微生物法提取馬齒莧和銀杏葉黃酮及其抗氧化活性研究

王冬冬　陳雪紅　曹冬梅等

摘要：采用乙醇和微生物的方法對馬齒莧（Portulaca oleracea L.）和銀杏（Ginkgo biloba L.）葉進行黃酮的提取，并測定粗提液對DPPH自由基的清除作用。結(jié)果表明，乙醇提取馬齒莧和銀杏葉黃酮的提取率分別為2.00%和4.37%，微生物提取馬齒莧和銀杏葉黃酮的提取率分別為2.07%和4.84%。馬齒莧和銀杏葉微生物提取液對DPPH自由基的清除作用在相同的稀釋倍數(shù)下高于乙醇提取液，表明微生物提取植物中黃酮具有一定的可行性和優(yōu)越性。

關(guān)鍵詞：馬齒莧（Portulaca oleracea L.）；銀杏（Ginkgo biloba L.）葉；黃酮；微生物；DPPH自由基

中圖分類號：TQ234.2；R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）06-1455-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.06.044

Abstract： Ethanol method and microbiological method were used to extract flavonoids from purslane and Ginkgo biloba. DPPH radical scavenging effect of crude extraction was measured. The results showed that the rate of flavonids extracted from Ginkgo and purslane with ethanol method was 2.00% and 4.37%. That from purslane and Ginkgo biloba with microbial method was 2.07% and 4.84%. Scavenging of DPPH radicals of microbial extract at the same dilution factor was higher than that of ethanol extract， indicating that microbiologial method of extracting the flavonoids from plants had certain feasibility and superiority.

Key words： Portulaca oleracea L.；leaves of Ginkgo biloba L.；flavonoids； microorganism； DPPH

植物活性成分包括黃酮、多酚、生物堿、皂苷等，廣泛存在于植物的葉、根、莖、果實中，是綜合利用的植物資源。植物活性成分具有抗氧化、抗菌、預(yù)防或抑制腫瘤等生理功能。植物活性成分因其高的安全性，已滲入到食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)[1，2]。因此，利用各種提取技術(shù)從植物中提取具有高活性的成分已經(jīng)成為目前的研究熱點。傳統(tǒng)的提取技術(shù)包括有機溶劑提取法、熱水提取法、系統(tǒng)溶劑提取法等，但產(chǎn)品安全性低、耗時長、提取率低。安全性高、提取率高和環(huán)保的新型提取方法越來越受人們的關(guān)注。微生物法提取植物活性成分是利用微生物在生長過程中分泌的多種酶，從而對植物中的活性成分進行提取和修飾[3-7]。

本研究以2種提取黃酮較為普遍的馬齒莧（Portulaca oleracea L.）和銀杏（Ginkgo biloba L.）葉為對象，以乙醇提取和微生物提取作為對比，檢測提取液中總黃酮的含量和提取液對DPPH自由基的清除作用，初步探究微生物法提取植物中黃酮的可行性與優(yōu)越性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種 黃酒酵母，購自北京市食品釀造研究所。

1.1.2 供試材料 馬齒莧、銀杏葉，60 ℃烘干至恒重，粉碎過50目篩備用。

1.1.3 試劑 蘆丁標準品（生化試劑，中國藥品生物制品檢定所）；DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）購自美國Sigma公司；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為市售國產(chǎn)分析純。

1.1.4 儀器 高壓滅菌鍋（上海申安醫(yī)療機械廠）、全溫度振蕩培養(yǎng)箱（太倉華美生化儀器廠）、水浴恒溫搖床（太倉華美生化儀器廠）、低速大容量臺式離心機、紫外分光光度計UV-1240（日本島津）等。

1.2 黃酮的提取

1.2.1 乙醇提取黃酮 分別稱取5 g馬齒莧和銀杏葉粉末，按照1∶50料液比（g∶mL，下同）， 加入體積分數(shù)為60%的乙醇250 mL，于70 ℃水浴搖床中提取3 h，冷卻后4 000 r/min離心10 min，取上清液待測[8-12]。

1.2.2 微生物法提取黃酮 分別稱取5 g馬齒莧粉和銀杏葉粉，按照1∶50的料液比，加入去離子水250 mL，接入5%的黃酒酵母擴培菌液，于28 ℃、180 r/min的空氣搖床中提取48 h，4 000 r/min離心10 min，取上清液待測。

1.3 黃酮含量的測定

1.3.1 標準曲線的繪制 準確配制1 mg/mL蘆丁標準液，精確吸取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL蘆丁標準液，補齊至1 mL，各加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，放置6 min，加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，放置6 min，加入4 mL 1 mol/L NaOH溶液，再加0.4 mL去離子水，搖勻，放置10 min，以空白試劑為對照，在510 nm下測吸光度。以蘆丁濃度為橫坐標（x），以吸光度（y）為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.2 黃酮提取率的測定 準確吸取1 mL的提取液，各加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，放置6 min，加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，放置6 min，加入4 mL 1mol/L NaOH溶液，再加0.4 mL去離子水，搖勻，放置10 min，以提取溶劑作為空白對照，在510 nm下測其吸光度，由標準曲線計算出提取液中黃酮的含量。

