解毒祛瘀滋腎方干預(yù)TLR9信號通路對MRL/lPr狼瘡小鼠腎臟的保護作用

張 莉，羊 唯，曹靈勇，謝志軍

(1.杭州市中醫(yī)院，杭州 310005；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，杭州 310053）

解毒祛瘀滋腎方干預(yù)TLR9信號通路對MRL/lPr狼瘡小鼠腎臟的保護作用

張 莉1，羊 唯2，曹靈勇2，謝志軍2

(1.杭州市中醫(yī)院，杭州 310005；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，杭州 310053）

目的基于對TLR9-MyD88-NF-κB通路的干預(yù)作用，闡明解毒祛瘀滋腎方對狼瘡鼠腎臟的保護作用。方法 將30只MRL/lPr狼瘡鼠隨機分為模型對照組、潑尼松治療組、中藥組共3組，對各治療組進行相應(yīng)的藥物治療，療程8周。采用HE染色法、PAS染色法、Masson染色法分別對MRL/lPr小鼠腎臟切片進行病理染色，觀察比較3組小鼠病理變化及治療效果；采用real-time PCR法觀察比較各組小鼠TLR-9、MyD88、NF-κB mRNA表達量的差異。結(jié)果 與模型組比較，中藥組能明顯改善MRL/lPr小鼠的腎組織病理損傷。Real-time PCR法結(jié)果顯示：中藥組MRL/lPr小鼠的腎組織TLR-9、MyD88、NF-κB mRNA表達均低于模型組(均為P＜0.05）。結(jié)論 解毒祛瘀滋腎方對MRL/lPr小鼠腎臟具有保護作用，可對其病理變化產(chǎn)生影響，減輕其腎臟損害，延緩病程，并與解毒祛瘀滋腎方對MRL/lPr小鼠TLR-9-MyD88-NF-κB信號通路的抑制作用相關(guān)。

系統(tǒng)性紅斑狼瘡；MRL/lPr小鼠；解毒祛瘀滋腎方

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic luPus erythematosus，SLE）是一種可累及多系統(tǒng)的以免疫性炎癥為突出表現(xiàn)的自身免疫性疾病。腎臟損害是其重要的臨床表現(xiàn)。目前關(guān)于SLE的發(fā)病原因及機理仍不十分明確，研究發(fā)現(xiàn)［1］，Toll樣受體9(TLR-9）信號通路在該病的發(fā)生中起著重要作用，細菌、病毒和凋亡細胞作為TLR-9的外源性、內(nèi)源性配體，可被其特異性識別，繼而激活多種細胞因子轉(zhuǎn)錄表達，誘導(dǎo)B細胞多克隆增殖活化，產(chǎn)生自身抗體。前期研究表明，解毒祛瘀滋腎方治療SLE具有較好的療效。本研究以TLR-9通路為切入點，采用病理學(xué)及免疫分子生物學(xué)實驗手段進行研究，以闡明解毒祛瘀滋腎方治療SLE增效減毒作用的機理，為臨床運用中醫(yī)藥減少SLE的損傷及新型藥物的開發(fā)提供實驗依據(jù)及理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 動物

SPF級MRL/lPr狼瘡小鼠，雌性，14周齡，體重(33.90±3.02）g，共30只，由中科院上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司從美國Jackson實驗室引種培育［SCXK滬2012-0002］；飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心SPF小鼠屏障飼養(yǎng)室 ［SYXK (浙）2013-0184］），室溫20℃，相對濕度40％ ～60％，每日光照12 h，自由攝食、飲水，均依3R原則進行人道關(guān)懷。

1.2 主要藥品與試劑

潑尼松片：5 mg/片(浙江仙琚制藥股份有限公司，批號：111129）。藥品劑量根據(jù)人和動物用量轉(zhuǎn)換公式確定，藥品溶液的配制：(1）潑尼松混懸液：將潑尼松片溶于0.9％的生理鹽水，配制成2.162 mg/mL混懸液。(2）中藥湯劑：將解毒祛瘀滋腎方中藥生地15 g、炙鱉甲12 g、炒米仁15 g、青蒿12 g、赤芍12 g、積雪草15 g、升麻9 g、佛手9 g、白花蛇舌草15 g、生甘草6 g煎煮濃縮成生藥含量1.82 g/mL。糖原染色液(PSA）試劑盒(珠海貝索生物技術(shù)有限公司），Masson三色染色液試劑盒(珠海貝索生物技術(shù)有限公司）。

