6種人DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3B典型異構(gòu)體的克隆、表達(dá)及對(duì)293A細(xì)胞增殖的影響

張柱霞，孫明英，楊 潔，姜樹(shù)原，石 蕊，閆少春*，邵 國(guó)，2*

(1.包頭醫(yī)學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)研究中心 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，內(nèi)蒙古 包頭014010;2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬宣武醫(yī)學(xué)院低氧醫(yī)學(xué)研究所，北京100053)

哺乳動(dòng)物細(xì)胞胞嘧啶的甲基化是細(xì)胞分裂后的細(xì)胞記憶形成的至關(guān)重要的表觀遺傳學(xué)事件，而到目前為止，具有催化活性的C5 甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)共有3種，DNMT1、DNMT3A 和DNMT3B。DNMT1的主要作用是在DNA 復(fù)制中催化新合成的DNA 子鏈(半甲基化DNA)的甲基化，從而維持基因組DNA甲基化的模式，而DNMT3A 和3B的主要作用是催化DNA 建立新的DNA甲基化模式。維持型DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT1)和從頭合成型甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT3A 和DNMT3B)功能并非涇渭分明，它們之間協(xié)同作用來(lái)對(duì)DNA 進(jìn)行修飾[1]。

到目前，發(fā)現(xiàn)人類DNMT3B 由于剪接/轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的差異造成有近40種異構(gòu)體[2-5]，DNMT3B1是最大的DNMT3B，其cDNA是4 195 bp，編碼859個(gè)氨基酸[2]。其余的異構(gòu)體與DNMT3B1 相比可以大致分為4類:1)DNMT3B3-5 和DNMT3B7 缺少DNMT3B的C 末端;2)ΔDNMT3B 家族缺少DNMT3B的N 末端[3-5];3)DNMT3BΔ5 和DNMT3BΔ(4+5)缺少DNMT3B的靠近PWWP 結(jié)構(gòu)域的一些氨基酸序列[6];4)DNMT3B2和DNMT3B6 保留了幾乎與DNMT3B1 相同的序列[7]。

雖然人們對(duì)DNMT3B異構(gòu)體進(jìn)行了部分研究，但其功能尚不十分明了，本研究通過(guò)克隆人DNMT3B 典型6種異構(gòu)體并建立真核表達(dá)載體以及其穩(wěn)定過(guò)表達(dá)細(xì)胞株，對(duì)DNMT3B 典型6種異構(gòu)體進(jìn)行初步系統(tǒng)研究。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

HCT116細(xì)胞(上海細(xì)胞所);293A細(xì)胞(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院細(xì)胞中心);Trizol(Gibcobrl 公司);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen 公司);限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ(Takara 公司);Expand High Fidelity PCR System 及rapid ligation Kit (Roche 公司);DNA 回收試劑盒(Qiagen 公司)。

1.2 方法

1.2.1 RNA 提取，RT-PCR 及PCR:利用Trizol 試劑從HCT116細(xì)胞中分離總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA，利用Expand High Fidelity PCR System進(jìn)行擴(kuò)增，所有異構(gòu)體的正向引物序列為CGGGATCCAAGGGAGACACCAGGCATCTC，DNMT3B1、DNMT3B2和DNMT3B3的反向引物序列為5'-GCGA ATTCTCACACCTCCTGGGTCCTGGCTC-3'，DNMT3-B4、DNMT3B5 和DNMT3B7的反向引物序列分別為5'-GCGAATTCCTGTTCATCCCGGGTAGG-3'、5'-GCGA ATTCCATGCAAAGTAGTCCTTC-3'和5'-GCGAATTCATATGCCTGGGTACCAGC-3'，其中GGATCC 為BamHⅠ酶切位點(diǎn)和GAATTC 為EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增條件為94℃變性5 min;94℃、30 s，56℃、60 s，72℃、300 s，30個(gè)循環(huán);72℃延伸8 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證PCR 產(chǎn)物，將大小正確的擴(kuò)增產(chǎn)物用Qiagen PCR 產(chǎn)物回收試劑盒進(jìn)行回收。

