2，3－丁二醇與水楊酸誘導(dǎo)匍匐翦股穎對鐮刀菌枯萎病的抗性

房媛媛，馬暉玲

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/甘肅省草業(yè)工程實驗室/中－美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070）

匍匐翦股穎（Agrostis stolonifera）為多年生草本植物，是一種草質(zhì)細膩，耐頻繁低度修剪的冷季型草坪草，廣泛用于高爾夫球場、草地網(wǎng)球場、草地保齡球場等精細草坪，以及庭園、公園等養(yǎng)護水平較高的綠地。但匍匐翦股穎抗病性較差，易感染幣斑?。⊿clerotinia homoeocarpa）、褐斑病（Rhizoctonia solani）、鐮刀菌枯萎?。‵usarium oxysporum）等［1］。傳統(tǒng)抗病育種方法育種周期長，親本材料獲取有限，對病害只有一定預(yù)防作用［2］?；瘜W(xué)防治成本較高，易污染環(huán)境，病原物易對殺菌劑產(chǎn)生耐藥性甚至抗藥性，大量噴施后在土壤中累積，嚴重污染環(huán)境，進而直接影響人類的健康［3］。

誘導(dǎo)植物抗病性是利用物理、化學(xué)以及生物的方法，預(yù)先處理植物，改變病害反應(yīng)，使原來感病部位產(chǎn)生局部的或系統(tǒng)的抗病性現(xiàn)象。有關(guān)植物抗病性誘導(dǎo)的機理，目前，普遍認同的有兩種方式，即系統(tǒng)獲得抗性（SAR）和誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性（ISR）。有害病原物初次侵染后可在植物體內(nèi)激發(fā)出一種系統(tǒng)性抗性，植物體未受侵染部位對致病菌（病毒、真菌、細菌）產(chǎn)生廣譜抗性，這種需要水楊酸（SA）進行信號傳導(dǎo)的系統(tǒng)性誘導(dǎo)抗性稱為系統(tǒng)獲得抗性（SAR）［4］。對植物的SAR已進行了大量研究，SAR由SA介導(dǎo)，可以被一些植物激發(fā)子激活如苯并噻二唑（BTH）［5］、SA、甲基茉莉酸、苯丙 噻 重 氮、草 酸［6，7］、殼 聚 糖［8］等。Goarlach 和Friedrich等于1996年分別在小麥和擬南芥的研究中報道了 BTH 可引起系統(tǒng)獲得性抗性［9，10］。2003年Lee等［11］報道了BTH可誘導(dǎo)3個品種的匍匐翦股穎對核盤菌（Sclerotinia homoeocarpa）引起的幣斑病產(chǎn)生抗病性，但對其他品種如L－93，BTH是無效的。

誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性（ISR）則是由分布在植物體根部的非致病性根際促生菌激活，依賴茉莉酸/乙烯（JA/ET）信號傳導(dǎo)途徑［4］。Ryu等［12］研究認為，植物根際促生菌分泌的可揮發(fā)性有機物2，3－butanediol及其同分異構(gòu)體在誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性的過程中具有重要的作用。2，3－丁二醇存在3種旋光異構(gòu)體中，分別為D－（－）－2，3－丁二醇、L－（＋）－2，3－丁二醇和 meso－2，3－丁二醇，常溫下是一種無色無味的透明液體，微生物常形成異構(gòu)體混合物。2010年，加拿大學(xué)者 Cortes－Barco［13］報道了BDO（2R，3R－butanediol）和PC1（異鏈烷烴混合物）根部施入植株體后可抑制分別由真菌Sclerotinia homoeocarpa，Rhizoctonia solan和Microdochium nivale引起的3種草坪葉病發(fā)生。Hsiang等［14］研究認為，2R，3R－BD等其他異鏈烷烴混合物誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性的機制是ISR［14］，其抗病信號傳導(dǎo)物質(zhì)，抗病基因，病程相關(guān)蛋白均不同于系統(tǒng)獲得抗性（SAR）。但2，3－butanediol及其同分異構(gòu)體誘導(dǎo)不同植物對多種病原菌產(chǎn)生抗性具有個體差異性，誘導(dǎo)劑的施用濃度及其作用機理還需進一步研究。

