高產(chǎn)蝦青素的雨生紅球藻脅迫條件和中試研究*

廖興輝，王明茲，2，3，李小妹，黃鍵，2，3，傅燕秋，陳必鏈，2，3，鄭行

1(福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建福州，350117)2(福建師范大學(xué)工業(yè)微生物教育部工程研究中心，福建福州，350117)3(福建省現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)工程研究中心，福建 福州，350117)4(福清市新大澤螺旋藻有限公司，福建福清，350300)

蝦青素由于具有超強(qiáng)的抗氧化能力和出色的著色能力，被廣泛地運(yùn)用到水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)、化妝品行業(yè)、健康食品行業(yè)和制藥行業(yè)［1－4］。雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)是一種常見的生存于淡水中的單細(xì)胞綠藻，生長周期中明顯地呈現(xiàn)出2個(gè)階段:在生長條件適宜的情況下，以綠色帶鞭毛的可游動(dòng)細(xì)胞形態(tài)大量繁殖;在生長環(huán)境不利的情況下，綠色游動(dòng)細(xì)胞逐漸喪失鞭毛，細(xì)胞壁加厚，形成紅色包囊，同時(shí)細(xì)胞質(zhì)油脂小泡中大量積累蝦青素。在不利條件下積累蝦青素的含量可高達(dá)干重的5%［5］，并且具有所需營養(yǎng)簡單的特點(diǎn)，因此被認(rèn)為是生產(chǎn)蝦青素最好的自然資源。

然而與螺旋藻、小球藻等已工業(yè)化生產(chǎn)的微藻相比，雨生紅球藻由于生長緩慢、生長溫度較低、易受污染等原因使得大規(guī)模高密度培養(yǎng)受到限制［6－7］，同時(shí)這也是如何利用雨生紅球藻實(shí)現(xiàn)蝦青素高產(chǎn)的研發(fā)熱點(diǎn)與難點(diǎn)。國外有少數(shù)幾家企業(yè)能夠商業(yè)化培養(yǎng)雨生紅球藻，但它們對技術(shù)實(shí)行了嚴(yán)格的保密，形成壟斷［8］。國內(nèi)也有不少的研究者對雨生紅球藻進(jìn)行了研究，但所得到的蝦青素含量和生物量都比較低［9－15］。

本文對1株高產(chǎn)蝦青素的雨生紅球藻脅迫培養(yǎng)條件進(jìn)行研究，在此基礎(chǔ)上，于2013年8月～2014年1月到位于四川省米易縣的宇昌微藻有限公司采用平板式光照生物反應(yīng)器進(jìn)行中試實(shí)驗(yàn)，以期為該雨生紅球藻的大規(guī)模培養(yǎng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藻種

實(shí)驗(yàn)用雨生紅球藻藻種保存于本研究室。

1.2 脅迫條件對雨生紅球藻積累蝦青素的影響

500 mL三角瓶裝200 mL培養(yǎng)液，培養(yǎng)基為BG11，培養(yǎng)溫度(25±2)℃，日光燈提供光照，光強(qiáng)900～1 100 Lux，每天振搖3次，培養(yǎng)14 d。將細(xì)胞濃度調(diào)整至2.5×105個(gè)/mL的藻液作為接種液，按接種液和新鮮培養(yǎng)基的體積之比1∶4，將接種液接種至各脅迫培養(yǎng)基中，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

氮、磷饑餓對雨生紅球藻積累蝦青素的影響，采用含原培養(yǎng)基1/10、1/5和不含氮、磷的BG11培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度(25±2)℃，每天搖3次，在光照強(qiáng)度4 000～6 000 Lux下連續(xù)脅迫培養(yǎng)11 d，以完整的BG11培養(yǎng)基培養(yǎng)作為對照。

進(jìn)行鹽濃度脅迫時(shí)，采用含NaCl質(zhì)量濃度為4、6和8 g/L的BG11培養(yǎng)基，以不含NaCl的基本BG11培養(yǎng)基作為對照，其余條件與氮、磷饑餓時(shí)相同。

光照強(qiáng)度對雨生紅球藻積累蝦青素的影響，采用4 000～6 000 Lux(I1)、6 000 ～8 000 Lux(I2)、8 000 ～10 000 Lux(I3)3個(gè)范圍的光照，使用基本的BG11培養(yǎng)基與完全缺氮培養(yǎng)基培養(yǎng)，其余條件與氮、磷饑餓時(shí)相同。