1.2.2 pCMV-DNMT3B異構(gòu)體真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定:BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ兩種限制性酶分別酶切回收的DNMT3B異構(gòu)體的片段及pCMV-2B 載體，將酶切的載體和異構(gòu)體片段用PCR 產(chǎn)物純化試劑盒純化后用rapid ligation kit 進(jìn)行連接。將DNMT3B異構(gòu)體的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5α，將轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌涂在含有Amp的平板上過(guò)夜后挑取單個(gè)克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)利用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。將提取的重組質(zhì)粒分別用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ雙酶切。將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送上海生物工程公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 穩(wěn)定表達(dá)DNMT 異構(gòu)體的細(xì)胞株的建立轉(zhuǎn)染:人胚腎293A細(xì)胞培養(yǎng)于含10% 新生牛血清RPMI1640 培養(yǎng)基的6孔板中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞匯合至70%～80%左右時(shí)，使用FUGENE HD 試劑將6種DNMT3B 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，同時(shí)轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pCMV-2B 作為對(duì)照。轉(zhuǎn)染2 d后將培養(yǎng)基中加入700 μmol/L的G418 對(duì)細(xì)胞篩選，10 d后將濾紙用胰蛋白酶浸濕后覆蓋在單克隆上，消化后再把濾紙上的細(xì)胞洗脫在96孔板里培養(yǎng)，擴(kuò)大培養(yǎng)后利用real-time PCR 選取高表達(dá)細(xì)胞株即為穩(wěn)定表達(dá)異構(gòu)體的克隆株。

利用real-time PCR 和Western blot 技術(shù)[7]對(duì)穩(wěn)定表達(dá)異構(gòu)體的克隆株在mRNA 和蛋白水平上進(jìn)行鑒定。

1.2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力:各種過(guò)表達(dá)DNMT3B表達(dá)異構(gòu)體的細(xì)胞接種于96孔板(5×103細(xì)胞/孔)，培養(yǎng)24 h后開(kāi)始檢測(cè)，連續(xù)檢測(cè)4 d，每天隨機(jī)選3個(gè)孔加入20 μL MTT(5 g/L)繼續(xù)培養(yǎng)3 h，去上清后加入150 μL DMSO 振蕩10 min后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm 波長(zhǎng)處的吸光度值(A)，以培養(yǎng)天數(shù)(D)為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS10.0 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件ANOVA 和Tukey對(duì)組間數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，數(shù)值以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。

2 結(jié)果

2.1 6種DNMT3B異構(gòu)體重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

6種DNMT3B異構(gòu)體瓊脂糖凝膠電泳鑒定為1.1 kb～2.7 kb 大小的異構(gòu)體片段和4.3 kb的pCMV-2B載體骨架(圖1)。其序列與GenBank 登記的人DNMT3B異構(gòu)體序列相同。

2.2 穩(wěn)定過(guò)表達(dá)DNMT3B異構(gòu)體細(xì)胞系的建立

G418 篩選得到高表達(dá)DNMT3B異構(gòu)體的細(xì)胞株，其在mRNA 及蛋白水平上都表達(dá)升高(圖2，3)。

圖1 質(zhì)粒PCMV-3B1、3B2、3B3、3B4、3B5 和3B7的EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切電泳圖Fig1 Electrophoresis of recombination plasmids of DNMT3B isoforms digested by EcoR Ⅰand BamH Ⅰin agarose gel

圖2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染DNMT3B異構(gòu)體細(xì)胞異構(gòu)體mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒細(xì)胞異構(gòu)體mRNA倍數(shù)Fig2 Relative abundance DNMT3B mRNA in stable over-expression DNMT3B isoform cell line to in control cell line(n=3)

圖3 Western 檢測(cè)DNMT 3B1、2、3、4、5、7 及空PCMV 在293A細(xì)胞中蛋白的表達(dá)Fig3 Western blot analysis of the over-expression protein in 293A cell line which transfected with DNMT 3B1，2，3，4，5，7 and pCMV-vector

2.3 穩(wěn)定過(guò)表達(dá)DNMT3B異構(gòu)體對(duì)293A細(xì)胞增殖的影響

將過(guò)表達(dá)DNMT3B1、DNMT3B2、DNMT3B3、DNMT3B4、DNMT3B5 和DNMT3B7 以及空載體的細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板后4天時(shí)間內(nèi)，第4 天實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞增殖情況見(jiàn)表1，第4 天293A-DNMT3B7-1 和293A-DNMT3B7-2的A值分別是293A-vector的A值的48.43% 和58.49%;293A-DNMT3B4-1 和293ADNMT3B4-2的A值分別是293A-vector的A值的58.92% 和68.83%;293A-DNMT3B3-1 和293A-DNMT3B3-2的A值分別是293A-vector的A值的60.03% 和62.03% (P＜0.01)(圖4)。