1.3 分組與用藥品

小鼠在SPF級封閉狀態(tài)下正常飼料喂養(yǎng)，觀察并記錄體重、毛色，監(jiān)測尿蛋白變化。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后(8周齡）按體重將30只MRL/lPr小鼠隨機分成3組，即模型組、潑尼松治療組、中藥(解毒祛瘀滋腎方）組，每組8只小鼠。模型組給予生理鹽水0.2 mL/d灌胃、潑尼松治療組給予上述相應(yīng)的潑尼松混懸液10 mg/kg·d灌胃、中藥組給予解毒祛瘀滋腎方中藥復(fù)方濃縮液24 g/kg·d灌胃。

1.4 標(biāo)本采集

連續(xù)飼養(yǎng)用藥8周后處死全部小鼠，處死前1 d晚上禁食，于次日上午9：00～10：00，分離腎臟，右側(cè)腎臟液氮冷凍后，-80℃超低溫冰箱凍存，左側(cè)腎臟用4％中性甲醛溶液固定，備用。

1.5 腎組織病理學(xué)檢查

腎組織經(jīng)固定浸臘與石臘包埋后以輪轉(zhuǎn)式切片機將蠟塊切成薄片，厚度3～5 μm，并移入(70～80）℃溫箱中烘烤40～50 min；然后分別進行蘇木精-伊紅(HE）染色、糖原染色(PSA）和Masson三色染色，中性樹膠封片。

1.6 Real-time PCR 法檢測腎組織 TLR9、MyD88、NF-κB mRNA水平

取凍存的各組小鼠腎組織100 mg勻漿，提取總RNA，RT-PCR合成cDNA，real-time PCR檢測TLR9、MyD88、NF-κB mRNA水平，以 GAPDH為內(nèi)參，TLR9、MyD88、NF-κB mRNA和GAPDH引物序列見表1。

表1 TLR9、MyD88、NF-κB mRNA和GAPDH引物序列Tab.1 Primer sequences of TLR9、MyD88、NF-κB mRNA and GAPDH

2 結(jié)果

2.1 各組腎組織病理變化

各組MRL/lPr小鼠腎組織HE染色顯示：模型組呈現(xiàn)中到重度系膜細胞增多，系膜基質(zhì)顯著增寬，腎小球呈節(jié)段性硬化，毛細血管內(nèi)皮細胞大量增生，管腔狹窄明顯，病變程度在各組中最為嚴(yán)重；中藥組可見輕度系膜細胞增多，系膜基質(zhì)增寬，少量毛細血管內(nèi)皮細胞增生，毛細血管管腔狹窄；潑尼松組系膜區(qū)輕度增寬，腎小球系膜細胞節(jié)段性增多，腎間質(zhì)炎癥細胞浸潤不明顯，其病變?yōu)楦鹘M最輕。PAS染色顯示：模型組呈現(xiàn)明顯的陽性反應(yīng)，系膜細胞及基質(zhì)均明顯增多，腎小球系膜、基底膜以及腎小管均可見大量淋巴細胞浸潤，病變程度在各組中最為嚴(yán)重。中藥組呈陽性反應(yīng)，系膜細胞及基質(zhì)輕度增多，系膜基質(zhì)增寬，少量腎小球系膜、基底膜以及腎小管可見淋巴細胞浸潤。潑尼松組呈陽性反應(yīng)，系膜細胞及基質(zhì)增多不明顯，腎小球系膜、基底膜、以及腎小管淋巴細胞浸潤不明顯，為各組病變最輕。Masson染色顯示：模型組可見大量藍色膠原物沉積，腎小球呈現(xiàn)節(jié)段性硬化，大量細胞增生，使腎小球呈分葉狀，腎間質(zhì)纖維化，腎小球毛細血管管壁顯著增厚，腎小球系膜、基底膜可見大量嗜復(fù)紅物沉積，病變程度為各組中最重。中藥組可見少量藍色膠原物沉積，腎小球毛細血管管壁無明顯增厚，腎小球系膜、基底膜可見少量嗜復(fù)紅物沉積。潑尼松組可見少量藍色膠原物沉積，腎小球毛細血管管壁無明顯增厚，腎小球系膜、基底膜嗜復(fù)紅物沉積不明顯，病變?yōu)楦鹘M最輕。詳見圖1～3 (見封二）。

2.4 解毒祛瘀滋腎方對 MRL/lpr小鼠 TLR9、MyD88、NF-κB mRNA的影響

Real-time PCR法檢測腎組織的結(jié)果顯示：中藥組TLR-9 mRNA、MyD88 mRNA、NF-κB mRNA水平均顯著低于模型組(P＜0.01）；潑尼松組 TLR-9 mRNA、MyD88 mRNA、NF-κB mRNA水平均顯著低于模型組(P＜0.01）；中藥組與潑尼松組 TLR-9 mRNA、MyD88 mRNA、NF-κB mRNA水平的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05）(圖4）。