裝液量對雨生紅球藻積累蝦青素的影響，用500 mL三角瓶作為培養(yǎng)容器，使用基本BG11在4 000～6 000 Lux光照強(qiáng)度下培養(yǎng)，完全缺氮和缺磷培養(yǎng)基在6 000～8 000 Lux光照強(qiáng)度下培養(yǎng)，設(shè)置接種后總體積分別為100、150、200 mL三個(gè)實(shí)驗(yàn)組，其余條件與氮、磷饑餓對雨生紅球藻積累蝦青素的影響相同。

1.3 平板式光照生物反應(yīng)器培養(yǎng)雨生紅球藻

利用自行構(gòu)建的平板式光照生物反應(yīng)器培養(yǎng)雨生紅球藻，反應(yīng)器由支架框、PE材質(zhì)透明袋、曝氣系統(tǒng)、取樣管四部分構(gòu)成。在營養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)階段采用長1 m、寬0.1 m、高1 m的平板式生物反應(yīng)器，使用BG11培養(yǎng)基，培養(yǎng)液體積為40 L，以8 L/min的通氣量通入空氣，光強(qiáng)為4 000～5 000 Lux，每日取樣測量生物量。在脅迫階段采用長1 m、寬0.06 m、高1 m的平板式光照生物反應(yīng)器，使用缺氮的BG11培養(yǎng)基，培養(yǎng)液體積為50 L。每天10∶30～16∶30于室外通過增減表面遮蓋的透光性良好的PE薄膜袋數(shù)量來控制光強(qiáng)，利用增大表面通風(fēng)量的方法控制溫度不超過27℃。每天16∶30至次日10∶30將反應(yīng)器搬至恒溫室內(nèi)［(25±2)℃］，由日光燈從兩側(cè)提供光照，光強(qiáng)為8 000～10 000 Lux，以10 L/min的通氣量通入空氣，每隔48 h取樣測量生物量及蝦青素含量。

1.4 生長指標(biāo)測定

1.4.1 細(xì)胞計(jì)數(shù)

按照金傳蔭等的方法，用“浮游生物計(jì)數(shù)框”進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)［9］。

1.4.2 細(xì)胞干重的測定

取30 mL 藻液，8 000 r/min，4 ℃，離心 15 min，去上清液，蒸餾水洗滌1次，置于70℃烘箱內(nèi)烘至恒重，冷卻后稱重。

1.4.3 蝦青素含量與濃度的測定

參照Boussiba等的方法，使用DMSO作為萃取劑，測量藻細(xì)胞中蝦青素的含量與培養(yǎng)液中蝦青素濃度［16］。

1.4.4 生產(chǎn)率的測定

生產(chǎn)率［g/(L·d)］計(jì)算:

其中DWt和DW0分別指培養(yǎng)t天和起始生物量干重，g/L;t指培養(yǎng)時(shí)間，d。

2 結(jié)果與討論

2.1 脅迫條件對雨生紅球藻積累蝦青素的影響

促進(jìn)雨生紅球藻積累蝦青素的方法中，營養(yǎng)饑餓處理和高光處理較為容易實(shí)現(xiàn)且效果明顯。不同脅迫條件對雨生紅球藻積累蝦青素的影響見圖1。

從圖1－A中可以看出，蝦青素濃度隨著培養(yǎng)基中氮含量的下降而上升，在不含氮的培養(yǎng)條件下，蝦青素濃度可達(dá)到(13.92±0.24)mg/L。缺氮之所以能夠引起雨生紅球藻積累蝦青素，董慶霖等認(rèn)為是由于培養(yǎng)基中氮濃度下降到一定程度時(shí)會抑制1，5-二磷酸核酮糖羧化酶和硝酸還原酶的活性，當(dāng)兩種酶的活性下降到一定水平時(shí)會引發(fā)雨生紅球藻積累蝦青素［10］;同時(shí)缺氮情況下1，5-二磷酸核酮糖羧化酶作為氮庫為蝦青素的積累提供氮源［11］。同氮饑餓處理一樣蝦青素濃度隨著培養(yǎng)基中磷含量的下降而上升，在不含磷的培養(yǎng)條件下，蝦青素濃度可達(dá)到(17.52±1.43)mg/L(見圖1－B)。缺磷有助于雨生紅球藻從游動(dòng)細(xì)胞轉(zhuǎn)向不動(dòng)包囊體細(xì)胞，同時(shí)有效地刺激蝦青素的合成［17］。