表1 MTT法測(cè)定過(guò)表達(dá)DNMT3B異構(gòu)體第4天細(xì)胞數(shù)量(490 nm)Table1 The amount of cells which over-expression DNMT3B isoform on the 4th day by MTT method(490 nm)

圖4 MTT法分析DNMT3B異構(gòu)體過(guò)表達(dá)對(duì)293A細(xì)胞增殖的影響Fig4 MTT analysis of the effect of over-expression DNMT3B isoform on the proliferation of 293A

3 討論

剪接/轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的差異造成了DNMT3B 有近40種異構(gòu)體或拼接體[2-5]。典型的DNMT3B的異構(gòu)體與DNMT1類似或缺少C 末端的，由于C 末端有甲基轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)域，其中結(jié)構(gòu)域Ⅰ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅷ、Ⅸ和Ⅹ為保守結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域?qū)τ诩谆D(zhuǎn)移酶活性是必需的。DNMT3B3 缺少結(jié)構(gòu)域Ⅷ;DNMT3B4缺少結(jié)構(gòu)域Ⅷ、Ⅸ和Ⅹ;DNMT3B5 在結(jié)構(gòu)域缺Ⅵ之后氨基酸序列發(fā)生變化，也缺少保守結(jié)構(gòu)域Ⅷ、Ⅸ和Ⅹ;DNMT3B7 終止于內(nèi)含子10，其缺少C端催化序列[8-9]，因而推測(cè)這4種都無(wú)甲基轉(zhuǎn)移酶活性。

將克隆的6種異構(gòu)體轉(zhuǎn)入293A細(xì)胞觀測(cè)其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，結(jié)果顯示穩(wěn)定過(guò)表達(dá)DNMT3B3、DNMT3B4 和DNMT3B7 降低了細(xì)胞的增殖速度。有研究報(bào)道分離DNMT3A 與DNMT3B 并檢測(cè)其甲基轉(zhuǎn)移酶活性，發(fā)現(xiàn)DNMT3A 與DNMT3B 甲基轉(zhuǎn)移酶活性較其他種類的甲基轉(zhuǎn)移酶活性低很多，而將兩者混合的活力則比二者單獨(dú)測(cè)總和高40%。因此，在生物體內(nèi)兩種甲基轉(zhuǎn)移酶可能通過(guò)蛋白-蛋白相互作用來(lái)發(fā)揮其生物學(xué)作用，推斷異構(gòu)體不影響兩者相互作用[10]。同時(shí)，無(wú)活性的異構(gòu)體DNMT3B3和DNMT3B4 可以結(jié)合并調(diào)節(jié)有催化活性的DNMT3A 和DNMT3B 分子的催化活力[11]。因而當(dāng)過(guò)表達(dá)沒(méi)有活性的DNMT3B的異構(gòu)體則可能干擾有活性的DNMT3B的異構(gòu)體與DNMT3A的相互作用而影響DNA甲基化，而DNA甲基化變化則很可能對(duì)于細(xì)胞周期產(chǎn)生影響。結(jié)果顯示DNMT3B3、DNMT3B4 和DNMT3B7 降低了細(xì)胞增殖速度可能是緣于此。有趣的是DNMT3B5 同DNMT3B7 等一樣是無(wú)甲基轉(zhuǎn)移酶活力的異構(gòu)體，但過(guò)表達(dá)DNMT3B5 對(duì)細(xì)胞的增殖速度并沒(méi)有產(chǎn)生明顯的影響。不同的異構(gòu)體在細(xì)胞核中的定位不同，其生物學(xué)功能可能有差異[6]。因此無(wú)活性的DNMT3B5 可能由于細(xì)胞定位的差異不影響有催化活力的DNMT3A 和DNMT3B，所以過(guò)表達(dá)不影響其細(xì)胞增殖。

本文克隆并構(gòu)建了6種DNMT3B異構(gòu)體真核表達(dá)載體，將6種異構(gòu)體穩(wěn)定表達(dá)于293A細(xì)胞中并初步研究了其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。DNMT3B的異構(gòu)體由于其有無(wú)甲基轉(zhuǎn)移酶活力而對(duì)細(xì)胞的增殖產(chǎn)生了差異，但無(wú)轉(zhuǎn)移酶活力的DNMT3B5 與其他的無(wú)活力的DNMT3B異構(gòu)體的作用不同，所以不同的DNMT3B異構(gòu)體的功能可能差異較大，僅僅從有無(wú)轉(zhuǎn)移酶活力還不能明確其對(duì)細(xì)胞的作用，因而要明確各種異構(gòu)體的功能仍需進(jìn)一步的研究。

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