Rho 激酶抑制劑用于腦損傷治療的初步實(shí)驗(yàn)研究

彭智濤，陳建良 (廣東省深圳市第四人民醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東 深圳 518000)

心腦血管疾病的發(fā)病率逐漸上升，嚴(yán)重威脅人類健康及生命安全。多項(xiàng)研究顯示，Rho/Rock 激酶信號(hào)通路在腦梗死等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理機(jī)制中扮演著重要角色，作為信號(hào)轉(zhuǎn)換器或分子開關(guān)，參與調(diào)控細(xì)胞形態(tài)維持、細(xì)胞黏附與遷移、細(xì)胞增殖與凋亡、基因轉(zhuǎn)錄、平滑肌收縮等多種生物學(xué)行為，介導(dǎo)了多種平滑肌與非平滑肌功能異常相關(guān)疾病的發(fā)生［1］。近年來，Rho激酶抑制劑因其良好的神經(jīng)保護(hù)作用逐漸成為治療心腦血管疾病的重要藥物。本研究通過分離培養(yǎng)大鼠神經(jīng)干細(xì)胞，并通過軟瓊脂實(shí)驗(yàn)、免疫熒光檢測(cè)、Western blotting 檢測(cè)等觀察Rho激酶抑制劑Y27632 對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的影響，以期為神經(jīng)干細(xì)胞移植治療腦損傷中提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 神經(jīng)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng):選取孕12 ～14 d 的SD 大鼠，斷頭處死并浸于75%乙醇內(nèi)消毒，無菌條件下剪開腹部皮膚及筋膜，分離子宮，置于D-Hanks 液內(nèi)清洗后分離胎鼠，取其頭部并在解剖顯微鏡下暴露其大腦，獲取海馬組織，將其制作成1 mm3組織塊，加入DMEM/F12 1∶1培養(yǎng)液，反復(fù)吹打，制作單細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml，接種于12 孔培養(yǎng)板內(nèi)，37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔日半量換液。

1.2 神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定:通過免疫熒光檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞特異性蛋白Nestin、CD133 進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞鑒定，具體操作如下:取100 μl 細(xì)胞懸液滴于經(jīng)預(yù)處理的載玻片上，50℃溫浴10 min，確保細(xì)胞緊貼于載玻片上;滴加4%多聚甲醛1 ml 固定20 min，PBS 溶液沖洗;滴加0.4%Triton-X100 消化30 min，PBS 溶液沖洗;3%BSA 封閉，37℃孵育30 min;除去封閉液，加入稀釋200 倍后的Nestin、CD133 一抗，4℃孵育過夜，TBST 沖洗;滴加熒光二抗，37℃避光孵育30 min，TBST 沖洗;DAPI 染色;激光共聚焦顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.3 Y27632 對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化能力的影響

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組:本實(shí)驗(yàn)共設(shè)置對(duì)照組、LPA 組、Y27632 組三個(gè)組別，每組設(shè)置三組重復(fù)，分別采用DMEM/F12、DMEM/F12+LPA(終濃度200 ng/ml)、DMEM/F12 + LPA(終濃度200 ng/ml) +Y27632(終濃度200 ng/ml)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

1.3.2 軟瓊脂檢測(cè):軟瓊脂檢測(cè)采用上海美科美生物科技有限公司生產(chǎn)的軟瓊脂克隆試劑盒，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，37℃、5%CO2培養(yǎng)2 周后，觀察軟瓊脂克隆形成情況。

1.3.3 熒光定量檢測(cè)Ki67 和GFAP 基因表達(dá)水平:收集對(duì)照組、LPA 組、Y27632 組的細(xì)胞，經(jīng)總RNA 提取、逆轉(zhuǎn)錄，獲取cDNA，-20℃保存?zhèn)溆?設(shè)計(jì)并合成Ki67、GFAP、GAPDH 基因的引物，以GADPH 為內(nèi)參基因，相對(duì)定量分析Ki67、GFAP 的mRNA 表達(dá)水平。

1.3.4 Western blotting 檢測(cè)Ki67 和GFAP 基因的相對(duì)表達(dá)量:收集對(duì)照組、LPA 組、Y27632 組的細(xì)胞，冷PBS 溶液反復(fù)清洗，加入200 μl 的細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞并反復(fù)吹打，冰上放置10 min，確保細(xì)胞充分裂解;4℃，12 000 rpm 離心15 min，取上清，采用2-D 定量試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，調(diào)整各組總蛋白質(zhì)濃度為5 μg/μl，制備上樣液，后經(jīng)SDS-PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、顯色等操作，采用冷凍CCD 曝光顯影，并采用Image Quant TL-1D Analysis Tool 對(duì)免疫印跡結(jié)果進(jìn)行定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:數(shù)據(jù)處理采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較行t 檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)干細(xì)胞鑒定結(jié)果:采用免疫熒光檢測(cè)Nestin、CD133蛋白的表達(dá)情況如圖1 所示，分離培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞均呈NSC、Nestin 染色陽性。

圖1 免疫熒光鑒定NSC(400×)

2.2 軟瓊脂檢測(cè)Y27632 對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力的影響:經(jīng)過2 周培養(yǎng)，如表1 所示，LPA 組的單克隆細(xì)胞個(gè)數(shù)及單克隆形成率較對(duì)照組及Y27632 組顯著升高(P ＜0.05)，表明LPA 處理能夠促進(jìn)NSCs 細(xì)胞的增殖，而Y27632 組的單克隆細(xì)胞個(gè)數(shù)及單克隆形成率與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，表明Y27632 對(duì)NSCs 單克隆無促進(jìn)作用。

