碳量子點(diǎn)作為光聲造影劑的性能評(píng)價(jià)與基礎(chǔ)研究

彭喬立, 王驍勇, 黃 超, 劉 剛

(廈門大學(xué)分子影像與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心, 福建 廈門 361102)

碳量子點(diǎn)作為光聲造影劑的性能評(píng)價(jià)與基礎(chǔ)研究

彭喬立, 王驍勇, 黃 超, 劉 剛

(廈門大學(xué)分子影像與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心, 福建 廈門 361102)

基于碳量子點(diǎn)的優(yōu)異光吸收性能, 探討碳量子點(diǎn)作為光聲造影劑的潛質(zhì). 測試碳量子點(diǎn)的基本物理性質(zhì), 以及不同濃度、 波長、 緩沖液中的體外光聲成像效果. 進(jìn)而研究其在小鼠皮下注射及尾靜脈注射下的體內(nèi)光聲造影效果及生物相容性. 結(jié)果顯示, 碳量子點(diǎn)具有優(yōu)良的光聲性能, 在多種緩沖液中具備穩(wěn)定的光聲信號(hào). 動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)其在小鼠皮下以及血管中均能起到光聲造影增強(qiáng)作用, 并且具有良好的生物相容性.

碳量子點(diǎn); 光聲成像; 造影劑; 腫瘤血管成像

0 引言

光聲成像(photoacoustic imaging)是一種近年來發(fā)展迅猛的成像技術(shù), 其獨(dú)特的非侵入、 高穿透成像方式在分子影像領(lǐng)域廣受關(guān)注[1]. 光聲成像的原理是基于一種物理現(xiàn)象： 物體能夠吸收特定波長的光波并將吸收的能量轉(zhuǎn)化為超聲波的形式散發(fā)出去. 然后可以使用聲波接受探頭將聲波信號(hào)收集起來, 重組成為圖像[2]. 由于光線的滲透能力比較差， 熒光成像在體內(nèi)成像應(yīng)用上受到限制, 而聲音信號(hào)受到組織吸收的影響相對(duì)較小. 此外, 光聲系統(tǒng)使用的是穿透力較強(qiáng)的近紅外波段的激發(fā)光,在深層次血管成像、 黑色素瘤探查、 血氧飽和度監(jiān)測等方面都有很大的應(yīng)用空間[3]. 雖然目前主流的成像方式可以提供更為靈敏的影像信息, 如正電子斷層掃描(PET)、 X射線掃描[4], 但是光聲成像既不需要使用放射性元素作為標(biāo)記物, 也無需使用高能量的射線, 具有更好的生物安全性[5].

在分子成像過程中, 為了提高成像效果, 常常需要造影劑進(jìn)行輔助實(shí)施. 目前國內(nèi)外研究比較廣泛的光聲造影劑多數(shù)是量子點(diǎn)化合物. 相比于傳統(tǒng)的有機(jī)染料以及熒光蛋白, 量子點(diǎn)的光學(xué)性能更為可控, 熒光壽命更長, 量子產(chǎn)率更高[6], 因此在光學(xué)及光聲分子影像領(lǐng)域得到較為廣泛的應(yīng)用[7]. 已有研究將表面功能化的金、 銀等金屬納米顆粒應(yīng)用于光聲成像[8-9], 充分利用其可控的光學(xué)性能, 使其在近紅外區(qū)域表現(xiàn)出優(yōu)秀的光吸收, 產(chǎn)生比較強(qiáng)的光聲信號(hào). 但是由重金屬元素構(gòu)成的納米粒子具有較大的毒性, 因此在生物體應(yīng)用中受到一定的限制[10], 尋求更加安全的光聲造影劑成為了當(dāng)前研究熱點(diǎn).碳量子點(diǎn)具有優(yōu)良的光學(xué)性能, 生物安全性高， 并已經(jīng)廣泛使用于光學(xué)成像的研究[11], 但是其光聲成像對(duì)比效果尚有待深入. 利用碳量子點(diǎn)寬泛的光吸收和可控的體積, 探討碳量子點(diǎn)的各種光聲表現(xiàn), 以期拓展碳量子點(diǎn)在生物影像方面的應(yīng)用.