3 討論

SLE該病多發(fā)于15～40歲中、青年女性，男女發(fā)病比例為1：7～9，腎臟損害為SLE常見的較嚴(yán)重的并發(fā)癥，同時為導(dǎo)致SLE患者死亡的重要原因之一。臨床腎臟受累者可見于2/3狼瘡患者，一般認(rèn)為30歲以下患者腎臟受累率高，大部分腎損害發(fā)生于皮疹、關(guān)節(jié)炎等全身受累之后，約1/4病人以腎臟癥狀為首發(fā)表現(xiàn)。約75％的SLE患者可出現(xiàn)蛋白尿，血尿，管型尿及其他腎功能損害，約95％SLE患者光鏡下病理檢查可出現(xiàn)異常［2，3］。目前關(guān)于SLE的發(fā)病機理仍然不是十分明確，但多數(shù)認(rèn)為與感染、遺傳、性激素、環(huán)境、免疫紊亂等多種因素有關(guān)，但無論哪種致病因素，最終均需通過使淋巴細胞過度活化，致使免疫復(fù)合物沉積在腎臟而導(dǎo)致腎臟的繼發(fā)性損害。而細菌、病毒和凋亡細胞作為TLR-9的外源性、內(nèi)源性配體，可被其特異性識別，繼而激活多種細胞因子轉(zhuǎn)錄表達，誘導(dǎo)B細胞多克隆增殖活化，產(chǎn)生自身抗體。

圖4 腎組織TLR-9/MyD88/NF-κB mRNA水平比較(RT-PCR）(與模型組比較，**P＜0.01）。Fig.4 ComParison of mRNA levels of TLR 9/MyD88/NF-κB in the mouse renal tissues determined by RT-PCR.ComPared with the model grouP，**P＜0.01.

中醫(yī)認(rèn)為其病因病機主要為先天稟賦不足，或熱毒侵犯人體，或七情內(nèi)傷，五志過及，飲食勞倦而生內(nèi)熱，煎熬陰液最終導(dǎo)致瘀熱。陰虛、瘀熱互結(jié)為本病重要病機，由于本病病程長，常在后期出現(xiàn)本虛標(biāo)實，虛實兼夾的病機［4］。中醫(yī)臨床治療本病常用清熱解毒，活血化瘀，益腎養(yǎng)陰之法。有研究顯示［5］，解毒祛瘀滋腎方配合糖皮質(zhì)激素等治療SLE可減輕西藥的副作用，減少并發(fā)癥，提高患者生活質(zhì)量。

Toll樣受體(TLRs）信號通路是固有免疫中的一個非常重要的通路［6］。多種因素導(dǎo)致的異常凋亡的細胞產(chǎn)物可與多種細胞的TLRs結(jié)合，促進炎癥細胞因子產(chǎn)生，并激活B細胞產(chǎn)生多種自身抗核抗體，如抗dsDNA抗體等?？筪sDNA抗體與SLE疾病活動及狼瘡腎炎有顯著相關(guān)性［7］。SLE患者腎組織可見抗原抗體復(fù)合物及補體沉積，腎小球存在單核細胞/巨噬細胞浸潤［8，9］和淋巴細胞浸潤［10］。研究表明［11-13］，MCP-1、IL-8等趨化因子導(dǎo)致的炎性細胞浸潤是狼瘡腎炎的重要病理機制。TLRs在炎性細胞分泌MCP-1、IL-8等趨化因子中發(fā)揮了重要作用。TLR9主要存在于細胞內(nèi)囊泡，配體活化后可激活NF-κB，產(chǎn)生多種細胞因子、趨化因子和粘附分子。增生性和膜性狼瘡腎炎的腎小球和小管間質(zhì)高表達TLR-9，表明TLR-9可促進狼瘡患者的腎臟損傷［14-16］。從SLE患者提純的DNA抗原抗體復(fù)合物中的DNA平均序列長度為180 bP，與凋亡細胞的染色體裂解片段長度相符，其中的CPG二核苷酸出現(xiàn)頻率是健康人的5～6倍［17］。TLR-9可特異性結(jié)合微生物及哺乳動物CPG DNA［18-20］?；顒有岳钳從I炎患者血清提純的包含非甲基化CPG DNA序列的DNA抗原抗體復(fù)合物可通過TLR-9通路刺激B細胞和漿細胞樣樹突狀細胞(PDC）活化并分泌趨化因子(MCP-1、IL-8等）和細胞因子［21，22］。但DNA抗原抗體復(fù)合物如何通過TLR-9通路刺激狼瘡腎系膜細胞活化并分泌趨化因子未見報道。

