一株鐵還原菌FeRB-FL1404的分離和鑒定及其去除高嶺土中Fe(Ⅲ)研究

林玉滿，陳小嵐， 魏招娣，許旭萍（.福建師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 50007；.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 50007；.福建師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，福建 福州 50007）

一株鐵還原菌FeRB-FL1404的分離和鑒定及其去除高嶺土中Fe(Ⅲ)研究

林玉滿1，陳小嵐2， 魏招娣3，許旭萍2
（1.福建師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 350007；2.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350007；3.福建師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，福建 福州 350007）

【摘 要】以高嶺土為選擇性培養(yǎng)基，從錳礦樣品中分離到一株能夠還原高嶺土中Fe(Ⅲ)的鐵還原菌FeRBFL1404。經(jīng)形態(tài)特征觀察、生理生化特征和16S rDNA序列分析，鑒定其為短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)?？疾炝艘云咸烟?、蔗糖、草酸鈉、檸檬酸三鈉為碳源對(duì)FeRB-FL14043菌還原高嶺土中Fe2O3(Fe(3+))的影響，結(jié)果表明葡萄糖作為碳源，高嶺土除鐵效果最好；在葡萄糖濃度為1%、礦漿濃度為10%、鐵還原菌液加量為5%、溫度為28℃、pH值6.5條件下厭氧培養(yǎng)10d，高嶺土中Fe(3+)去除率為46.07%，F(xiàn)e2O3含量由0.89%降低至0.48%，自然白度由61.3%提高至68.7%，1 280℃燒成白度由84.9%提高至90.6%。

【關(guān)鍵詞】鐵還原菌；分離；高嶺土；除鐵；碳源

1　引言

高嶺土是一種重要的粘土礦物，其本身具有優(yōu)良的性能，被廣泛應(yīng)用于陶瓷、造紙等多個(gè)行業(yè)中，這些行業(yè)對(duì)高嶺上的白度都有一定的要求[1-5]。影響高嶺土白度的主要因素是鐵、鈦的礦物成分與含量[6]，其中自由鐵雜質(zhì)主要以鐵礦物形式存在，如褐鐵礦、赤鐵礦、磁鐵礦、黃鐵礦、菱鐵礦和黃鉀鐵礬等。這些鐵礦物會(huì)使高嶺土呈現(xiàn)不同程度的灰色、綠色、褐色、粉紅色等[7]，然而鐵雜質(zhì)多數(shù)以Fe2O3的形式賦存于礦物顆粒中，由于Fe2O3對(duì)高嶺土的白度影響大，因此是首當(dāng)其沖應(yīng)被清除的雜質(zhì)成分[8]。

高嶺土在工業(yè)利用之前一般都需要經(jīng)過除鐵增白處理，除鐵方案和工藝路線，主要取決于高嶺土中鐵的賦存狀態(tài)及產(chǎn)品的最終用途。高嶺土除鐵增白方法主要有物理法[9-11]、化學(xué)法[12-14]、煅燒法和微生物法[8,15-16]。物理方法除鐵可使高嶺土白度有一定的提高，如磁選法可去除高嶺土中具有一定磁性染色物質(zhì)[9]；化學(xué)漂白是利用特定的化學(xué)試劑選擇性溶解高嶺土中的雜質(zhì)，然后通過洗滌、過濾除去雜質(zhì)的方法。根據(jù)高嶺土原料中鐵的賦存形式，目前已形成了

礦物微生物加工作為一種新興技術(shù)正受到越來越廣泛的關(guān)注。目前高嶺土除鐵微生物主要有氧化亞鐵硫桿菌、黑曲霉菌、異養(yǎng)鐵還原菌等。氧化亞鐵硫桿菌可氧化高嶺土體系中的黃鐵礦[17]，從而提高高嶺土白度；黑曲霉菌產(chǎn)生的有機(jī)酸(主要是草酸)對(duì)高嶺土中難溶氧化鐵[18]有一定的溶解作用，達(dá)到了增白目的；鐵還原菌能使高嶺土中三價(jià)鐵(Fe2O3)還原成易溶于水的二價(jià)鐵離子而除去[8,16]。微生物法具有成本低、能耗少、環(huán)境污染程度輕等顯著特點(diǎn)，但其工業(yè)化瓶頸在于反應(yīng)速度較慢，處理周期較長。隨著高嶺土礦的不斷開采，優(yōu)質(zhì)資源日益減少。因此，開展高嶺土微生物除鐵增白研究，可使原本開采價(jià)值不高的高鐵低品位高嶺土礦得以開采，實(shí)現(xiàn)礦產(chǎn)資源的可持續(xù)發(fā)展。