研究采用SAR機制誘導(dǎo)劑水楊酸（SA）和ISR機制誘導(dǎo)劑2，3－丁二醇（2，3－BD立體異構(gòu)體的混合物），進行兩種誘導(dǎo)劑對匍匐翦股穎鐮刀菌枯萎病的抗病性誘導(dǎo)，對比兩種機制抗病誘導(dǎo)劑施用于匍匐翦股穎的作用效果，以期為匍匐翦股穎抗性誘導(dǎo)機制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試匍匐翦股穎品種為Penn－A4，由北京克勞沃公司提供。誘導(dǎo)劑2，3－BD購自西亞試劑。SA購自天津光復(fù)化工。匍匐翦股穎鐮刀菌枯萎病病原物為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum），由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院植物病理實驗室提供。

1.2 不同濃度2，3－BD與SA對匍匐翦股穎枯萎病的抗性誘導(dǎo)

240mL組培瓶裝入滅菌的沙土混合物（1∶2）約50mL。種子浸泡5h后，70%乙醇溶液浸泡1min，10%次氯酸鈉浸泡15min，無菌水沖洗6～7次，每瓶0.3g種子，種植于組培瓶，25±2℃組培室中培養(yǎng)，光周期為16h/d。

2，3－BD設(shè)置濃度梯度為150、250、350、450、550 μmol/L（c1，c2，c3，c4，c5）；SA 設(shè)置濃度梯度0.1、0.25、0.5、0.75、1.0mmol/L（C1，C2，C3，C4，C5）；不用誘導(dǎo)劑處理只接菌為CK。種植后第8d，將10mL的2，3－BD注射入匍匐翦股穎根部土壤，8mL的SA噴施至葉面，CK用滅菌水代替。

尖孢鐮刀菌在康乃馨葉片瓊脂培養(yǎng)基（CLA），25℃條件下培養(yǎng)7～10d產(chǎn)生分生孢子，用無菌水沖洗得到孢子懸浮液，再用血小球計數(shù)板計數(shù)，將孢子懸浮液稀釋到2×106個/mL濃度備用。匍匐翦股穎經(jīng)誘導(dǎo)劑處理后第7d，尖孢鐮刀菌孢子懸浮液（濃度為1×106個/mL）噴至匍匐翦股穎根部土壤（至土壤濕潤），每瓶7mL。接種后并在28℃黑暗培養(yǎng)1d，之后在26～27℃的組培室培養(yǎng)。

1.3 病情調(diào)查及抗病效果

接種后第7，14和21d，統(tǒng)計病葉率并計算病情指數(shù)，匍匐翦股穎鐮刀菌枯萎病分級標準為：0級：無癥狀；1級：病斑面積占全株葉片面積的10%以下；2級：病斑面積占全株葉片面積的10%～40%；3級：病斑面積占全株葉片面積的40%～60%；4級：病斑面積占全株葉片面積的60%～80%；5級：全部植株普遍感?。?5，16］。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度2，3－BD處理對匍匐翦股穎鐮刀菌枯萎病病情指數(shù)的影響

接菌后隨時間延長，CK與各處理的病情指數(shù)都呈上升趨勢，但適宜濃度的2，3－BD處理可明顯降低鐮刀菌枯萎病的病情指數(shù)。不同濃度2，3－BD處理匍匐翦股穎幼苗，接種尖孢鐮刀菌第7d發(fā)病不明顯，處理與CK的病情指數(shù)差異不顯著（圖1）。第14d葉片可觀察到明顯病斑，2，3－BD各處理C5除外，其他處理的病情指數(shù)顯著低于CK。接菌后第21d以CK發(fā)病明顯，2，3－BD各處理C2、C3、C4的病情指數(shù)顯著低于CK，其中C2的病情指數(shù)最低，為20，與CK相比降低了78%。篩選得到C2（250μmol/L）為2，3－BD誘導(dǎo)匍匐翦股穎抗鐮刀菌枯萎病的最佳濃度。接菌后第21d，250μmol/L的2，3－BD誘導(dǎo)匍匐翦股穎抗鐮刀菌枯萎病的發(fā)病狀況見圖2。