從圖1－C中可以看出，蝦青素濃度先隨著NaCl濃度的增加而增加，但NaCl濃度超過6 g/L時(shí)，隨著NaCl濃度的增加會引起蝦青素含量的下降。這是由于NaCl在較低濃度時(shí)可以在不損壞藻細(xì)胞的情況下促進(jìn)蝦青素的積累，而當(dāng)NaCl濃度過高時(shí)，藻體細(xì)胞會完全失去繁殖能力甚至裂解死亡［18］。最適合該藻積累蝦青素的NaCl質(zhì)量濃度為6 g/L，蝦青素質(zhì)量濃度達(dá)(13.86±0.83)mg/L。

從圖1－D中可以看到，高光強(qiáng)對雨生紅球藻積累蝦青素的影響，在基本培養(yǎng)基中，蝦青素濃度在光強(qiáng)4 000～6 000 Lux和光強(qiáng)6 000～8 000 Lux的培養(yǎng)條件下無明顯區(qū)別，分別為(8.32±0.12)mg/L和(8.02±0.37)mg/L。而在缺氮培養(yǎng)基中，6 000～8 000 Lux光強(qiáng)的培養(yǎng)條件下的蝦青素濃度為(22.98±0.11)mg/L，比4 000～6 000 Lux光強(qiáng)的培養(yǎng)條件下高出66.34%。無論是在基本培養(yǎng)基或缺氮培養(yǎng)基，光強(qiáng)超過8 000 Lux時(shí)蝦青素濃度會出現(xiàn)明顯的下降。這是因?yàn)楣鈴?qiáng)過高時(shí)會損害藻體細(xì)胞積累蝦青素的能力，并引起細(xì)胞死亡［19］。才金玲等單獨(dú)使用高光脅迫培養(yǎng)雨生紅球藻，最終得到的蝦青素含量為 0.62%(干重比)，生物量為 0.44 g/L［12］;莊惠如等結(jié)合氮饑餓和高光脅迫培養(yǎng)，得到的蝦青素含量為6.34 mg/L［13］。本實(shí)驗(yàn)在光強(qiáng) 6 000 ～8 000 Lux、缺氮、培養(yǎng)液體積為100 mL/500 mL三角瓶的條件下得到的蝦青素含量和生物量都比上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果高，但低于Boussiba等使用缺氮或缺磷結(jié)合高光處理的方法，得到蝦青素含量超過100 mg/L的實(shí)驗(yàn)結(jié)果［20］，以及Kang等人采用高光、缺氮、通入含5%CO2的空氣、培養(yǎng)液體積為130 mL(500 mL三角瓶)培養(yǎng)時(shí)得到的蝦青素含量大于7%，生物量為2.28 g/L的實(shí)驗(yàn)結(jié)果［21］。

圖1 脅迫條件對雨生紅球藻積累蝦青素的影響Fig.1 Effects of stress induced conditions on the accumulation of astaxanthin in Haematococcus pluvialis

裝液體積的變化會影響光徑和培養(yǎng)液中氣體的交換，進(jìn)而影響藻體細(xì)胞的生長和蝦青素的積累。從圖1－E可以看到，無論是在基本培養(yǎng)基還是缺氮、缺磷培養(yǎng)基中，蝦青素的濃度都隨著培養(yǎng)體積的增加而下降，培養(yǎng)液體積為100 mL時(shí)最適合該藻積累蝦青素，配合缺氮、6 000～8 000 Lux光強(qiáng)脅迫培養(yǎng)時(shí)，蝦青素濃度為(59.23±2.13)mg/L，可達(dá)藻細(xì)胞干重的(4.20±0.19)%。

在綜合各單因子實(shí)驗(yàn)得出的條件下脅迫培養(yǎng)雨生紅球藻12 d，蝦青素的積累情況如圖1－F所示，雨生紅球藻中的蝦青素含量在前10天都在增加，第10天達(dá)到最高水平為(4.16±0.25)%;而生物量一直都在增加，到第12天達(dá)到(1.1±0.02)g/L，蝦青素質(zhì)量濃度最終為(44.58±2.68)mg/L。