2　材料與方法

2.1 材料

2.1.1 分離樣品

采自福建礦山(高嶺土礦和錳礦)。

2.1.2 高嶺土

由龍巖高嶺土公司提供，F(xiàn)e2O3含量為0.89%，含三價(jià)鐵為0.623%。

2.1.3 培養(yǎng)基

(1) PTYG上層固體培養(yǎng)基。

1%PTYG的上層固體培養(yǎng)基：蛋白胨0.10g、酵母膏0.10g、蔗糖0.10g、MgSO4·7H2O 0.60g、無水CaCl20.25g、瓊脂20g、蒸餾水1 000mL，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值為7.0。上層PTYG固體培養(yǎng)基，用于營造厭氧環(huán)境。

(2) PTYG下層選擇性固體培養(yǎng)基。

檸檬酸鐵下層培養(yǎng)基：檸檬酸鐵銨0.10g、NH4C1 1.00g、無水CaCl20.25g、MgSO4·7H2O 3.00g、 K2HPO4·3H2O 3.60g、KH2PO46.25g、葡萄糖50g、瓊脂20g、蒸餾水1 000mL，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值為7.0。

(3) LB培養(yǎng)基。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10g、牛肉膏5g、NaCl 5g、蒸餾水1 000mL，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值為7.0，121℃滅菌20min。固體培養(yǎng)基每升加20g的瓊脂。

(4) 高嶺土培養(yǎng)基。

高嶺土培養(yǎng)基：高嶺土100g、葡萄糖10g、酵母膏1g、蒸餾水1 000mL，pH值自然。

2.1.4 主要儀器

潔凈工作臺(tái)(SW-GF-1F型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；生化培養(yǎng)箱(SPX-2508-Z型，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；光學(xué)顯微鏡(PM-10AD型，Olympus)；恒溫?fù)u床(HQ45型，武漢科學(xué)儀器廠)；滅菌消毒器(CRDX-280型，上海電安醫(yī)療器械廠)；分光光度計(jì)(723型，上海精密科學(xué)儀器有限公司)；臺(tái)式離心機(jī)(TDL-40B-II型，上海安亭科學(xué)儀器廠)；冷凍高速離心機(jī)(CS-15R型，Beckman)；智能白度測定儀(WSB-VI型，杭州大吉光電儀器有限公公司)。

2.2.1 富集培養(yǎng)

稱取樣品10g于250mL三角瓶中，加入1g葡萄糖，100mL水，于30℃靜置富集培養(yǎng)至高嶺土由紅色變?yōu)榘咨?。?mL培養(yǎng)液接種于LB培養(yǎng)基中，于30℃靜置培養(yǎng)1d，作為接種液。將此接種液接入裝有高嶺土培養(yǎng)基瓶中，再通氮?dú)馊コ恐醒鯕?，加蓋密封，30℃暗光厭氧培養(yǎng)至高嶺土由紅色變?yōu)榘咨?，進(jìn)行鐵還原菌選擇性培養(yǎng)，如此重復(fù)多次，淘汰非還原性細(xì)菌，最終獲得純度較高的鐵還原菌混合菌液。

2.2.2 鐵還原菌的分離純化

采用稀釋涂布法，即分別取不同稀釋度上述鐵還原菌混合菌液各1mL，涂布于檸檬酸鐵固體培養(yǎng)基平板上，覆蓋一層PTYG上層培養(yǎng)基，于30℃培養(yǎng)，3d后觀察微生物生長情況和菌落形態(tài)。挑取不同形態(tài)的菌落接種至LB培養(yǎng)基斜面，分別測定其使高嶺土除鐵的能力，選擇一株除鐵能力較強(qiáng)的菌株用于菌種鑒定。

