杜仲總黃酮體外抗乙型肝炎病毒的實驗研究

余 曉，羅 果（遵義醫(yī)學(xué)院：.生物化學(xué)教研室；.醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心，貴州遵義563000）

杜仲是中國特有的名貴中藥材和工業(yè)原料樹種。研究表明，杜仲含許多有效藥用成分，如黃酮類、木脂類、萜類、糖類、生物堿和抗真菌蛋白等[1]，其中黃酮類化合物具有抗病毒、抗衰老、抗氧化、抑菌、降脂減肥[2]、抗癌防癌等作用[3]。

乙型肝炎是由嗜肝的乙型肝炎病毒（HBV）引起的一種在世界范圍的傳染性疾病，全世界約有3.5億人感染HBV，我國約占一半。乙型肝炎給人類健康造成極大的危害，尋求高效低毒的抗HBV的天然藥物已經(jīng)刻不容緩[4]。本實驗擬用轉(zhuǎn)染HBV的人肝癌細胞HepG2.2.15作為研究對象[5]，觀察杜仲總黃酮抗HBV的效果，為杜仲抗HBV的藥效成分篩選以及杜仲天然產(chǎn)物的開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 杜仲皮采自貴州省正安縣田生村。轉(zhuǎn)染HBV的人肝癌細胞系HepG2.2.15購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.2 試劑 HBV熒光定量試劑盒（達安基因公司）；DMEM細胞培養(yǎng)液（GIBCO公司）；乙型肝炎e抗原（HBeAg）、乙型肝炎表面抗原（HBsAg）試劑盒（華美公司）；胎牛血清（四季青公司）；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100080-200806）。拉米夫定[葛蘭素史克制藥（蘇州）有限公司，批號：10090046]。

1.1.3 主要儀器 熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）；ELX800通用酶標(biāo)儀（美國Bio-techInc公司）；CO2孵箱（美國Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 杜仲總黃酮的提取與含量測定 將杜仲皮制成粉狀，采用乙醇分段（60%～90%）提取法提取，醋酸鉛胺沉淀過濾，濃縮后過大孔樹脂、聚酰胺和硅膠柱，將過柱后樣品與標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁對照，測得總黃酮含量為69%。

1.2.2 杜仲總黃酮對HepG2.2.15細胞的毒性實驗 取對數(shù)生長期的HepG2.2.15細胞，用細胞培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為 1×105mL-1，將細胞接種于 96 孔板，每孔 200 μL，待其貼壁后，棄掉原培養(yǎng)液。在杜仲總黃酮不同劑量組各孔分別加入總黃酮濃度為 25、50、100、200 μg/mL 培養(yǎng)液200 μL，另設(shè)不加藥細胞培養(yǎng)孔為空白對照組，每組重復(fù)6孔。將各組細胞置CO2孵箱培養(yǎng)72 h，采用MTT法測定各組細胞在490 nm處的OD值。計算不同濃度杜仲總黃酮對HepG2.2.15細胞生長抑制率[6]。細胞生長抑制率（%）=（空白對照組OD值-杜仲總黃酮不同劑量組OD值）/劑量組OD值×100%。根據(jù)Reed-Muench公式計算半數(shù)毒性濃度（TC50）。

1.2.3 不同濃度杜仲總黃酮對HBV-DNA的作用 按1.2.2項下方法加入不同濃度的杜仲總黃酮藥液，另設(shè)藥物拉米夫定（50 μg/mL）為陽性對照，每組重復(fù)3孔。置CO2孵箱培養(yǎng)72 h后，取細胞培養(yǎng)上清液提取HBVDNA，采用Real-time PCR法測定HBV-DNA拷貝數(shù)。記錄閾值（Ct值），計算各樣品的HBV-DNA起始拷貝數(shù)和抑制率[7]。DNA抑制率=（空白對照組拷貝數(shù)-劑量組拷貝數(shù)）/空白對照組拷貝數(shù)×100%。

1.2.4 細胞培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg含量測定按1.2.2項下方法加入不同濃度的杜仲總黃酮藥液并設(shè)置空白對照組，收集各組細胞培養(yǎng)的上清液進行酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）測定。測定方法按照試劑盒操作說明進行。用酶聯(lián)免疫檢測儀測定450 nm處OD值，并計算抑制率[8]。HBsAg或HBeAg抑制率=（空白對照組OD值-劑量組OD值）/空白對照組OD值×100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以ss表示，采用方差分析。Р＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 杜仲總黃酮對HepG2.2.15細胞的毒性實驗 杜仲總黃酮各劑量組（25、50、100、200 μg/mL）的 OD 值均低于空白對照組，說明杜仲總黃酮對HepG2.2.15細胞的生長有抑制作用。其中，杜仲總黃酮 50、100、200 μg/mL劑量組的抑制率與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表 1。提示杜仲總黃酮的 TC50＞200 μg/mL，因此，本實驗選取小于或等于200 μg/mL的濃度檢測杜仲總黃酮的抗HBV作用。

表1 杜仲總黃酮對HepG2.2.15生長的抑制作用

2.2 不同濃度杜仲總黃酮對細胞上清液中HBV-DNA的影響 用杜仲總黃酮和拉米夫定分別作用細胞72 h，應(yīng)用Real-time PCR法檢測細胞培養(yǎng)上清液中HBVDNA的拷貝數(shù)。結(jié)果顯示，杜仲總黃酮各劑量組和拉米夫定對HBV-DNA的復(fù)制均有抑制作用，與空白對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表 2。

表2 杜仲總黃酮、拉米夫定對細胞上清液中HBV-DNA的影響

2.3 杜仲總黃酮對HepG2.2.15細胞培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg含量的影響 用杜仲總黃酮和拉米夫定分別作用72 h，ELISA法測定細胞分泌HBsAg和HBeAg量，采用OD值表示。結(jié)果顯示，杜仲總黃酮各劑量組和拉米夫定對HBsAg及HBeAg的分泌均有抑制作用，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表 3、4。

表3 杜仲總黃酮、拉米夫定對HepG2.2.15細胞分泌HBsAg的抑制作用

表4 杜仲總黃酮、拉米夫定對HepG2.2.15細胞分泌HBeAg的抑制作用

3 討 論

黃酮類化合物是杜仲主要活性成分之一，具有抗氧化、調(diào)節(jié)血脂、抗腫瘤、抗病毒、抗骨質(zhì)疏松、增強免疫力等多種功效。目前已經(jīng)有其他物種的黃酮抗HBV的研究報道[9-11]，而對杜仲黃酮抗HBV的相關(guān)研究報道較少。

本研究以轉(zhuǎn)染HBV的HepG2.2.15細胞為研究對象，該細胞能持續(xù)分泌HBV和相關(guān)抗原，研究杜仲總黃酮對該細胞分泌HBsAg、HBeAg和HBV-DNA的影響[12]。結(jié)果顯示，不同濃度的杜仲總黃酮和拉米夫定均對HBVDNA復(fù)制有較強的抑制作用。細胞培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg檢測表明，不同濃度的杜仲總黃酮、拉米夫定均對HBsAg和HBeAg的有抑制作用，其中對HBV-DNA的復(fù)制抑制作用強于對HBsAg和HBeAg的作用，說明總黃酮抗HBV的機制可能與抑制病毒DNA復(fù)制有關(guān)。研究結(jié)果表明，杜仲總黃酮在體外具有抗HBV的作用，但是其全面的抗病毒作用還需結(jié)合動物體內(nèi)試驗來證明，其抗病毒機制還有待進一步研究。

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