2.2 平板式光照生物反應(yīng)器中雨生紅球藻的生長情況

實(shí)驗(yàn)于(25±2)℃恒溫室內(nèi)進(jìn)行。從圖2可以看到，在平板式反應(yīng)器中，當(dāng)接種濃度為OD681=0.24時(shí)，雨生紅球藻生長過程未有明顯的生長延滯期，接種后進(jìn)入對數(shù)生長階段直到12 d，期間生產(chǎn)率為0.048 5 g/(L·d)，第13天后進(jìn)入平穩(wěn)期，大部分細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)椴粍?dòng)孢子，最終生物量可達(dá)到0.88 g/L。當(dāng)接種濃度為OD681=0.14時(shí)，前3天為生長延滯期，從第4天到第8天為對數(shù)生長時(shí)期，而后進(jìn)入平穩(wěn)期。這主要是由于接種濃度較高時(shí)，可使藻細(xì)胞較快地適應(yīng)新的培養(yǎng)環(huán)境。

采用半室外條件下平板式反應(yīng)器培養(yǎng)雨生紅球藻，實(shí)驗(yàn)于與外界氣溫相同，但無陽光直射的房間內(nèi)進(jìn)行，光照主要由自然光提供，附加日光燈，確保光強(qiáng)度為4 000 ～5 000 Lux，每日最低溫度于4∶00 ～5∶00測得，最高溫度于14∶00～15∶00測得。由于溫度的變化，雨生紅球藻的生長情況與在室內(nèi)恒溫條件下有所不同。從表1中可以看出在半室外條件下，當(dāng)接種濃度為OD681=0.24，藻細(xì)胞經(jīng)過1天的適應(yīng)后開始快速生長直至第13天，前13天的生產(chǎn)率為0.057 1 g/(L·d)，14 d后進(jìn)入生長穩(wěn)定期，藻細(xì)胞大部分轉(zhuǎn)變?yōu)椴粍?dòng)孢子，最終生物量為1.04 g/L。

圖2 室內(nèi)平板式光生物反應(yīng)器中雨生紅球藻的生長曲線Fig.2 The growth curve of Haematococcus pluvialis in indoor flat-photobioreactor

表1 半室外平板式光照生物反應(yīng)器中雨生紅球藻的生長Table 1 The growth of Haematococcus pluvialis in flatphotobioreactor in semi-outdoor process

在半室外培養(yǎng)雨生紅球藻綠色細(xì)胞時(shí)，在接種濃度較低時(shí)(OD681=0.14)，幾乎無法生長。

2.3 平板式光照生物反應(yīng)器中雨生紅球藻積累蝦青素情況

由于室外晝夜溫差較大且室內(nèi)光強(qiáng)無法脅迫平板式光照生物反應(yīng)器內(nèi)的藻細(xì)胞變紅，因此采取半室外的脅迫培養(yǎng)方式，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2和圖3。

表2 半室外脅迫培養(yǎng)過程中雨生紅球藻積累蝦青素Table 2 Astaxanthin accumulated in Haematococcus pluvialis in stress induced process and semi-outdoor condition

圖3 半室外脅迫培養(yǎng)過程中雨生紅球藻生物量和蝦青素生產(chǎn)率的變化Fig.3 The biomass and astaxanthin productivities of Haematococcus pluvialis in stress induced process and semi-outdoor condition

從表2可看到在脅迫起始階段(開始2 d)蝦青素的含量會有所下降，這是由于在脅迫起始階段的光強(qiáng)偏弱，且培養(yǎng)液中的氮源仍未消耗完全，導(dǎo)致藻細(xì)胞仍可以分裂繁殖;而后隨著光強(qiáng)的提高，藻細(xì)胞繁殖受到抑制，細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榘覡顟B(tài)開始較快地積累蝦青素，培養(yǎng)16 d，蝦青素生產(chǎn)率為1.05 mg/(L·d)，最終蝦青素濃度可達(dá)到17.49 mg/L，生物量為1.17 g/L。

在半室外脅迫變紅過程中，生物量的生產(chǎn)率先隨著光強(qiáng)的增加而提高，在第6天時(shí)達(dá)到最大值0.086 g/(L·d)，而后隨著光強(qiáng)的增加而下降。這主要是由于在脅迫培養(yǎng)前期光照較弱，部分藻細(xì)胞仍能分裂繁殖，隨著光照強(qiáng)度的提高，藻細(xì)胞受到的脅迫壓力逐漸增大，細(xì)胞繁殖功能受影響，造成生物量增加但產(chǎn)率下降。蝦青素生產(chǎn)率由藻體生物量和藻細(xì)胞中的蝦青素含量共同決定，因此蝦青素生產(chǎn)率的變化和生物量的不同。脅迫培養(yǎng)前6天，由于生物量和藻細(xì)胞中蝦青素含量的快速增加，蝦青素生產(chǎn)率快速提高，從第6到第8天雖然藻生物量的增加幅度變小，但藻細(xì)胞中蝦青素的積累仍十分迅速，致使此時(shí)間段蝦青素生產(chǎn)率仍快速增長。第8天后由于藻生物量增長速度和藻細(xì)胞中蝦青素積累速度放緩，造成蝦青素生產(chǎn)率下降，而后進(jìn)入緩慢增長階段(見圖3)。