2.2.3 菌株鑒定

(1) 形態(tài)特征和生理生化特征。

綜上所述，在經(jīng)濟(jì)全球化日益復(fù)雜的背景下，通過有效的內(nèi)部控制管理能夠提升企業(yè)抵御財(cái)務(wù)風(fēng)險(xiǎn)的能力，實(shí)現(xiàn)企業(yè)的長遠(yuǎn)發(fā)展。為此，針對(duì)當(dāng)前基于財(cái)務(wù)風(fēng)險(xiǎn)防范的內(nèi)部控制管理存在的問題，需要相關(guān)人員從思想意識(shí)提升、制度完善、環(huán)境營造等方面積極思考怎樣優(yōu)化企業(yè)內(nèi)部控制管理，以期能夠更好的促進(jìn)現(xiàn)代企業(yè)發(fā)展。

參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[19]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[20]對(duì)分離純化后的的鐵還原菌進(jìn)行形態(tài)特征和生理生化特征鑒定。

(2) 菌株的16S rDNA分子鑒定。

基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增操作按試劑盒使用說明書進(jìn)行，試劑盒產(chǎn)品編號(hào)NEP021-1。

基因組DNA提?。翰捎秒x心柱型細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌液基因組DNA。

16S rDNA的PCR擴(kuò)增體系：DNA 2μL、2× MIX 25μL、MF 1μL/10μm、MR 1μL/10μm、ddH2O 50μL。

PCR反應(yīng)為：94℃預(yù)變性5min；94℃ 30s，52℃30s，72℃ 100s，共30個(gè)循環(huán)；最后在72℃延伸10min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行DNA測序。

(3) 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

將菌株FeRB-FL1404的16S rDNA基因序列測定結(jié)果輸入GenBank進(jìn)行序列相似性比對(duì)，獲得的序列提交NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)，并將所選擇出的同源性較高的序列，采用DNAstar7.0軟件中的Jotun Hein Method構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2.2.4 FeRB-FL1404菌對(duì)高嶺土中Fe2O3(Fe3+)的還原

鐵還原菌液制備：鐵還原菌接入LB培養(yǎng)基中，于28℃培養(yǎng)36h(對(duì)數(shù)生長期)得到鐵還原菌液，調(diào)節(jié)菌液OD600為0.2，用于試驗(yàn)。

批試驗(yàn)為在250mL的錐形瓶中加入高嶺土10g，選用4種不同碳源(葡萄糖、蔗糖、草酸鈉和檸檬酸三鈉)，加量均為1g，pH值調(diào)至6.5、蒸餾水100mL，滅菌后，加入5mL鐵還原菌液，28℃厭氧培養(yǎng)10d，離心后測定溶液中Fe2+的含量，計(jì)算高嶺土Fe3+去除率。試驗(yàn)平行3次，取平均值。

2.2.5 Fe2+濃度的測定

采用鄰菲啰啉分光光度法[21]測定溶液中Fe2+濃度。從100mL培養(yǎng)液中取3mL，3 500r/min離心5min，取0.2mL上清液至25mL的比色管中，再加入鹽酸羥胺1mL、NaAc-HAc緩沖溶液5mL、鄰菲啰啉3.0mL，加水至刻線，顯色10min，在510nm處測吸光度，根據(jù)工作曲線，計(jì)算出高嶺土中鐵的還原量和去除率。

式中：CFe(Ⅱ)——高嶺土中鐵的去除量，mg/g；

a——稀釋倍數(shù)；

y——0.2mL中Fe2+濃度，μg/mL；

V——培養(yǎng)液總體積，mL；

m——高嶺土量，g。

高嶺土原礦含F(xiàn)e2O30.89%，經(jīng)換算，相當(dāng)于高嶺土含F(xiàn)e3+(Fe2O3)：

CFe(Ⅲ)＝6.23mg Fe/g高嶺土；

通過測定溶液中Fe2+的含量，計(jì)算出CFe(Ⅱ)，則：

高嶺土Fe3+(Fe2O3)去除率=CFe(Ⅱ)/CFe(Ⅲ)×100%

3　結(jié)果與討論

3.1 鐵還原菌的分離

采用高嶺土為富集培養(yǎng)基，PTYG-檸檬酸鐵雙層培養(yǎng)基為選擇性分離培養(yǎng)基，從錳礦樣品中分離出1株異化鐵還原菌FeRB-FL1404菌株。

3.2 鐵還原菌的鑒定

3.2.1 培養(yǎng)特性

鐵還原菌FeRB-FL1404在LB培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)24h后，形成菌落為白色至淡黃色，橢圓形，菌落光滑，邊緣整齊。