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

碳量子點(diǎn)由本實(shí)驗(yàn)室采用激光燒蝕法合成保存[12]. 采用Q-switched Nd: YAG激光儀(激發(fā)波長設(shè)為1 064 nm, 激發(fā)頻率為10 Hz)在900 ℃和75 kPa環(huán)境下, 持續(xù)通入水蒸氣和氬氣對(duì)碳靶進(jìn)行燒蝕， 獲得納米級(jí)碳粒子聚集體. 隨后將碳納米顆粒進(jìn)行酸化和表面鈍化, 得到“光致發(fā)光”碳量子點(diǎn). 實(shí)驗(yàn)用Balb/c小鼠來自廈門大學(xué)動(dòng)物中心, 采用體質(zhì)量為20 g、 2周齡左右的雌性小鼠.

1.2 實(shí)驗(yàn)器材

光聲成像系統(tǒng)為美國Endra公司的Nexus 128小動(dòng)物光聲成像系統(tǒng). 光吸收測量采用了Thermal Multiskan Go; 粒徑測試采用了英國Malvern公司的Mastersizer 2000顆粒粒度分析儀.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)態(tài)光散射

首先稀釋量子點(diǎn)溶液, 防止產(chǎn)生比較大的誤差, 實(shí)驗(yàn)前將碳量子點(diǎn)原始溶液按照3 ∶7的比例用去離子水稀釋, 將粒度測試儀的激發(fā)波長設(shè)置為450 nm, 接收波長設(shè)置為550 nm, 然后啟動(dòng)設(shè)備進(jìn)行掃描, 得到的數(shù)據(jù)使用Graphpad prism 5進(jìn)行分析.

1.3.2 透射電子顯微鏡

打開主機(jī)電源, 讓空載系統(tǒng)自動(dòng)運(yùn)行30 min. 將裝有碳量子點(diǎn)的樣品桿插入樣品室, 把預(yù)抽開關(guān)打開, 樣品桿緩慢送入觀察位置. 在圖像場中選擇微區(qū), 放大倍數(shù)設(shè)為2 000倍, 搜索透光好的區(qū)域, 調(diào)整電子衍射斑點(diǎn)圖至最好狀態(tài).

1.3.3 體外光聲成像

碳量子點(diǎn)用去離子水稀釋并調(diào)整濃度為100、 70、 40、 10 μg·mL-1. 為了驗(yàn)證碳量子點(diǎn)在不同分散系里面的表現(xiàn), 將碳量子點(diǎn)溶解于生理鹽水、 胎牛血清、 磷酸鹽緩沖液等常見溶劑, 每種溶劑都選擇與去離子水體系一樣的4種濃度. 制備好的樣品每種吸取200 μL存放至250 μL的塑料離心管里, 使用Endra光聲系統(tǒng)特制的盛放容器固定離心管, 掃描波長設(shè)置為680 nm, 脈沖角度設(shè)為120°, 同一角度脈沖次數(shù)設(shè)為60次, 選擇始終優(yōu)化圖像的選擇框, 容器位置選擇upside. 啟動(dòng)掃描, 每一組分別選擇不同時(shí)間相同參數(shù)掃描3次以避免系統(tǒng)誤差. 得到的數(shù)據(jù)在控制臺(tái)電腦上使用Osirix軟件進(jìn)行分析, 圖像的截取都取自同一坐標(biāo), 定量數(shù)據(jù)獲取使用相同大小的圓形ROI, 選擇相應(yīng)的區(qū)域以獲取信息, 以平均光聲信號(hào)強(qiáng)度作為比較依據(jù).

1.3.4 小鼠腫瘤接種

4T1腫瘤細(xì)胞從液氮罐復(fù)蘇, 以100 μL細(xì)胞混懸液對(duì)每只小鼠進(jìn)行皮下注射, 接受注射的小鼠置于動(dòng)物培養(yǎng)系統(tǒng)中, 兩周后腫瘤大小清晰可見而且沒有潰爛時(shí)開始進(jìn)行試驗(yàn).

1.3.5 小鼠皮下光聲成像

Balb/c小鼠從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心買回, 給小鼠稱量體質(zhì)量, 按照50 μL/100 g的比例腹腔注射7%(體積分?jǐn)?shù))的水合氯醛溶液, 使其麻醉, 待其徹底麻醉以后, 在小鼠大腿股外側(cè)肌部位進(jìn)行皮下注射, 對(duì)照組注射100 μL的PBS, 實(shí)驗(yàn)組100 μL等體積的碳量子點(diǎn)溶液, 選擇100、 70、 40 μg·mL-13個(gè)濃度的樣品作為比較. 注射完畢后, 將處于深度麻醉狀態(tài)的小鼠置于光聲系統(tǒng)的特制動(dòng)物容器中, 然后將容器固定在光聲儀器內(nèi)部, 按照上述方法啟動(dòng)掃描并分析結(jié)果.

