紫外誘變篩選低自溶高產(chǎn)2，3-丁二醇的地衣芽孢桿菌突變子*

郭文逸，潘學(xué)瑋，尤甲甲，楊洪江

(天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)微生物教育部重點實驗室，天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津，300457)

微生物具有生產(chǎn)2，3-丁二醇的能力，其中肺炎克雷伯氏菌為常用的生產(chǎn)菌株，但該菌株為條件致病菌，不利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)［1］。地衣芽胞桿菌屬于GRAS(generally recognized as safe)菌株，具有生長繁殖迅速、代謝快、產(chǎn)生多種蛋白酶等特點，利于產(chǎn)物的快速生成，并且它能夠產(chǎn)生芽孢，抗逆性強［2］，所以近年來有越來越多關(guān)于地衣芽孢桿菌產(chǎn)2，3-丁二醇的報道。

在前期實驗中，篩選到1株地衣芽孢桿菌BL41［3］。發(fā)酵后期，發(fā)酵液的 OD600值逐漸下降，且逐漸變黏稠，與之相對應(yīng)，2，3-丁二醇的合成能力逐步下降。本文通過分析胞外多糖、聚谷氨酸產(chǎn)量以及細(xì)菌數(shù)量的變化，最終發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象主要由細(xì)胞自溶引起。因此推測，如果發(fā)酵后期細(xì)胞自溶水平下降，即可防止菌株生物量快速減少，2，3-丁二醇產(chǎn)率增加，從而提高2，3-丁二醇的產(chǎn)量。因此對該菌株進行紫外誘變，在篩選平板中獲得自溶水平低的突變株，進而篩選得到高產(chǎn)2，3-丁二醇的菌株。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L):酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10。MR-VP 培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨7，葡萄糖5，K2HPO45。種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖40，酵母粉10，硫酸銨1，K2HPO41。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖100，酵母粉5，蛋白胨 12，MnSO40.025，K2HPO43，MgSO40.2，乙酸鈉5。上述培養(yǎng)基pH值均為7.0，除LB培養(yǎng)基121℃滅菌20 min外，其余培養(yǎng)基均為115℃滅菌20 min。

自溶檢測培養(yǎng)基:將菌株BL41單菌落接種于600 mL的液體LB培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min培養(yǎng)3～4 h，菌體濃度達(dá)到108，100 ℃煮1 h，殺死細(xì)胞，于4 000 r/min離心10 min，棄去上清液，將菌體細(xì)胞加到200 mL無菌的LB瓊脂培養(yǎng)基中制備平板，用于篩選自溶水平低的突變株［4］。

1.2 實驗方法

1.2.1 胞外多糖和聚谷氨酸的測定

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用醇沉法沉淀發(fā)酵液中多糖，沉淀重懸制成多糖溶液，采用苯酚硫酸法測定其胞外多糖產(chǎn)量［5］。

采用生物傳感儀測定發(fā)酵液水解前后谷氨酸含量，其差值為 γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量［6］。

1.2.2 菌株生物量的測定

將單菌落進行兩級種子培養(yǎng)后，按5%的接種量轉(zhuǎn)接到30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，160 r/min培養(yǎng)，選取不同時間點取樣，稀釋10－6后涂布于LB平板上，37℃培養(yǎng)12 h，然后記錄菌落數(shù)。

1.2.3 紫外誘變篩選高產(chǎn)2，3-丁二醇菌株

將菌株BL41紫外誘變［3］后避光培養(yǎng)24 h，然后取100 μL轉(zhuǎn)接于新鮮LB中，37℃，220 r/min培養(yǎng)，每隔12 h轉(zhuǎn)接1次，轉(zhuǎn)接30代后將其稀釋涂板，避光培養(yǎng)48 h后觀察菌落周圍透明圈大小。選取自溶水平低的突變株進行肌酸比色實驗，從而獲得高產(chǎn)乙偶姻菌株［4］。將上述菌株分別進行兩級種子培養(yǎng)后接種于初始葡萄糖質(zhì)量濃度分別為100、120、140、160 g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基中，利用氣相色譜法分別測定36、42、48 h 時2，3-丁二醇產(chǎn)量，從而篩選高產(chǎn) 2，3-丁二醇菌株。