圖1 不用濃度2，3－丁二醇處理下匍匐翦股穎鐮刀菌枯萎病病情指數(shù)Fig.1 The disease index of creeping bentgrass treated with different concentrations of 2，3－BD

圖2 250μmol/L的2，3－BD誘導(dǎo)匍匐翦股穎接種尖孢鐮刀菌第21d發(fā)病狀況Fig.2 Disease occurring of creeping bentgrass treated with2，3－BD at 250μmol/L on 21st day

2.2 不同濃度SA處理對匍匐翦股穎鐮刀菌枯萎病病情指數(shù)的影響

不同濃度SA處理匍匐翦股穎幼苗，接種尖孢鐮刀菌第7d發(fā)病不明顯，處理與CK的病情指數(shù)差異不顯著（圖3）。在病斑明顯的第14d葉片可觀察到明顯病斑，但各處理與CK間差異不顯著。接菌后第21d，各處理與CK發(fā)病明顯，CK病情指數(shù)最高，為92，且與C1、C4、C5差異不顯著。C2，C3的病情指數(shù)雖顯著低于CK，但其病情指數(shù)分別高達86.67、81.4。SA不能誘導(dǎo)匍匐翦股穎抗鐮刀菌枯萎病。

圖3 不同濃度SA處理下匍匐翦股穎鐮刀菌枯萎病病情指數(shù)Fig.3 The disease index of creeping bentgrass under different concentrations of SA

2.3 不同濃度2，3－BD與SA處理對匍匐翦股穎抗鐮刀菌枯萎病抗病效果的分析

接菌后第21d的誘導(dǎo)效果表明（表1），2，3－BD各處理中C2、C3、C4的誘導(dǎo)效果顯著高于CK，其中C2誘導(dǎo)效果顯著高于CK與其他處理，誘導(dǎo)效果為78.26%。說明2，3－BD的C2（250μmol/L）處理能夠有效誘導(dǎo)匍匐翦股穎抗鐮刀菌枯萎病。SA各處理中C3（0.5mmol/L）誘導(dǎo)效果最佳，誘導(dǎo)效果僅為11.52%，且與C2、C4差異不顯著，誘導(dǎo)效果不明顯。

表1 不同濃度2，3－BD與SA誘導(dǎo)匍匐翦股穎抗鐮刀菌枯萎病誘導(dǎo)抗病效果的比較Table.1 The effect of induced disease resistance by 2，3－BD and SA

3 討論

3.1 2，3－BD與SA作用下匍匐翦股穎抗病性誘導(dǎo)效果的分析

SA的5個濃度中，0.5mmol/L誘導(dǎo)病情指數(shù)最低，為86.67，抗病效果僅為11.52%，說明SA不能誘導(dǎo)匍匐翦股穎抗鐮刀菌枯萎病。Lee［11］使用SAR機制誘導(dǎo)劑BTH誘導(dǎo)匍匐翦股穎品種Crenshaw，Penncross和Providence抗幣斑病，但對其他品種如L－93，BTH是無效的。表明SAR機制誘導(dǎo)劑在誘導(dǎo)匍匐翦股穎產(chǎn)生抗病性時具有其自身缺陷，可能是因為SAR機制誘導(dǎo)劑所要誘導(dǎo)表達的抗病相關(guān)基因與匍匐翦股穎中的抗病基因不完全吻合。

