MEF2A啟動(dòng)子多態(tài)性對(duì)轉(zhuǎn)錄活性及冠心病易感性的影響

劉本榮，熊玉娟，鐘 赟，莫 沛，李愛(ài)群，熊龍根

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 心血管疾病研究所，廣東 廣州510260;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床學(xué)院 檢驗(yàn)科，廣東 廣州510105)

肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A(myocyte enhancer factor 2A，EF2A)是較早被鑒定出來(lái)的與冠心病(coronary artery disease，CAD)相關(guān)的常染色體顯性基因[1]，但其遺傳多態(tài)是否與CAD 有關(guān)存在爭(zhēng)議[2]。MEF2A 屬于第二類轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，參與調(diào)控心肌轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)、肌肉組織及血管生成相關(guān)特異基因的表達(dá)[3-4]，其自身表達(dá)受到miR-1的調(diào)控[5]。MEF2A和MEF2C 缺陷型誘發(fā)擴(kuò)張性心肌病[6]，MEF2C 調(diào)控心肌發(fā)育可能是通過(guò)調(diào)控DOK5 基因的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的[7]。在小鼠模型中，MEF2A表達(dá)單倍型劑量不足更易導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣病變，MEF2A 自身的表達(dá)調(diào)控可能在CAD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，發(fā)生在其調(diào)控區(qū)的遺傳多態(tài)或變異可能是導(dǎo)致群體或個(gè)體對(duì)CAD 易感差異的重要原因，然而國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)MEF2A啟動(dòng)子區(qū)的單核苷酸多態(tài)(single nucleotide polymorphism，SNP)位點(diǎn)，利用雙螢光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)研究不同MEF2A啟動(dòng)子單倍型的轉(zhuǎn)錄活性，同時(shí)比較各單倍型在CAD組和對(duì)照組中的頻率及純合率差異。

1 材料與方法

1.1 材料

樣本收集及基因組DNA的提取:CAD 患者44名，正常對(duì)照45名，各抽取靜脈血2 mL，EDTA 抗凝。研究獲得廣州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并與受試者簽訂知情同意書。

全血基因組提取試劑盒和endo-free plasmid midi kit(廣州速研生物公司)，PCR擴(kuò)增試劑(Toyobo公司)，T 克隆載體pTZ57R/T(中晶生物公司)，限制性內(nèi)切酶Kpn Ⅰ和Bgl Ⅱ(廣州瑞真生物公司)，啟動(dòng)子載體pGL3.0 Basic、pRL-TK 和dual luciferase reporter assay system (Promega 公司)，人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮 細(xì) 胞(human coronary artery endothelial cell，HCAEC)(Sciencell 公司)，lipofectamineTM2000、引物合成和測(cè)序(Life Technology 公司)，內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基EGM-2(廣州儀濤公司)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì):以NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中MEF2A 基因序列(NC_000015)為參考序列，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer premier 5.0 進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。啟動(dòng)子區(qū)PCR擴(kuò)增引物為Kpn Ⅰ_F2AF2:cgg ggtacc CACCTATC TCAGAAAAGGCAAC;Bgl Ⅱ_ F2AR2:ggaagatct G GGGCTATTTTTAGGAGACAAG。測(cè)序引物為F2A-S1:CACCTATCTCAGAAAAGGCAAC;F2A-rS1:GGGGC TATTTTTAGGAGACAAG;MEF2AP_seq1:CGATAAG GAGGTTGCTACTG。

1.2.2 PCR擴(kuò)增:反應(yīng)體系ddH2O 13.1 μL，10×緩沖液2 μL，DMSO 2 μL，MgSO4(25 mmol/L)0.8 μL，dNTP (2.5 mmol/L)0.5 μL，Kpn Ⅰ-F2A2(10 P)0.3 μL，Bgl Ⅱ-F2AR2(10 P)0.3 μL，KOD Taq 酶(1 U/μL)，gDNA(10～30 ng/μL)0.5 μL，總體積20 μL。PCR 反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性1 min，95℃10 s，64℃30 s，68℃1 min，共34個(gè)循環(huán)，最后68℃延伸3 min。