1.2.4 四聯(lián)發(fā)酵罐的分批補料實驗

為進一步確定突變株的生產(chǎn)能力，在四聯(lián)發(fā)酵罐中進行分批補料發(fā)酵，菌種經(jīng)過兩級種子培養(yǎng)后按5%接種量接入600 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為37℃，通氣量2 vvm。前期轉(zhuǎn)速為400 r/min，14 h后降低為200 r/min。通過補加一定量的葡萄糖，殘?zhí)菨舛染S持在30 g/L左右。初始pH為7.0，隨著發(fā)酵的進行，pH會先下降然后再上升，當(dāng)pH上升到6.5時，補加氨水使其降到6.0。

1.2.5 分析檢測方法

利用紫外分光光度計測定OD600。發(fā)酵上清液過膜后，稀釋100倍利用生物傳感儀測定葡萄糖濃度。發(fā)酵上清液過膜后，稀釋10倍利用氣相色譜法測定2，3-丁二醇和乙偶姻含量［3］。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞自溶導(dǎo)致生物量下降

地衣芽孢桿菌BL41在發(fā)酵過程中發(fā)酵液變黏稠，推測為其產(chǎn)生了胞外多糖或γ-聚谷氨酸。然而苯酚硫酸法結(jié)果顯示，發(fā)酵液中胞外多糖的含量僅為1.0 g/L，含量較低。因此，這不是發(fā)酵液黏稠的主要原因。通過生物傳感儀測定發(fā)酵液及其水解樣品中谷氨酸含量，結(jié)果顯示均為0.2 g/L，說明發(fā)酵液中無γ-聚谷氨酸產(chǎn)生，這也不是引起發(fā)酵液黏稠的原因。

進一步推測地衣芽孢桿菌BL41在發(fā)酵中存在細(xì)胞自溶現(xiàn)象，導(dǎo)致OD600值顯著下降和胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)等大分子釋放到培養(yǎng)基中，使發(fā)酵液變黏。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，12 h的發(fā)酵上清液中沒有DNA條帶產(chǎn)生，此時細(xì)胞處于對數(shù)期，沒有顯著自溶現(xiàn)象發(fā)生，無大分子物質(zhì)泄露到細(xì)胞外;而隨著發(fā)酵的進行，在24 h和48 h的樣品中，均出現(xiàn)大于15 kb的DNA條帶，特別是36 h樣品中的DNA數(shù)量要顯著多于24 h的樣品，且伴隨明顯的DNA降解現(xiàn)象(圖1)。

同時，采用涂板方法直接測定地衣芽孢桿菌BL41的生物量。發(fā)酵前期，細(xì)菌數(shù)量逐漸增加，12 h時達(dá)到最高，菌濃為3.9×109CFU/mL。隨后，細(xì)菌數(shù)量開始下降，至發(fā)酵結(jié)束時，細(xì)菌細(xì)胞數(shù)減少了48.7%(圖2)。

圖1 細(xì)胞自溶產(chǎn)生的胞外DNAFig.1 Extracellular DNA produced by autolysis

圖2 發(fā)酵過程中B.licheniformis BL41生物量Fig.2 Cell biomass of B.licheniformis BL41 during fermentation process

2.2 紫外誘變篩選自溶水平低的突變株

由上述結(jié)果得出，發(fā)酵后期，細(xì)胞大量死亡，導(dǎo)致生產(chǎn)2，3-丁二醇的生物量減少，從而降低2，3-丁二醇的生成。Nagraj以凍干細(xì)胞為底物，設(shè)計自溶篩選平板，通過觀察自溶圈大小，獲得不產(chǎn)自溶素的菌株［4］。然而冷凍干燥法耗時過長，獲得細(xì)胞干粉量較小，因此本文對其進行改造。