3.2.2 染色特性

經(jīng)革蘭氏染色，顯微鏡(×1000)觀察，結(jié)果見圖1。由圖1可以看到，該菌株菌體呈桿狀，大小約(0.6～0.7)μm×(2.0～3.0)μm，菌體呈紫色，為革蘭氏陽性細(xì)菌。

圖1　鐵還原菌FeRB-FL1404的菌體形態(tài)

3.2.3 生理生化特征

該菌具有過氧化氫酶活性，能還原石蕊牛奶，分泌蛋白酶分解明膠，分解葡萄糖產(chǎn)酸而不產(chǎn)氣，無精氨酸雙水解酶，V.P.試驗(yàn)陽性，硫化氫試驗(yàn)陽性，硝酸鹽還原陰性，淀粉水解陰性，M.R試驗(yàn)陰性。

3.2.4 菌株16S rDNA序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

以菌株FeRB-FL1404基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后在10%的瓊脂糖凝膠上電泳，結(jié)果如圖2所示(圖中I表示:16S rDNA PCR產(chǎn)物；M表示：DAN Marker)，在約1 500bp處有一明亮的條帶。

圖2　鐵還原菌FeRB-FL1404基因組的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳

將該序列提交到GenBank上進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，該菌與短小芽孢桿菌具有較高的同源性，在進(jìn)化關(guān)系上，菌株FeRB-FL1404與Bacillus屬的Bacillus pumilus同源性高達(dá)99%。構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖3所示。

圖3　菌株FeRB-FL1404基于16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹

綜合形態(tài)特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析結(jié)果，可確定鐵還原菌FeRB-FL1404為短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)。

3.3 鐵還原菌對(duì)高嶺土中Fe2O3(Fe3+)的還原

為了使在較短的時(shí)間內(nèi)獲得較多的活性較高的菌體，對(duì)FeRB-FL1404鐵還原菌的最適生長溫度和生長曲線進(jìn)行測定，使培養(yǎng)得到的菌體能更加有效地還原高嶺土中Fe2O3(Fe3+)。

3.3.1 溫度對(duì)菌體生長的影響

FeRB-FL1404菌用LB培養(yǎng)基分別在22、24、26、28、30、32℃于120rpm恒溫振蕩培養(yǎng)48h，在600nm波長處，測定培養(yǎng)液OD600值，結(jié)果如圖4。從圖4可看出，該菌最適生長溫度為28℃，因此，后續(xù)試驗(yàn)溫度取28℃。

圖4　溫度對(duì)菌體生長量的影響

3.3.2 鐵還原菌生長曲線

在一批含5mL LB培養(yǎng)基的試管中各接入0.5mL鐵還原菌種子液，于28℃、120rpm恒溫振蕩培養(yǎng)，每隔3h取三根試管，測定培養(yǎng)液OD600值，取3次平均值，繪制生長曲線見圖5。

從圖5可知鐵還原菌14～04接種后0～30h為延滯期，30～48h為對(duì)數(shù)生長期，48h以后為穩(wěn)定期。由于在對(duì)數(shù)生長期，菌體活力最佳，因此在后續(xù)試驗(yàn)中選擇培養(yǎng)36h鐵還原菌作為接種液。

3.3.3 碳源對(duì)高嶺土中Fe2O3(Fe3+)還原的影響

鐵還原菌在厭氧條件下生長，并以葡萄糖等有機(jī)物為電子供體，以高嶺土中Fe3+(Fe2O3)為電子受體進(jìn)行異化鐵還原作用，可將高嶺土Fe3+還原為可溶性的Fe2+從礦物中浸出，所以可用培養(yǎng)液中Fe2+增加量來表示高嶺土中Fe3+的去除量，從而計(jì)算出其去除率。

試驗(yàn)礦漿濃度為10%，OD600值為0.2的鐵還原菌液加量為5%，碳源加量為1%，pH值為6.5，在此條件下厭氧培養(yǎng)10d，考察不同碳源對(duì)高嶺土中Fe2O3(Fe3+)還原的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖5　鐵還原菌生長曲線