1.2.3 載體構(gòu)建:選取12種常見(jiàn)單倍型構(gòu)建MEF2A啟動(dòng)子載體，載體命名同其代表的單倍型名稱，分別為H1、H3、H5、H6、H8、H9、H10、H13、H14、H15、H16和H17，載體構(gòu)建示意圖如圖1。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞(DH5α)，培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單克隆于3 mL LB 培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒，測(cè)序鑒定。啟動(dòng)子單倍型的確定采用T 載體克隆測(cè)序。

圖1 MEF2A啟動(dòng)子載體示意圖Fig1 Sketch map of the construction of MEF2A promoter vector

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染:HCAEC 培養(yǎng)在含2%FBS 及相關(guān)生長(zhǎng)因子的EGM-2 培養(yǎng)基中。轉(zhuǎn)染前24 h 鋪板，按5 000個(gè)細(xì)胞/cm2接種細(xì)胞，于二氧化碳培養(yǎng)箱(37℃，5% CO2)中培養(yǎng)過(guò)夜。用去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取的MEF2A啟動(dòng)子載體與pRL-TK 共轉(zhuǎn)染，按lipofectamineTM2000 說(shuō)明書操作。

1.2.5 啟動(dòng)子活性分析:細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h 進(jìn)行螢光素酶活性分析，按dual luciferase reporter assay system 說(shuō)明書操作。螢光素酶活性測(cè)定在化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀(Lumat LB 9507，德國(guó))上進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

序列比對(duì)采用clustalx1.81，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)采用 TFSEARCH (http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)，各單倍型轉(zhuǎn)錄活性比較、作圖及顯著性分析采用GraphPad Prism 5，兩單倍型間的螢光素酶活性比較采用T-test，所有單倍型的熒光素酶活性比較采用one-way ANOVA 分析，兩組間的雜合率比較采用卡方檢驗(yàn)。利用Arlequin3.5 進(jìn)行Hardy-Weinberg 平衡分析。各單倍型的螢光素酶活性以3次獨(dú)立試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。

2 結(jié)果

2.1 SNP 及單倍型分析

在1245 bp MEF2A啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)現(xiàn)9個(gè)SNP位點(diǎn)，組成18種單倍型(分別為H1，H2，…，H18)，其中H1、H5、H8 和H164種單倍型的頻率較高，占79.21%(表1)。3個(gè)SNPs 導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(transcription factor binding site，TFBS)發(fā)生改變(圖2)。其中位于啟動(dòng)子－580位C 變?yōu)锳，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子ADR1、Sp1的結(jié)合位點(diǎn)及GC Box 在此區(qū)域丟失(圖2A);－646位G 變?yōu)門，導(dǎo)致Ttk-69、HSF 結(jié)合位點(diǎn)丟失(圖2B);－948位C 變?yōu)門，導(dǎo)致Sp1 和HSF 結(jié)合位點(diǎn)丟失(圖2C)。由－948(C/T)、－646(G/T)和－580(C/A)組成的單倍型有CGC(17.98%)、CGA(3.94%)、TGA(36.51%)、TTC(33.15%)、TTA(3.94%)、TGC(3.37%)和CTC(1.69%)，其中包含TGA的單倍型轉(zhuǎn)錄活性最高。

表1 MEF2A啟動(dòng)子區(qū)的SNP位點(diǎn)及各單倍型的頻率分布Table1 The relative position of SNP sites in the promoter region of MEF2A and the frequency of each haplotype in the subjects

2.2 各單倍型啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性

H5 和H8 轉(zhuǎn)錄活性最高，H1 和H9次之，H1、H3、H6、H10、H13、H14、H15、H16和H17 最低(圖3)。含－646 T 等位基因的單倍型(H10、H14、H15、H16、H17)的轉(zhuǎn)錄活性低(圖3)。各單倍型間的轉(zhuǎn)錄活性總體差異顯著(P＜0.001)，H8的轉(zhuǎn)錄活性顯著高于其他單倍型(P＜0.05)。