菌株BL41的細(xì)胞加熱死亡后，以死細(xì)胞及細(xì)胞碎片作為底物加入到LB瓊脂培養(yǎng)基中，倒平板備用。將菌液稀釋后均勻涂布于上述平板，觀察菌落周圍透明圈大小。如圖3所示，中間白色部分為單菌落，而菌落周圍的黑色部分則為自溶素裂解細(xì)胞產(chǎn)生的透明圈，其中圖(A)和(B)分別表示出發(fā)菌株和突變菌株的自溶圈，兩菌落直徑大小相似，然而明顯可以看出，出發(fā)菌株的透明圈較大。

透明圈直徑與菌落直徑之比可以表征菌株自溶水平高低，比值越高說明自溶水平越高。通過紫外誘變的方法，獲得自溶水平低的突變株。在自溶篩選平板上共得到220株突變子，其中61株突變子的透明圈直徑/菌落直徑比值小于出發(fā)菌株1.57，結(jié)果如表1所示。

圖3 篩選平板上菌落周圍的透明水解圈Fig.3 Transparent zones around the colonies on the screen plate

表1 突變子的相對自溶水平分析Table 1 Analysis of the relative autolysis level of the mutants

2.3 肌酸比色法篩選高產(chǎn)乙偶姻的菌株

將上述31株透明圈直徑/菌落直徑比值小于1.29的突變子進行肌酸比色實驗，分析乙偶姻含量，從而快速大量篩選出高產(chǎn)乙偶姻菌株，減少復(fù)篩工作量。其結(jié)果如圖4所示，菌株 BL41-103，BL41-105，BL41-122，BL41-196，BL41-202，BL41-213，BL41-216的乙偶姻產(chǎn)量最高，均高于出發(fā)菌株BL41。

圖4 突變子合成乙偶姻的水平Fig.4 Analysis of acetoin production in mutants

2.4 搖瓶發(fā)酵篩選高產(chǎn)2，3-丁二醇的菌株

選取乙偶姻產(chǎn)量高的菌株，進一步通過搖瓶發(fā)酵分析其2，3-丁二醇產(chǎn)量。然而，不同菌株的葡萄糖利用能力不同，因此采用不同的初始葡萄糖濃度進行發(fā)酵。由表2所示，發(fā)酵36 h時，除BL41-103外，大部分菌株在100 g/L的初始葡萄糖濃度下獲得最高2，3-丁二醇產(chǎn)量，然而隨葡萄糖濃度的升高，其產(chǎn)量下降。菌株BL41-213在36 h時2，3-丁二醇產(chǎn)量最高，為54.6 g/L，相比于出發(fā)菌株提高了34.2%。

表2 初始葡萄糖質(zhì)量濃度對2，3-丁二醇產(chǎn)量的影響Table 2 Effect of initial glucose concentration on 2，3-butanediol production

發(fā)酵42 h時，在初始葡萄糖質(zhì)量濃度為100 g/L的情況下，菌株的乙偶姻產(chǎn)量升高，而2，3-丁二醇產(chǎn)量下降?？赡苁怯捎谂囵B(yǎng)基中葡萄糖消耗完后，生成的2，3-丁二醇作為儲備碳源可逆的轉(zhuǎn)化為乙偶姻。而此時，初始葡萄糖濃度大于100 g/L的培養(yǎng)基中，由于葡萄糖未耗盡，仍有2，3-丁二醇生成，因此其產(chǎn)量均較高。