1.3.6 小鼠血管成像

選取數(shù)只從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購買的合適的Balb/c小鼠, 待其狀態(tài)穩(wěn)定時(shí), 按照上述方法對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔麻醉, 待小鼠深度麻醉以后剃掉背部以及后腿的毛發(fā), 將麻醉小鼠固定在尾靜脈注射的裝置里面, 將100 μL的100 μg·mL-1濃度的碳量子點(diǎn)溶液通過尾靜脈注射的方法注射到小鼠體內(nèi), 將處于深度麻醉的小鼠置于光聲系統(tǒng)特制的容器中, 掃描波長設(shè)為680 nm, 將容器放在光聲儀器里面, 采取5、 10、 20、 30、 40、 50、 60、 70 min等多個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行掃描, 按照上述方法掃描并分析結(jié)果.

2 結(jié)果與討論

2.1 碳量子點(diǎn)的物理表征

圖1展示了碳量子點(diǎn)的近紅外吸收, 紫外吸收的波峰處在400～450 nm之間, 小于400 nm的紫外吸收也有不錯(cuò)的表現(xiàn), 量子點(diǎn)的光吸收性能隨體積不同而變化, 吸收峰值比較窄也間接證明了所制備的碳量子點(diǎn)體積大小比較集中. 而峰值以后則呈現(xiàn)出遞減的趨勢(shì). 碳量子點(diǎn)的釋放光峰值處在500 nm左右, 熒光表現(xiàn)類似于傳統(tǒng)的FITC熒光. 動(dòng)態(tài)激光散射(DLS)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖2所示, 碳量子點(diǎn)的直徑大約為(10.6±2.4)nm. 通過透射電子顯微鏡觀察, 可以看到碳量子點(diǎn)在溶液中分散均勻， 呈比較規(guī)則的球狀, 球體直徑在10 nm左右.

圖1 碳量子點(diǎn)的體外光吸收曲線

圖2 碳量子點(diǎn)的動(dòng)態(tài)光散射結(jié)果與TEM圖像

2.2 碳量子點(diǎn)的體外光聲成像

圖3 碳量子點(diǎn)溶液在不同波長激發(fā)下的光聲圖像以及信號(hào)強(qiáng)度 Fig.3 The images and histogram of photoacoustic intensity with different excitation wavelengths

如圖3所示, 碳量子點(diǎn)溶液在680、 750、 820、 890 nm等4種不同的激發(fā)波長下, 碳量子點(diǎn)在近紅外區(qū)680 nm波長激發(fā)時(shí)表現(xiàn)出了最強(qiáng)的光聲信號(hào), 這也和之前的光吸收曲線在近紅外區(qū)域表現(xiàn)一致. 因此, 后續(xù)實(shí)驗(yàn)都采用在680 nm下進(jìn)行光聲成像. 為了測試量子點(diǎn)溶液在不同分散體系下的穩(wěn)定性, 碳量子點(diǎn)的水溶液用其他的溶劑進(jìn)行稀釋, 依次選擇生理鹽水、 胎牛血清以及去離子水, 然后對(duì)不同濃度的樣本進(jìn)行激發(fā)光為680 nm的光聲掃描測試, 結(jié)果如圖4所示. 在不同的溶解體系中碳量子點(diǎn)都表現(xiàn)出了穩(wěn)定的光聲信號(hào), 從圖5的定量表格中可以看出, 不同濃度的量子點(diǎn)溶液也呈現(xiàn)出了明顯的梯度, 反映出量子點(diǎn)作為光聲造影劑進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的價(jià)值.