本研究基于對TLR-9信號通路，對解毒祛瘀滋腎方對MRL/lPr狼瘡樣小鼠的腎臟保護作用進行了研究，結(jié)果表明：模型組小鼠腎組織HE染色可見重度系膜細胞增生，系膜基質(zhì)增寬，腎小球呈節(jié)段性硬化，毛細血管管腔明顯狹窄，細胞外基質(zhì)可見大量炎性細胞浸潤，PAS染色示系膜區(qū)顯著增寬，系膜細胞及基質(zhì)均明顯增多，基底膜可見淋巴細胞浸潤，Masson染色示大量藍色膠原物沉積，腎小球呈現(xiàn)節(jié)段性硬化，大量細胞增生，使腎小球呈分葉狀，腎間質(zhì)纖維化，腎小球毛細血管管壁顯著增厚，腎小球系膜、基底膜可見大量嗜復(fù)紅物沉積，而中藥組及潑尼松組病理表現(xiàn)明顯減輕，可見解毒祛瘀滋腎方MRL/lPr小鼠腎臟病理損傷具有明顯的改善作用。進一步研究顯示，解毒祛瘀滋腎方能明顯抑制 MRL/lPr小鼠腎臟中 TLR-9、MyD88、NF-κB mRNA水平(與模型組比較，其差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，且均為P＜0.01），且中藥組與潑尼松組相比無顯著差異(P＞0.05）。說明解毒祛瘀滋腎方與潑尼松均能顯著影響MRL/lPr小鼠腎臟中 TLR-9、MyD88、NF-κB mRNA水平，從而發(fā)揮其腎臟保護作用。

在本研究的基礎(chǔ)上，我們將進一步研究解毒祛瘀滋腎方是如何抑制TLR-9信號通路而發(fā)揮作用，并進一步研究該方是否對其它TLR家族成員具有抑制作用。

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Protective action of Jie-Du-Qu-Yu-Zi-Shen prescription in treating lupus nephritis of MRL/lpr mice through inhibiting the TLR9 pathway

ZHANG Li1，YANG Wei2，CAO Ling-yong2，XIE Zhi-jun2
(1.Chinese Medical HosPital of Hangzhou City，Hangzhou 310005，China；2.Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310053）

Objective To clarify the Protective action of a Chinese medicine，Jie-Du-Qu-Yu-Zi-Shen PrescriPtion，on the luPus nePhritis in MRL/lPr mice through the TLR9-MyD88-NF-κB signaling Pathway.Methods Thirty MRL/lPr mice were randomly divided into model grouP，Prednisone grouP，and traditional Chinese medicine(TCM）grouP(n=10）.Each treatment grouP

aPProPriate treatment or drug theraPy for 8 weeks.The Pathological changes of mouse renal tissues in the three grouPs were examined and comPared using HE，PAS，and Masson staining.Real-time PCR was Performed to comPare the exPression of TLR-9，MyD88，NF-κBm RNA mRNA in each grouP of the mice.Results ComPared with the model grouP，the Chinese medicine Jie-Du-Qu-Yu-Zi-Shen PrescriPtion significantly imProved the renal Pathological tissue damages in the MRL/lPr mice.Real-time PCR assay showed that the exPression levels of TLR-9，MyD88，NF-κB mRNA in the TCM grouP were significantly lowered(P＜0.01 for all）.The differences between the TCM grouP and Prednisone grouP were statistically not significant(P＞0.05）.Conclusions Jie-Du-Qu-Yu-Zi-Shen PrescriPtion has Protective effect on the kidney of MRL/lPr mice，alleviating its Pathological changes，and delaying thedisease course，Probably，through inhibiting the TLR-9-MyD88-NF-κB signaling Pathway in the kidneys of MRL/lPr mice.

Systemic luPus erythematosus；LuPus nePhritis；MRL/lPr mice；Jie-Du-Qu-Yu-Zi-Shen PrescriPtion

R-33 < class="emphasis_bold">【文獻標(biāo)識碼】A

A

1671-7856（2015）09-0014-04

10.3969.j.issn.1671.7856.2015.009.003

高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金(No.20123322120001）；國家自然科學(xué)基金(No.81273680）。

張莉(1979-），碩士，主治醫(yī)師，E-mail：tomorrow123go@163.com。

謝志軍，副研究員，碩士生導(dǎo)師，E-mail：xzj575@163.com。

2015-07-25