大部分菌株在120 g/L的初始葡萄糖質(zhì)量濃度下，發(fā)酵48 h獲得最大2，3-丁二醇產(chǎn)量。其中菌株BL41-196的2，3-丁二醇的產(chǎn)量達(dá)到54.7 g/L，為發(fā)酵過程中的最高值。而BL41-103的2，3-丁二醇產(chǎn)量在48 h，初始葡萄糖質(zhì)量濃度為100 g/L時最高，達(dá)到44.1 g/L。

大部分菌株在初始葡萄糖質(zhì)量濃度為140 g/L和160 g/L時，2，3-丁二醇的產(chǎn)量普遍低于100 g/L和120 g/L時的產(chǎn)量。底物濃度過高，抑制了2，3-丁二醇的生成。

2.5 四聯(lián)發(fā)酵罐發(fā)酵篩選高產(chǎn)2，3-丁二醇菌株

為進一步確定突變株的生產(chǎn)能力，對上述3株高產(chǎn)2，3-丁二醇菌株 BL41-103，BL41-196和 BL41-213進行四聯(lián)發(fā)酵罐的擴大培養(yǎng)，并以出發(fā)菌株BL41為對照。

由圖5(A)所示，發(fā)酵前20 h時，4株菌的2，3-丁二醇產(chǎn)量近似相等，此后，2，3-丁二醇產(chǎn)量則出現(xiàn)差別。BL41-103在發(fā)酵36 h時即達(dá)到最高產(chǎn)量，為60.3 g/L，比出發(fā)菌株 BL41提高了25.9%，此后，BL41-103的2，3-丁二醇產(chǎn)量即開始下降。除BL41-103外，其余3株菌的2，3-丁二醇產(chǎn)量均在44 h時達(dá)到最高值，其中BL41-196的2，3-丁二醇產(chǎn)量最高，為 65.1 g/L，比出發(fā)菌株提高了 36.0%。而BL41-213的產(chǎn)量為56.1 g/L，僅比菌株BL41提高了17.1%。

發(fā)酵時間為24 h時，BL41-196的產(chǎn)率達(dá)到最高，并且維持1.7 g/(L· h)長達(dá)12 h。而BL41-213也在24 h時達(dá)到最高產(chǎn)率1.7 g/(L·h)，此后，2，3-丁二醇產(chǎn)率則快速下降。BL41-103在28 h時產(chǎn)率為1.7 g/(L·h)，并在此產(chǎn)率下維持8 h，發(fā)酵36 h后產(chǎn)率則快速下降，因此，BL41-103在較短時間內(nèi)達(dá)到最大2，3-丁二醇產(chǎn)量。BL41在24 h時達(dá)到最高產(chǎn)率1.4 g/(L·h)，然后，其產(chǎn)率開始下降(圖5(B))。

發(fā)酵過程中，副產(chǎn)物乳酸和乙偶姻的產(chǎn)量如圖6(A、B)所示。發(fā)酵后期，2，3-丁二醇產(chǎn)量開始下降，轉(zhuǎn)化為乙偶姻，因此乙偶姻的產(chǎn)量呈逐漸上升趨勢，但是整個發(fā)酵過程中其產(chǎn)量都低于3 g/L。乳酸的產(chǎn)量則略高，最高達(dá)到12 g/L。

圖5 四聯(lián)發(fā)酵罐發(fā)酵分析2，3-丁二醇的產(chǎn)量和產(chǎn)率Fig.5 Production and productivity of 2，3-BD for mutant strains in multifors

圖6 四聯(lián)發(fā)酵罐發(fā)酵的副產(chǎn)物產(chǎn)量Fig.6 Production of the byproducts of the mutants in fermentation process with a multifors bioreactor

2.6 突變株生物量的測定

上述發(fā)酵進行到20 h后，細(xì)胞自溶現(xiàn)象明顯，四株菌的OD600均在此時開始下降，其中BL41-103的OD600由14.6下降為12.1。而其余3株菌的OD600則近似相等，均由12.6左右降至11.0左右。同時，由于發(fā)酵后期營養(yǎng)成分的不足及副產(chǎn)物的積累，細(xì)胞開始死亡，這兩種原因?qū)е录?xì)胞生物量快速下降。