圖4 碳量子點(diǎn)溶解在不同溶液中進(jìn)行680 nm激發(fā)的光聲圖像

圖5 碳量子點(diǎn)在不同的溶液中得到的光聲強(qiáng)度

2.3 碳量子點(diǎn)的皮下光聲成像

圖6 碳量子點(diǎn)皮下注射Balb/c小鼠光聲成像

在給小鼠皮下注射一定量的碳量子點(diǎn)后進(jìn)行光聲掃描, 激發(fā)波長為680 nm的光聲圖像如圖6所示. 空白組的光聲信號(hào)比較弱, 只能模糊地看見少量血管, 因?yàn)槠は伦⑸鋵?shí)驗(yàn)的小鼠均沒有種植體表腫瘤, 皮下血管也比較稀疏. 而碳量子點(diǎn)注射后則有比較明顯的亮斑被掃描到, 體現(xiàn)了碳量子點(diǎn)光聲成像的穿透能力較強(qiáng). 3種濃度的碳量子點(diǎn)注入小鼠皮下后產(chǎn)生光聲圖像的亮度有比較明顯的梯度變化, 反映了碳量子點(diǎn)光聲成像具有優(yōu)秀的靈敏度.

2.4 碳量子點(diǎn)的血管光聲成像

進(jìn)行血管成像的小鼠接種過腫瘤, 成像部位也是針對(duì)小鼠的體表腫瘤部位進(jìn)行成像, 因?yàn)轶w表腫瘤具有豐富的血管組織, 使結(jié)果易于觀察對(duì)比. 小鼠尾靜脈注射過碳量子點(diǎn)后接受了腿部腫瘤部位的光聲掃描, 成像結(jié)果如圖7所示, 光聲強(qiáng)度如圖8所示. 注射前小鼠的腫瘤血管暗淡模糊(見圖7(a)), 注射后的1 h內(nèi)血管成像明顯得到強(qiáng)化(見圖7(b)～(c)), 注射后70 min左右圖像(見圖7(d))恢復(fù)到注射前的水平. 從圖8來看, 信號(hào)強(qiáng)度曲線走勢(shì)與圖像變化趨勢(shì)相當(dāng), 注射碳量子點(diǎn)后1 h內(nèi)持續(xù)升高, 而在注射后70 min左右被徹底代謝出血循環(huán), 恢復(fù)到注射前的水準(zhǔn).

圖7 Balb/c小鼠尾靜脈注射碳量子點(diǎn)后的4T1腫瘤血管光聲成像 Fig.7 Photoacoustic images of 4T1 tumor after i.v. injection

圖8 Balb/c荷瘤小鼠尾靜脈注射碳量子點(diǎn)后腫瘤血管光聲強(qiáng)度曲線圖 Fig.8 Photoacoustic intensity histogram of tumor sites after i.v. injection of C-dots

2.5 碳量子點(diǎn)的體內(nèi)毒性檢測

圖9 實(shí)驗(yàn)組小鼠的組織切片

使用Balb/c小鼠進(jìn)行碳量子點(diǎn)的體內(nèi)毒性研究, 設(shè)置兩個(gè)組別, 對(duì)照組尾靜脈注射生理鹽水100 μL, 實(shí)驗(yàn)組尾靜脈注射100 μg·mL-1的碳量子點(diǎn)溶液100 μL. 所有接受注射生理鹽水和碳量子點(diǎn)的小鼠都存活超過2周, 進(jìn)食以及排泄活動(dòng)正常, 沒有表現(xiàn)出厭食癥, 或者諸如毛發(fā)脫落、 結(jié)痂、 嘔吐和腹瀉之類的病理表現(xiàn), 體重增長正常. 實(shí)驗(yàn)組小鼠2周后被處死, 相應(yīng)器官取出并固定, 制作病理切片, 使用正置熒光顯微鏡觀察, 如圖9所示. 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組相比沒有明顯的炎癥、 結(jié)節(jié)、 增生等病理表現(xiàn), 心肌纖維連續(xù)規(guī)則, 肺泡形狀完整清晰可見, 腎單位結(jié)構(gòu)明顯整齊, 也沒有明顯的水腫表現(xiàn), 說明碳量子點(diǎn)的生物相容性良好.

3 結(jié)語

實(shí)驗(yàn)對(duì)碳量子點(diǎn)用作光聲成像的造影劑進(jìn)行系統(tǒng)、 全面的生物學(xué)性能評(píng)價(jià). 體外的多波長掃描實(shí)驗(yàn)證明了碳量子點(diǎn)在680 nm波長激發(fā)下的光聲增強(qiáng)效果顯著， 并在各種緩沖液體系中都有穩(wěn)定的光聲增強(qiáng)性能. 進(jìn)一步的動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)碳量子點(diǎn)具有良好的光聲增強(qiáng)信號(hào), 并且生物相容性良好. 綜上所述, 碳量子點(diǎn)的體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)都表現(xiàn)出了較強(qiáng)的光聲增強(qiáng)信號(hào), 具有作為高性能光聲造影劑的潛質(zhì).