李曉夢等利用混養(yǎng)培養(yǎng)的方法在室外實(shí)現(xiàn)了雨生紅球藻的擴(kuò)大培養(yǎng)，其放大規(guī)模(10 L)下所得到的藻粉產(chǎn)量(0.20 g/L)和蝦青素含量(0.86%)均低于本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果［14］;沈淵等在室內(nèi)利用氣升式光生物反應(yīng)器培養(yǎng)雨生紅球藻取得了單位體積蝦青素產(chǎn)量和本實(shí)驗(yàn)相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果(18 mg/L)，但擴(kuò)大規(guī)模僅為20 L，且反應(yīng)器結(jié)構(gòu)復(fù)雜、造價(jià)昂貴(NHL-Ⅲ型光生物反應(yīng)器)［15］;WANG等利用氣升式光生物反應(yīng)器培養(yǎng)雨生紅球藻，在室外擴(kuò)大培養(yǎng)中得到了高達(dá)160 mg/L的蝦青素濃度，但放大規(guī)模僅為0.6 L［22］;劉偉等利用生物幕技術(shù)成功地進(jìn)行了雨生紅球藻的規(guī)模化培養(yǎng)，培養(yǎng)體積在營養(yǎng)階段達(dá)到40 t，但脅迫變紅的生物幕技術(shù)使用固定化培養(yǎng)，造成生物量低［23］。

3 結(jié)論

脅迫條件探究實(shí)驗(yàn)表明，完全缺氮有利于雨生紅球藻積累蝦青素，蝦青素產(chǎn)量可達(dá)到(13.92±0.24)mg/L。完全缺磷有利于雨生紅球藻積累蝦青素，蝦青素產(chǎn)量可達(dá)到(17.52±1.43)mg/L。NaCl脅迫培養(yǎng)時(shí)，藻細(xì)胞中蝦青素的含量隨著NaCl濃度的增加而升高，但濃度過高時(shí)會對藻細(xì)胞的生長產(chǎn)生抑制，甚至引起藻體的裂解死亡，最適合此藻積累蝦青素的氯化鈉濃度為6 g/L，蝦青素產(chǎn)量可達(dá)到(13.86±0.83)mg/L。光強(qiáng)在較低水平時(shí)可以提高蝦青素在藻細(xì)胞中的含量，當(dāng)光強(qiáng)超過8 000 Lux時(shí)不僅會抑制藻細(xì)胞的生長還會損害其積累蝦青素的能力，適合此藻積累蝦青素的光強(qiáng)為6 000～8 000 Lux，在缺氮情況下可獲得(22.98±0.11)mg/L的蝦青素產(chǎn)量。培養(yǎng)液體積的改變可通過改變光徑和氣體的交換影蝦青素在藻中的積累，100 mL的裝液體積培養(yǎng)時(shí)蝦青素濃度可到達(dá)(20.29±1.01)mg/L。綜合上述各因子最優(yōu)條件脅迫培養(yǎng)時(shí)，蝦青素濃度為(44.58±2.68)mg/L。

利用平板式光照生物反應(yīng)器進(jìn)行中試試驗(yàn)。在綠色細(xì)胞培養(yǎng)階段，使用平板式光照生物反應(yīng)器在室內(nèi)和半室外培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)液中的生物量可達(dá)到0.88 g/L與1.04 g/L，在進(jìn)入穩(wěn)定期前生產(chǎn)率分別為0.048 5 g/(L·d)和0.057 1 g/(L·d);在脅迫變紅階段，使用平板式光照生物反應(yīng)器在半室外的培養(yǎng)條件下生物量可達(dá)到1.17 g/L，藻細(xì)胞中蝦青素含量為1.49%，單位體積蝦青素產(chǎn)量為17.49 mg/L，蝦青素生產(chǎn)率為1.05 mg/(L·d)。

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