如圖7所示，四株菌在發(fā)酵后期細(xì)菌數(shù)量均下降，其中菌株BL41的細(xì)胞死亡率最高，發(fā)酵36 h時為36.5%，而另外 3株菌(BL41-103，BL41-196，BL41-213)的死亡率分別為 29.0%，23.5% 和31.0%，均小于出發(fā)菌株BL41。菌株BL41-196的細(xì)胞死亡率最低，且其最終細(xì)菌濃度高于BL41，而該菌株的2，3-丁二醇產(chǎn)量最高，生物量與代謝產(chǎn)物的生成保持一致。BL41-103的細(xì)胞死亡率也較低，并且在發(fā)酵前期BL41-103的生長速率高于另外三株菌，因此其在短時間內(nèi)獲得較高2，3-丁二醇產(chǎn)量。盡管最終菌株BL41-213細(xì)菌數(shù)量少于出發(fā)菌株，但其細(xì)胞死亡率小于出發(fā)菌株BL41，因此其2，3-丁二醇產(chǎn)量也略高于出發(fā)菌株。

圖7 突變株的生物量變化Fig.7 Biomass production of mutant strains during fermentation

3 討論

地衣芽孢桿菌在植物病害防治、飼料加工、醫(yī)藥開發(fā)等多方面具有廣泛應(yīng)用，是非常具有應(yīng)用價值的菌株［7］，其在2，3-丁二醇生產(chǎn)上也有很大潛力。早在1992年，就有研究利用地衣芽孢桿菌生產(chǎn)2，3-丁二醇，發(fā)酵72 h后，其2，3-丁二醇的產(chǎn)量為47 g/100 g，為當(dāng)時的最高產(chǎn)量［8］。而在地衣芽孢桿菌NCIMB 8059中則得到最優(yōu)培養(yǎng)條件，溫度為37℃，pH 為6.0，接種量10 g/L，初始底物濃度30 g/L［9］。

自溶素普遍存在于細(xì)菌之中，它參與細(xì)菌的生長發(fā)育、細(xì)胞分離、孢子形成等重要生理活動［10］。自溶現(xiàn)象在芽孢桿菌中也有多種應(yīng)用，如蠟狀芽孢桿菌群中，通過不同pH條件下自溶現(xiàn)象的不同，對其進行分類［11］。在蘇云金芽孢桿菌中，利用細(xì)胞壁錨定結(jié)合性能的自溶素作為運載蛋白，構(gòu)建芽孢桿菌的表面展示系統(tǒng)［12］。然而，菌體自溶對發(fā)酵過程卻具有不良影響。乳酸桿菌的高密度培養(yǎng)過程中，由于菌體自溶，活菌數(shù)很難達(dá)到較高的增殖水平［13］。而且，自溶素對細(xì)胞壁的水解作用導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂出現(xiàn)孔洞，胞內(nèi)容物，如DNA、RNA等，流失到細(xì)胞外［14］。而胞外DNA在菌體表面間起到了粘結(jié)作用，致使發(fā)酵液變黏［15］。

本研究通過分析發(fā)酵后期培養(yǎng)液粘稠現(xiàn)象產(chǎn)生的原因，證實了該菌株在發(fā)酵期間細(xì)胞自溶現(xiàn)象比較嚴(yán)重。而在金黃色葡萄球菌中，通過轉(zhuǎn)座子Tn917-lacZ隨機誘變，獲得了2株無法合成自溶素的缺陷型突變株［4］。由于紫外誘變的方法方便簡單，因此本文利用紫外誘變篩選自溶水平降低的突變子，并從這些突變子中挑選出乙偶姻合成水平較高的菌株，最終突變子產(chǎn)2，3-丁二醇水平較出發(fā)菌株有了明顯提高。本研究首次將降低細(xì)胞自溶水平、提高發(fā)酵過程中生物量和提高2，3-丁二醇產(chǎn)量聯(lián)系在一起，取得了較好的結(jié)果。