[1] Fábián T K, Kovács K J, Gótai L,etal. Photo-acoustic stimulation: theoretical background and ten years of clinical experience[J]. Contemporary Hypnosis, 2009, 26(4): 225-233.

[2] Cook J R, Frey W, Emelianov S. Quantitative photoacoustic imaging of nanoparticles in cells and tissues[J]. ACS Nano, 2013, 7(2): 1 272-1 280.

[3] Zerda A, Liu Z, Bodapati S,etal. Ultrahigh sensitivity carbon nanotube agents for photoacoustic molecular imaging in living mice[J]. Nano Letters, 2010, 10(6): 2 168-2 172.

[4] Liang M, Liu X, Cheng D,etal. Multimodality nuclear and fluorescence tumor imaging in mice using a streptavidin nanoparticle[J]. Bioconjugate Chemistry， 2010, 21(7): 1 385-1 388.

[5] Braslavsky S E. Photo acoustic and photothermal methods applied to the study of radiationless deactivation processed in biological systems and in substances of biological interest[J]. Photochemistry and Photobiology, 1986, 43(6): 667-675.

[6] Chang J C, Rosenthal S J. Single quantum dot imaging in living cells[J]. Methods in Molecular Biology， 2013, 991: 149-162.

[7] Liu J, Erogbogbo F, Yong K T,etal. Assessing clinical prospects of silicon quantum dots: studies in mice and monkeys[J]. ACS Nano, 2013, 7(8): 7 303-7 310.

[8] Homan K A, Souza M, Truby R,etal. Silver nanoplate contrast agents forinvivomolecular photoacoustic imaging[J]. ACS Nano, 2011, 6(1): 641-650.

[9] Kim C, Cho E C, Chen J,etal.Invivomolecular photoacoustic tomography of melanomas targeted by bioconjugated gold nanocages[J]. ACS Nano, 2010, 4(8): 4 559-4 564.

[10] Bradburne C E, Delehanty J B, Boeneman G K,etal. Cytotoxicity of quantum dots used forinvitrocellular labeling: role of QD surface ligand, delivery modality, cell type and direct comparison to organic fluorophores[J]. Bioconjugate Chemistry, 2013, 24(9): 1 570-1 583.

[11] Yang S T, Wang X, Wang H,etal. Carbon dots as nontoxic and high-performance fluorescence imaging agents[J]. Journal of Physical Chemistry C: Nanomaterials and Interfaces, 2009, 113(42): 18 110-18 114.

[12] Wang L, Wang X, Bhirde A,etal. Carbon-dot-based two-photon visible nanocarriers for safe and highly efficient delivery of siRNA and DNA[J]. Advanced Healthcare Materials, 2014, 3(8): 1 203-1 209.

(責(zé)任編輯： 洪江星)

Carbon dots as highly efficient photoacoustic contrast agents for biomedical imaging

PENG Qiaoli, WANG Xiaoyong, HUANG Chao, LIU Gang

(Center for Molecular Imaging and Translational Medicine, Xiamen University, Xiamen, Fujian 361102, China)

This project proposed to use C-dots as a new class of exogenous photoacoustic imaging agents. Photoacoustic images of C-dots, which are dissolved in different concentrations and different solvents, were acquired sequentially by a portable and fast photoacoustic tomography system with a hand-held transducer. The morphology and functional perfusion of the tumors angiogenesis were delineated in photoacoustic images due to the C-dots nanoparticle accumulation. No obvious toxic effect was observed by ex vivo histological examination 14 days after C-dots administration. We demonstrate the great potential of C-dots to be used as a contrast agent for molecular photoacoustic imaging in various biomedical applications, especially for photoacoustic cancer detection and diagnosis.

carbon dots; photoacoustic imaging; contrast agent; tumor angiogenesis imaging

2015-01-30

劉剛(1979-), 教授， 主要從事分子影像探針的設(shè)計(jì)、 構(gòu)建及醫(yī)學(xué)應(yīng)用評(píng)價(jià)等方面研究， gangliu.cmitm@xmu.edu.cn

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81422023, 81101101, 81371596, 51273165)； 教育部科技重點(diǎn)資助項(xiàng)目(212149)； 教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃(ncet-13-0502)

10.7631/issn.1000-2243.2015.06.0859

1000-2243(2015)06-0859-05

R914

A