2.3 冠心病的易感性與MEF2A啟動(dòng)子區(qū)的純合率呈正相關(guān)

MEF2A 近端啟動(dòng)子在CAD組中的純合率達(dá)到50%，顯著高于對(duì)照組中的28.9%(χ2= 4.155，P＜0.05)(圖4)。CAD組中的期望雜合率顯著高于實(shí)際觀測(cè)值，不符合Hardy-Weinberg 平衡(表2);在對(duì)照組中的期望雜合率與實(shí)際觀測(cè)值之間沒(méi)有明顯差異，符合Hardy-Weinberg 平衡(表2)。表明CAD 易感性與MEF2A啟動(dòng)子區(qū)的純合率存在相關(guān)性。

圖2 預(yù)測(cè)的MEF2A啟動(dòng)子區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)Fig2 The predicted transcription factor binding sites in MEF2A promoter region

表2 Hardy-Weinberg 平衡檢測(cè)結(jié)果Table2 Results of Hardy-Weinberg balance test

圖3 各MEF2A啟動(dòng)子單倍型的轉(zhuǎn)錄活性Fig3 The transcription activity of MEF2A promoter haplotypes(±s，n=3)

圖4 MEF2A 近端啟動(dòng)子的純合率Fig4 The homozygosity of the proximal promoter of MEF2A

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)MEF2A啟動(dòng)子區(qū)的SNPs 會(huì)導(dǎo)致TFBS的改變，由不同SNPs 組成的單倍型具有不同的啟動(dòng)子活性，可見(jiàn)MEF2A啟動(dòng)子區(qū)的SNPs 也許會(huì)導(dǎo)致不同個(gè)體MEF2A的表達(dá)水平差異，從而表現(xiàn)出對(duì)某些疾病易感性的差異。通常認(rèn)為，導(dǎo)致TFBS 改變的SNPs 都將致使啟動(dòng)子活性發(fā)生變化[8]，MEF2A 近端啟動(dòng)子區(qū)中有3個(gè)SNPs 可能導(dǎo)致TFBS 丟失，其中含－646(T)的啟動(dòng)子單倍型確實(shí)表現(xiàn)出較低的轉(zhuǎn)錄活性。然而，由－948、－646和－580 3個(gè)SNP位點(diǎn)組成的單倍型中，未丟失任何TFBS的單倍型并未表現(xiàn)出最高的轉(zhuǎn)錄活性，而H5 和H8 在－948 和－580位都有TFBS丟失，卻表現(xiàn)出最強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性，這種現(xiàn)象可能與基因的穩(wěn)定性選擇有關(guān)[9]。因此，僅從SNPs是否導(dǎo)致TFBS 丟失判斷其對(duì)啟動(dòng)子活性的影響未必準(zhǔn)確，必須將由不同等位基因組成的單倍型看作一個(gè)整體來(lái)考慮，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，探索單倍型與疾病的相關(guān)性也許比考察單個(gè)SNP 與疾病的相關(guān)性更重要。CAD組中MEF2A 近端啟動(dòng)子區(qū)的純合率明顯高于對(duì)照組，可能是由于MEF2A 在血管內(nèi)皮及血管平滑肌的修復(fù)和功能維護(hù)中發(fā)揮重要作用，MEF2A啟動(dòng)子區(qū)的純合狀態(tài)可能導(dǎo)致基因的表達(dá)水平不及雜合狀態(tài)穩(wěn)定，對(duì)外界刺激因子的反應(yīng)過(guò)激或過(guò)慢，從而誘發(fā)血管病變?？梢?jiàn)，MEF2A的表達(dá)水平或蛋白活性可能與CAD的發(fā)生發(fā)展有更密切的關(guān)系。

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