圖6　不同碳源對(duì)微生物還原Fe(Ⅲ)的影響

圖6表明以葡萄糖、蔗糖、草酸鈉和檸檬酸三鈉為碳源，鐵還原菌FeRB-FL1404均能還原高嶺土中Fe3+，高嶺土中Fe3+的去除量依次為2.87、1.19、2.52、1.68mg/g，去除率依次為46.07%、19.10%、40.45%和26.97%，高嶺土中Fe2O3含量從原土的0.89%依次降低到0.48%、0.72%、0.53%和0.65%。其中以葡萄糖為碳源除鐵效果最好，除鐵后高嶺土中的Fe2O3含量降到0.48%，相應(yīng)提高了高嶺土白度，經(jīng)白度檢測儀測定，高嶺土自然白度由61.3%提高至68.7%，1 280℃燒成白度由84.9%提高至90.6%，白度提高顯著。

4　結(jié)論

(1) 采用富集培養(yǎng)方法，以高嶺土為富集培養(yǎng)基，從錳礦樣品中分離到一株能夠還原高嶺土中Fe(Ⅲ)的鐵還原菌FeRB-FL1404。其菌落特征為：白色至淡黃色，圓形，邊緣整齊。染色結(jié)果表明，該菌株為革蘭氏陽性細(xì)菌，桿狀，大小約(0.6～0.7)μm× (2.0～3.0)μm。

(2) 采用PCR技術(shù)獲得了1 500bp的鐵還原菌株FeRB-FL1404的部分16S rDNA序列。經(jīng)同源性分析和與相關(guān)菌株16S rDNA的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系比較發(fā)現(xiàn)，菌株FeRB-FL1404與Bacillus屬的Bacillus pumilus同源性高達(dá)99%，結(jié)合形態(tài)特征和生理生化特征，該菌株可確定為短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)。

(3) FeRB-FL14043菌分別以葡萄糖、蔗糖、草酸鈉、檸檬酸三鈉為碳源，其均能使高嶺土中Fe3+還原，但葡萄糖除鐵效果最好；以葡萄糖為碳源，高嶺土中Fe3+去除率為46.07%，F(xiàn)e2O3含量由0.89%降低至0.48%，自然白度由61.3%提高至68.7%，1 280℃燒成白度由84.9%提高至90.6%。

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【試驗(yàn)研究】

Study on the Isolation and Identification of A Iron-reducing Bacterium FeRB-FL1404 and the Fe(Ⅲ) Removal of Its From Kaolin

LIN Yu-man1, CHEN Xiao-lan2, WEI Zhao-di3, XU Xu-ping2
(1.College of Environmental Science and Engineering, Fujian Normal University, Fuzhou 350007, China; 2.College of Life Sciences, Fujian Normal University, Fuzhou 350007, China; 3.College of Chemistry and Chemical Engineering, Fujian Normal University, Fuzhou 350007,China)

Abstract:In this paper, kaolin was chosen as the selective media. A iron-reducing bacterium FeRB-FL1404 was isolated from manganese ore and was identified as Bacillus pumilus according to its morphology feature, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA analysis. In addition, carbon souses, including glucose sucrose sodium oxalate trisodium citrate,impacting on the iron removal from kaolin using ion reducing bacteria were investigated with batch experiments. The results showed that glucose emerged as the most effective carbon source. Under the conditions with glucose as carbon source, glucose concentration of 1%, pulp concentration of 10%, bacterial inoculum for 5%, temperature of 28℃, pH6.5, anaerobic culture for 10 days, the removal percentage of Fe(3+)from kaolin was achieved 46.07%, Fe2O3content in kaolin was reduced from 0.89% to 0.48%, the natural whiteness was enhanced from 61.3% to 68.7%, and whiteness was enhanced from 84.9% to 90.6% after fired at 1 280℃.

Key words:iron-reducing bacteria; isolation; kaolin; removal of iron; carbon source

【收稿日期】2014-08-27

【基金項(xiàng)目】福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2012J01198)；福建省高校產(chǎn)學(xué)合作科技重大項(xiàng)目(2014H6008)。book=12,ebook=15氧化漂白法、酸浸漂白法、還原漂白法、氧化—還原聯(lián)合法等，其中以還原漂白法應(yīng)用最為普遍。高嶺土中鐵雜質(zhì)多為難溶于水的三價(jià)鐵，一般采用在還原劑的作用下還原漂白法去除；高溫煅燒是除碳增白的最佳方法，但對(duì)于鐵含量較高的高嶺土礦，煅燒后的白度難以突破85%。

【文章編號(hào)】1007-9386(2015)01-0011-05

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【中圖分類號(hào)】TD925.5；TD973.2