4 結(jié)論

本研究通過紫外誘變，成功地篩選出自溶水平較低的突變子，并從中進一步篩選出2，3-丁二醇的高產(chǎn)菌株。本研究結(jié)果顯示，通過降低菌株的自溶水平，增加發(fā)酵過程中的生物量，是提高發(fā)酵水平的一條重要途徑。

［1］ 林璐.基于知識圖譜的生物制造2，3-丁二醇研究態(tài)勢分析［J］.情報探索，2014(3):28－31.

［2］ 張幟，李理想，馬翠卿.芽胞桿菌發(fā)酵產(chǎn)2，3-丁二醇的研究進展及展望［J］.生物加工過程，2014，12(3):79－86.

［3］ 郭文逸，孫慶惠，宋麗娜，等.地衣芽孢桿菌高產(chǎn)2，3-丁二醇菌株的選育和發(fā)酵研究［J］.生物技術(shù)通報，2014，8:159－163.

［4］ Nagraj M，Philip T.Isolation and characterization of autolysis-defective mutants of Staphylococcas aureus created by Tn917-lacZ［J］.Journal of Bacteriology，1993，175(5):1 493－1 497.

［5］ 張曉玲，牟光慶.響應(yīng)面法優(yōu)化枯草芽孢桿菌產(chǎn)胞外多糖培養(yǎng)基［J］.食品工業(yè)科技，2012，33(15):133－138.

［6］ 繆靜，楊在東.碳源對 γ-聚谷氨酸發(fā)酵的影響［J］.中國釀造，2010(3):70－72.

［7］ 唐娟，張毅.地衣芽孢桿菌應(yīng)用研究進展［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，47(3):351 －354.

［8］ S.Nilegaonkar.Production of 2，3-butanediol from glucose by Bacillus licheniformis［J］.World Journal of Microbiology and Biotechnology，1992，8(4):378 －381.

［9］ Perego P.Effects of temperature，inoculum size and starch hydrolyzate concentration on butanediol production by Ba-cillus licheniformis［J］.Bioresource Technology，2003，89(2):125–131.

［10］ 劉申.細(xì)菌自溶素的研究進展［J］.中國實用醫(yī)藥，2009，4(12):226 －228.

［11］ Raddadi N，Cherif A.The autolytic phenotype of the Bacillus cereus group［J］.Journal of Applied Microbiology，2005，99(5):1 070 －1 081.

［12］ 邵小虎.蘇云金芽胞桿菌自溶素蛋白用于構(gòu)建表面展示系統(tǒng)的研究［J］.武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

［13］ 李艾黎，鄧凱波，霍貴成.環(huán)境因素對酸奶菌株自溶的影響［J］.微生物學(xué)通報，2008，35(8):1 262－1 267.

［14］ 馮鎮(zhèn).乳酸菌自溶影響因素及機理研究［D］.哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003.

［15］ 黃炎.胞外DNA在細(xì)菌生物膜形成中的作用［J］.國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2013，34(24):3 380－3 382.

［16］ Stomer F C.The pH 6 Acetolactate-forming enzyme from Aerobacter aerogenes:I.kinetic studies［J］.Journal of Biological Chemistry，1968，243(13):3 735 －3 739.

［17］ ZHANG X，BAO T，RAO Z，et al.Two-stage pH control strategy based on the pH preference of acetoin reductase regulates acetoin and 2，3-butanediol distribution in Bacillus subtilis［J］.PLoS One，2014，9(3):91187.

［18］ Kaloyan Petrov，Penka Petrova.Enhanced production of 2，3-butanediol from glycerol by forced pH fluctuations［J］.Applied Microbiology Biotechnology，2010，87(3):943-949.