng)Tel: 020-81332598; E-mail: zhongyingqiang@21cn.com;黃花榮020-81332446; E-mail: hhrvivi@21cn.com

*［基金項目］國家自然科學(xué)資金基助項目( No.81370499) ;廣東省自然科學(xué)基金資助項目( No.2014-A030313020)

［收稿日期］2015-03-03［修回日期］2015-04-11

［文章編號］1000-4718( 2015)07-1225-06

［中圖分類號］R363

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.013