表1 NSC 單克隆細(xì)胞的個(gè)數(shù)及形成率

表1 NSC 單克隆細(xì)胞的個(gè)數(shù)及形成率

NSC 細(xì)胞 對(duì)照組 LPA 組 Y27632組單克隆的個(gè)數(shù)198±36.23 305±63.71 186±32.90單克隆形成率(%)19.8±3.62 30.5±6.37 18.6±3.29

2.3 熒光定量檢測(cè)GFAP 和ki67 基因的表達(dá)量:不同組的GFAP 和ki67 基因的表達(dá)量如表2 所示，與對(duì)照組相比，LPA 組GFAP 基因表達(dá)量無顯著性變化(P ＞0.05)，而Ki67 基因表達(dá)量顯著性升高(P ＜0.01);而Y27632 組ki67 基因表達(dá)量無顯著變化(P ＞0.05)，而GFAP 基因表達(dá)量顯著性升高(P ＜0.05)。

表2 熒光定量檢測(cè)GFAP 和ki67 基因的表達(dá)量

表2 熒光定量檢測(cè)GFAP 和ki67 基因的表達(dá)量

注:與對(duì)照組比較，①P ＜0.05;②P ＜0.01

項(xiàng)目 對(duì)照組 LPA 組 Y27632組GFAP 表達(dá)量 1.00±0.47 1.05±0.53 5.03±0.62①ki67 表達(dá)量 1.00±0.62 2.97±0.74②1.14±0.57

2.4 Western blot 檢測(cè)GFAP、ki67 蛋白質(zhì)表達(dá):以GAPDH 為內(nèi)參，不同組細(xì)胞中GFAP、ki67 蛋白的表達(dá)量如圖2、表3 所示，與對(duì)照組相比，LPA 組ki67 的表達(dá)量顯著升高(P ＜0.05)，GFAP 的表達(dá)量無明顯差異(P ＞0.05);Y27632 組細(xì)胞GFAP表達(dá)量顯著升高(P ＜0.05)，而ki67 有所升高但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。

表3 Western blot 檢測(cè)GFAP、Ki67 蛋白質(zhì)表達(dá)水平

表3 Western blot 檢測(cè)GFAP、Ki67 蛋白質(zhì)表達(dá)水平

注:與對(duì)照組比較，①P ＜0.05;②P ＜0.01

項(xiàng)目 對(duì)照組 LPA 組 Y27632組GFAP 蛋白質(zhì)表達(dá)水平 1.00±0.71 1.03±0.65 2.47±0.56①ki67 蛋白質(zhì)表達(dá)水平 1.00±0.59 2.14±0.73②1.57±0.61

圖2 Western blotting 檢測(cè)細(xì)胞中GFAP、ki67 蛋白質(zhì)表達(dá)量

3 討論

神經(jīng)干細(xì)胞因具有自我更新、多分化潛能、遷移功能、良好的組織相容性、低免疫源性和可長期存活等特點(diǎn)，可作為細(xì)胞移植的供體來源，用于神經(jīng)系統(tǒng)病變(如帕金森氏病、亨廷頓病等)的治療中，但目前對(duì)于其定向誘導(dǎo)分化機(jī)制仍不明確。目前研究顯示，Rho/Rock 激酶信號(hào)通路在缺血性腦血管病的危險(xiǎn)因素、發(fā)病機(jī)制和病理生理中發(fā)揮了重要作用［2］。

溶血磷脂酸(LPA)是一類重要的細(xì)胞外信號(hào)遞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)第二信使，具有激活Rho/Rock 激酶信號(hào)通路的作用［3］。而Y27632 作為Rho 激酶抑制劑，可與競(jìng)爭(zhēng)性的抑制ATP 與RockⅡ的結(jié)合，抑制其活化，從而促進(jìn)SCI 后軸突再生與生長［4］。本研究分別采用LPA、Y27632 處理體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，LPA 組單克隆的形成率明顯高于Y27632 組和對(duì)照組，而加入Y27632 單克隆形成率明顯減少，表明Y27632 促進(jìn)了NSCs 分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，從而使其形成單克隆的能力減弱;采用免疫熒光及Western bloting 檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，LPA 組GFAP 基因表達(dá)量無顯著性變化(P ＞0.05)，而Ki67 基因表達(dá)量顯著性升高(P ＜0.01);而Y27632 組ki67 表達(dá)量無顯著變化(P ＞0.05)，而GFAP 表達(dá)量顯著性升高(P ＜0.01)。GFAP 作為星形細(xì)胞中間絲的結(jié)構(gòu)蛋白，是成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志，其表達(dá)量的升高，表明Y27632 有效地促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的分化［5-6］;此外，Ki67 作為增殖細(xì)胞相關(guān)的核蛋白，其表達(dá)量升高與細(xì)胞增殖相關(guān)，而Y27632 組細(xì)胞其Ki67 的表達(dá)量及蛋白質(zhì)水平均未顯著變化［7-8］。針對(duì)GFAP、Ki67 基因表達(dá)的分析進(jìn)一步證實(shí)Y27632 可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞方向分化。

綜上所述，Rho 激酶抑制劑Y27632 能夠顯著提高體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的GFAP 表達(dá)水平，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的分化，對(duì)于損傷神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)具有重要作用。

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