熒光定量基因擴(kuò)增法與萋-尼抗酸染色法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的比較

趙晶 葛存興 王宏志 余敏紅 馬海玲

熒光定量基因擴(kuò)增法與萋-尼抗酸染色法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的比較

趙晶 葛存興 王宏志 余敏紅 馬海玲

目的 對(duì)熒光定量基因擴(kuò)增法(FQ-PCR法)和萋-尼抗酸染色法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的準(zhǔn)確性和陽(yáng)性率進(jìn)行比較。方法 88例肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本, 分別用FQ-PCR法和萋-尼抗酸染色法進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)比兩種方法的檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果 FQ-PCR法有55例陽(yáng)性, 檢出率為62.5%, 萋-尼抗酸染色法檢測(cè)有20例陽(yáng)性, 檢出率為22.7%, 明顯低于FQ-PCR法。結(jié)論 在檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的方法中, FQ-PCR法的檢出率明顯高于萋-尼抗酸染色法的檢出率, 所以在臨床診療工作當(dāng)中, 臨床醫(yī)生應(yīng)該更多選擇FQ-PCR法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌, 以便在肺結(jié)核的早期診斷和早期治療中發(fā)揮更大的作用。

熒光定量基因擴(kuò)增法；萋-尼抗酸染色法；結(jié)核分枝桿菌

結(jié)核病是青少年人容易發(fā)生的一種慢性和緩發(fā)的傳染病, 一年四季都可以發(fā)病, 15～35歲的青少年是結(jié)核病的高發(fā)峰年齡。潛伏期4～8周, 其中80%發(fā)生在肺部, 人與人之間呼吸道傳播是結(jié)核病傳染的主要方式, 人體感染結(jié)核病后不一定發(fā)病, 當(dāng)?shù)挚沽档突蚣?xì)胞介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)增高時(shí),才可能引起臨床發(fā)病, 若能及時(shí)診斷并給予合理的治療, 大多可獲得臨床痊愈。目前從痰標(biāo)本中檢測(cè)出結(jié)核分枝桿菌仍是臨床診斷是否感染肺結(jié)核的重要方法之一, 因此及時(shí)發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌對(duì)該病的早期診斷, 及早用藥治療都重要的作用。本文對(duì)88例肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本分別用FQ-PCR法和萋-尼抗酸染色法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌, 并對(duì)兩種方法的檢出率進(jìn)行評(píng)價(jià), 現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 88例痰標(biāo)本全部來(lái)自本院住院肺結(jié)核患者, 88例患者已經(jīng)根據(jù)癥狀、影像學(xué)、細(xì)胞學(xué)等指標(biāo)確診為肺結(jié)核感染。其中男50例, 女38例。樣本留取時(shí)要求患者在清晨用清水漱口后, 從深喉部咳出痰1～2口放入一次性無(wú)菌痰盒中, 加蓋送檢。注意痰標(biāo)本應(yīng)避免混入吐沫, 最好是干酪樣或膿樣黏痰。

1.2 試劑與儀器 熒光定量基因擴(kuò)增分析儀為ABI7300型,使用的配套試劑均由中山大學(xué)達(dá)安基因公司提供, 痰萋-尼抗酸染色法采用珠海貝索生物技術(shù)公司的成套試劑 。

1.3 方法

1.3.1 FQ-PCR法 將送檢的痰標(biāo)本按結(jié)核分枝桿菌特異性基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行操作, 最后放入ABI7300分析儀, 按說(shuō)明書(shū)設(shè)置好反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè),進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后, 利用軟件建立標(biāo)準(zhǔn)曲線自動(dòng)分析每一個(gè)標(biāo)本的拷貝數(shù), 判斷結(jié)果。

1.3.2 痰萋-尼抗酸染色法 用無(wú)菌棉簽挑取干酪樣或膿樣黏痰, 在2張玻片上均勻涂抹, 可以適當(dāng)增加涂片的厚度,自然干燥后, 在酒精燈外焰上反復(fù)穿過(guò)2～3次固定, 按照操作規(guī)程進(jìn)行萋-尼抗酸染色法染色, 染色自然晾干后鏡檢,在藍(lán)色背景下尋找被染成紅色的結(jié)核分枝桿菌。2張涂片當(dāng)中只要有一張查到結(jié)核分枝桿菌為陽(yáng)性。

2 結(jié)果

88例結(jié)核患者痰樣本用FQ-PCR法和萋-尼抗酸染色法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌檢出率比較, 見(jiàn)表1。

表1 兩種方法檢測(cè)88例痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性率比較(n, %)