摘要：采用乙醇和微生物的方法對馬齒莧（Portulaca oleracea L.）和銀杏（Ginkgo biloba L.）葉進行黃酮的提取，并測定粗提液對DPPH自由基的清除作用。結(jié)果表明，乙醇提取馬齒莧和銀杏葉黃酮的提取率分別為2.00%和4.37%，微生物提取馬齒莧和銀杏葉黃酮的提取率分別為2.07%和4.84%。馬齒莧和銀杏葉微生物提取液對DPPH自由基的清除作用在相同的稀釋倍數(shù)下高于乙醇提取液，表明微生物提取植物中黃酮具有一定的可行性和優(yōu)越性。

關(guān)鍵詞：馬齒莧（Portulaca oleracea L.）；銀杏（Ginkgo biloba L.）葉；黃酮；微生物；DPPH自由基

中圖分類號：TQ234.2；R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）06-1455-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.06.044

Abstract： Ethanol method and microbiological method were used to extract flavonoids from purslane and Ginkgo biloba. DPPH radical scavenging effect of crude extraction was measured. The results showed that the rate of flavonids extracted from Ginkgo and purslane with ethanol method was 2.00% and 4.37%. That from purslane and Ginkgo biloba with microbial method was 2.07% and 4.84%. Scavenging of DPPH radicals of microbial extract at the same dilution factor was higher than that of ethanol extract， indicating that microbiologial method of extracting the flavonoids from plants had certain feasibility and superiority.

Key words： Portulaca oleracea L.；leaves of Ginkgo biloba L.；flavonoids； microorganism； DPPH

植物活性成分包括黃酮、多酚、生物堿、皂苷等，廣泛存在于植物的葉、根、莖、果實中，是綜合利用的植物資源。植物活性成分具有抗氧化、抗菌、預(yù)防或抑制腫瘤等生理功能。植物活性成分因其高的安全性，已滲入到食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)[1，2]。因此，利用各種提取技術(shù)從植物中提取具有高活性的成分已經(jīng)成為目前的研究熱點。傳統(tǒng)的提取技術(shù)包括有機溶劑提取法、熱水提取法、系統(tǒng)溶劑提取法等，但產(chǎn)品安全性低、耗時長、提取率低。安全性高、提取率高和環(huán)保的新型提取方法越來越受人們的關(guān)注。微生物法提取植物活性成分是利用微生物在生長過程中分泌的多種酶，從而對植物中的活性成分進行提取和修飾[3-7]。

本研究以2種提取黃酮較為普遍的馬齒莧（Portulaca oleracea L.）和銀杏（Ginkgo biloba L.）葉為對象，以乙醇提取和微生物提取作為對比，檢測提取液中總黃酮的含量和提取液對DPPH自由基的清除作用，初步探究微生物法提取植物中黃酮的可行性與優(yōu)越性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種 黃酒酵母，購自北京市食品釀造研究所。

1.1.2 供試材料 馬齒莧、銀杏葉，60 ℃烘干至恒重，粉碎過50目篩備用。

1.1.3 試劑 蘆丁標準品（生化試劑，中國藥品生物制品檢定所）；DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）購自美國Sigma公司；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為市售國產(chǎn)分析純。

1.1.4 儀器 高壓滅菌鍋（上海申安醫(yī)療機械廠）、全溫度振蕩培養(yǎng)箱（太倉華美生化儀器廠）、水浴恒溫搖床（太倉華美生化儀器廠）、低速大容量臺式離心機、紫外分光光度計UV-1240（日本島津）等。

1.2 黃酮的提取

1.2.1 乙醇提取黃酮 分別稱取5 g馬齒莧和銀杏葉粉末，按照1∶50料液比（g∶mL，下同）， 加入體積分數(shù)為60%的乙醇250 mL，于70 ℃水浴搖床中提取3 h，冷卻后4 000 r/min離心10 min，取上清液待測[8-12]。

1.2.2 微生物法提取黃酮 分別稱取5 g馬齒莧粉和銀杏葉粉，按照1∶50的料液比，加入去離子水250 mL，接入5%的黃酒酵母擴培菌液，于28 ℃、180 r/min的空氣搖床中提取48 h，4 000 r/min離心10 min，取上清液待測。

1.3 黃酮含量的測定

1.3.1 標準曲線的繪制 準確配制1 mg/mL蘆丁標準液，精確吸取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL蘆丁標準液，補齊至1 mL，各加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，放置6 min，加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，放置6 min，加入4 mL 1 mol/L NaOH溶液，再加0.4 mL去離子水，搖勻，放置10 min，以空白試劑為對照，在510 nm下測吸光度。以蘆丁濃度為橫坐標（x），以吸光度（y）為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.2 黃酮提取率的測定 準確吸取1 mL的提取液，各加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，放置6 min，加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，放置6 min，加入4 mL 1mol/L NaOH溶液，再加0.4 mL去離子水，搖勻，放置10 min，以提取溶劑作為空白對照，在510 nm下測其吸光度，由標準曲線計算出提取液中黃酮的含量。