在接菌后發(fā)病明顯的第21d，2，3－BD的5個濃度中，250μmol/L的病情指數(shù)顯著低于其他處理與CK，誘導(dǎo)匍匐翦股穎抗病效果可達78.26%，說明該濃度2，3－BD可有效誘導(dǎo)匍匐翦股穎抗鐮刀菌枯萎病。Cortes－Barco使用ISR 機制誘導(dǎo)劑 BDO（2R，3R－butanediol）和PC1（異鏈烷烴混合物）誘導(dǎo)匍匐翦股穎對分別由真菌Sclerotinia homoeocarpa，Rhizoctonia solani和Microdochium nivale引起的3種草坪葉病產(chǎn)生抗性，施入PC1或BDO可減少匍匐翦股穎葉病區(qū)域約20%～40%［13］。由此可見，ISR機制誘導(dǎo)劑在誘導(dǎo)匍匐翦股穎抗病性，具有高效、持久等特點。

3.2 2，3－BD用于誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性的有效構(gòu)型分析

研究結(jié)果表明，2，3－butanediol立體異構(gòu)體的混合物2，3－BD能夠有效誘導(dǎo)匍匐翦股穎產(chǎn)生抗病性。2，3－丁二醇的3種同分異構(gòu)體中，左旋體2R，3R－BD可以誘導(dǎo) 煙草抗 E.carotovorasub sp.carotovora SCC1，但不能夠?qū).syringaepv.tabaci產(chǎn)生抗性，其右旋體2S，3S－BD則對植物體沒有作用［17］。而 Choong－Min等研究認為2，3－butanediol的外消旋體（2R，3R－BD與2S，3S－BD 的混合物）可誘導(dǎo)擬南芥產(chǎn)生ISR［18］。綜上所述，2，3－butanediol及其同分異構(gòu)體誘導(dǎo)不同植物對多種病原菌產(chǎn)生抗性具有個體差異性，不同誘導(dǎo)劑的作用機理還需進一步研究。

3.3 2，3－BD誘導(dǎo)匍匐翦股穎抗鐮刀菌枯萎病的有效濃度分析

誘導(dǎo)劑的不同使用濃度對不同植物病害的防治效果差異顯著［19］。研究結(jié)果表明，250～450μmol/L的2，3－BD均對匍匐翦股穎有一定的誘導(dǎo)作用，其中250 μmol/L的2，3－BD的抗病效果顯著高于其他處理，表明施用誘導(dǎo)劑濃度的重要性。Song使用2R，3R－BD誘導(dǎo)煙草的ISR，設(shè)置1mg/株～100pg/株不同劑量，結(jié)果表明，2R，3R－BD 的劑量為100μg/株時抵抗由E.carotovora引起的軟腐病效果最佳，當劑量小于10 pg/株時不能誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生ISR［16］。Cortes－Barco等的研究表明，100μmol/L的2R，3R－BD可誘導(dǎo)本氏煙草抗由C.orbiculare引起的炭疽病，葉面病害面積降低77%［20］。試驗結(jié)果表明微量濃度的2，3－BD及其同分異構(gòu)體能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生ISR。

使用誘導(dǎo)劑誘發(fā)匍匐翦股穎抗病性，克服了抗病育種年限長、化學(xué)防治易造成環(huán)境污染和病菌的抗藥性等諸多缺點，具有抗性穩(wěn)定、持久、不污染環(huán)境等優(yōu)點。誘導(dǎo)植物抗病性涉及植物體內(nèi)復(fù)雜的反應(yīng)過程，在對誘導(dǎo)劑類型及誘導(dǎo)過程中信號分子類型、傳導(dǎo)途徑及抗病相關(guān)基因表達進行研究的同時，還需完善誘導(dǎo)劑的生物活性篩選體系、田間藥效實驗技術(shù)［21］。新型誘導(dǎo)劑產(chǎn)品的研發(fā)與應(yīng)用，將為開展節(jié)能、環(huán)保和低碳的草坪管理理念和市場運作模式提供技術(shù)支撐［22］。

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