3 討論

結(jié)核病是一個(gè)全球性的問(wèn)題, 近年來(lái)在世界范圍內(nèi)廣泛流行, 且呈增長(zhǎng)的趨勢(shì), 全球1/3約20億)已感染了結(jié)核分枝桿菌, 如不采取措施今后10年內(nèi)還將有3億人受結(jié)核菌(tubercle bacillus, TB)感染。當(dāng)前, 結(jié)核病的死亡率達(dá)歷史最高水平, 全球每年約200萬(wàn)人死于結(jié)核病。特別是在發(fā)展中國(guó)家, 其發(fā)病率較高, 危害性極大, 98%的死亡患者和95%的新發(fā)患者都在發(fā)展中國(guó)家, 隨著艾滋病的流行, 其并發(fā)癥肺結(jié)核的問(wèn)題也日益嚴(yán)重［1］。我國(guó)結(jié)核病的疫情也非常嚴(yán)峻,我國(guó)結(jié)核病患者的數(shù)量位居世界第二位, WHO在最近公布的結(jié)核病疫情資料中顯示, 我國(guó)已成為需要引起特別警示和關(guān)注的國(guó)家和地區(qū)之一。我國(guó)衛(wèi)生部門(mén)發(fā)布的傳染病疫情報(bào)告中提到, 目前肺結(jié)核的發(fā)病例數(shù)和死亡例數(shù)均居我國(guó)現(xiàn)有法定傳染病的第二位, 與以往相比, 近幾年結(jié)核病的發(fā)病率呈明顯上升現(xiàn)象。由此可見(jiàn), 我國(guó)目前結(jié)核病尚未得到有效控制, 作為醫(yī)務(wù)人員在結(jié)核病的早期預(yù)防和診療的工作任務(wù)仍然十分艱巨。

結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室檢查常見(jiàn)的有直接涂片查找抗酸桿菌、培養(yǎng)法、血清抗體檢查及FQ-PCR法, 確診需要結(jié)合接觸史,臨床癥狀, 影像學(xué)檢查［2］。直接涂片萋-尼抗酸染色法查找結(jié)核分枝桿菌優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便、廉價(jià)、不需要特殊儀器設(shè)備, 適合基層醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展, 缺點(diǎn)是陽(yáng)性率低, 靈敏度差, 本文的檢出率也只有22.7%, 由于涂片陽(yáng)性率低致使大量結(jié)核病患者漏診或誤診, 嚴(yán)重影響了臨床診治的需要。

PCR是一種根據(jù)DNA復(fù)制原理設(shè)計(jì)的體外DNA或RNA擴(kuò)增方法, 自1989年引入結(jié)核病的診斷以來(lái), 很快成為結(jié)核病診斷領(lǐng)域中備受關(guān)注的焦點(diǎn)。熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)是一種先進(jìn)的PCR產(chǎn)物量化檢測(cè)技術(shù), 能夠?qū)CR擴(kuò)增的每一個(gè)循環(huán)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控, 這種方法將先進(jìn)的光學(xué)設(shè)備、溫控技術(shù)、熒光素標(biāo)記技術(shù)以及計(jì)算機(jī)有機(jī)結(jié)合, 具有較高的敏感性和特異性, 而且能夠消除普通PCR的平臺(tái)效應(yīng)的影響。目前已廣泛用于目的基因的定量檢測(cè), 熒光定量PCR技術(shù)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)有：①由于多使用了一條熒光探針, 可由擴(kuò)增分析儀自動(dòng)收集熒光信號(hào), 避免了主觀判斷的誤差, 所以特異性更強(qiáng), 靈敏度更高。②完全封閉的反應(yīng)系統(tǒng), 可以減少污染, 確保了檢測(cè)結(jié)果的可靠性。③采用對(duì)數(shù)分析, 定量結(jié)果更準(zhǔn)確可靠定量范圍廣。④可實(shí)現(xiàn)單管雙檢或多檢, 還可設(shè)計(jì)針對(duì)性內(nèi)標(biāo), 以排除抑制劑干擾。本文結(jié)果表明88例結(jié)核患者送檢的痰標(biāo)本用FQ-PCR法檢測(cè)其中55例呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果, 檢出率62.5%遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于痰涂片萋-尼抗酸染色法的22.7%, 這與國(guó)內(nèi)其他文獻(xiàn)的相關(guān)報(bào)道基本相似［3］。

綜上所述, FQ-PCR法是檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染靈敏度和檢出率都比較高的一種方法, 對(duì)早期診斷、合理治療結(jié)核病有很大的幫助, 所以在臨床診療工作當(dāng)中, 臨床醫(yī)生應(yīng)該更多選擇FQ-PCR法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌取代痰涂片萋-尼抗酸染色法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌。

［1］ Dye C, Scheele S, Dolin P, et al.Global burden of tuberculosis; estimated incidence, prevalence and mortality by country.JAMA, 1999(282):677-686.

［2］ 周為鴻.結(jié)核診斷金標(biāo)準(zhǔn)探討.國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2010, 31(3):260.

［3］ 張翊, 盧建平, 葉淼.四種結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)方法的臨床應(yīng)用評(píng)價(jià).中國(guó)防癆雜志, 2006, 28(1):14-17.

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.03.045

2014-10-16］

163316 大慶市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科