草菇cat1基因序列分析及其低溫脅迫下定量表達研究

趙 妍,林 鋒,2，+，姜 威,顏素雅,陳明杰,2,*

(1.上海市農業(yè)科學院食用菌研究所,上海市農業(yè)遺傳育種重點開放實驗室,農業(yè)部南方食用菌資源利用重點實驗室,國家食用菌工程技術研究中心,上海 201403;2.上海海洋大學食品學院,上海 201306)

草菇cat1基因序列分析及其低溫脅迫下定量表達研究

趙 妍1,林 鋒1,2，+，姜 威1,顏素雅1,陳明杰1,2,*

(1.上海市農業(yè)科學院食用菌研究所,上海市農業(yè)遺傳育種重點開放實驗室,農業(yè)部南方食用菌資源利用重點實驗室,國家食用菌工程技術研究中心,上海 201403;2.上海海洋大學食品學院,上海 201306)

為了探討草菇過氧化氫酶cat1基因在低溫脅迫下的變化情況,進一步了解草菇低溫自溶的相關機制。本研究首先對草菇過氧化氫酶cat1基因的序列進行分析,并以低溫敏感型菌株V23與耐低溫型菌株VH3為實驗材料,比較了低溫脅迫下過氧化氫酶cat1基因在草菇不同菌株中的相對表達量差異。結果表明:草菇cat1基因的cDNA序列包含2274bp的開放閱讀框,編碼1個由757個氨基酸殘基組成的蛋白質;對該基因蛋白質翻譯產物Cat1進行的生物信息學分析表明,草菇與灰蓋鬼傘、褐腐菌、雙孢蘑菇、粉孢革菌、毛韌革菌等親緣關系都很近,草菇的Cat1較為保守,且序列中存在著一個過氧化氫酶功能域;低溫脅迫下草菇不同菌株的cat1基因實時熒光定量PCR結果顯示,在整個低溫處理期間,V23和VH3菌絲中的cat1基因相對表達量均整體呈下降趨勢,但在相同低溫處理時間下,VH3的cat1基因相對表達量始終高于V23。研究表明,草菇cat1基因的相對高表達可能與其耐低溫能力有關,這將為解決草菇保鮮過程中的低溫自溶問題提供一定的理論基礎。

草菇,低溫,過氧化氫酶cat1基因,實時熒光定量PCR,生物信息學

草菇[Volvariellavolvacea(Bull.)Singer]是一種原產自中國熱帶與亞熱帶地區(qū)的腐生性真菌[1],其味道鮮美、營養(yǎng)豐富,因而備受廣大消費者喜愛。與此同時,草菇不僅能利用農業(yè)廢棄物生產子實體,并且其栽培下腳料還能被制成有機肥,從而實現農業(yè)固廢循環(huán)的高效利用[2]。雖然我國草菇產量已約占世界總產量的3/4,但目前仍遠不能滿足市場需求,因此草菇產業(yè)發(fā)展?jié)摿薮骩3]。由于草菇喜在高溫、高濕的環(huán)境下生長[4],常規(guī)低溫冷藏0～4℃時,便會引起其菌絲體發(fā)生自溶死亡,子實體亦會滲水、褐變、產生異味[5]。草菇這種不耐低溫儲運的特性,嚴重制約了鮮草菇的生產和流通,因此對草菇低溫應答機制的研究成為亟待解決的科學問題。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

草菇菌株V23、VH3 上海市農業(yè)科學院食用菌研究所菌種保藏中心提供。TaqDNA Polymerase in Storage Buffer B、pGEM?-T Easy Vector System I Promega公司;PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR?PremixExTaqTMⅡ TaKaRa公司;AxyPrepTMDNA Gel Extraction Kit 愛思進生物技術有限公司;Redzol試劑盒 北京賽百盛基因技術有限公司;TOP10感受態(tài)細胞 天根生化科技有限公司;質粒小量制備試劑盒 上海捷瑞生物工程有限公司;馬鈴薯葡萄糖肉湯 碧迪醫(yī)療器械有限公司;其它試劑均為市售分析純。PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯提取物200g,葡萄糖20g,瓊脂20g,加蒸餾水定容至1L,121℃滅菌15min;馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基按照說明書配制。

5810R型高速冷凍離心機 Eppendorf公司;DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司;制冰機 美國格蘭特公司;超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司;島津紫外可見分光光度計UV-1800 日本SHIMADZU公司;EC3 Imaging System凝膠成像系統(tǒng) SYNGENE公司;PCR擴增儀 TaKaRa公司;StepOne Plus熒光定量PCR儀 Applied Biosystems 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 生物信息學分析 采用NCBI的ORF Finder程序預測cat1基因的開放閱讀框(Open reading frame,ORF),并獲得氨基酸序列。使用ExPASy ProtParam在線分析工具預測Cat1蛋白的理化性質、分子量、等電點。將cat1基因編碼的氨基酸在http://smart.embl-heidelberg.de/網站上進行在線分析,獲得該蛋白質Cat1所包含的功能域。同時,利用SWISS-Model預測和模擬草菇Cat1蛋白質的三級結構。

1.2.2 草菇菌絲的培養(yǎng)與低溫處理 將草菇V23和VH3的菌絲轉接到PDA固體培養(yǎng)基上,置于32℃恒溫培養(yǎng)4d。向勻漿器中加入100mL馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)液,將長滿菌絲的培養(yǎng)基加入勻漿器中,打碎后將勻漿轉接入培養(yǎng)液中,置于32℃條件下,150r/min,培養(yǎng)5d。將培養(yǎng)好的草菇菌絲在0℃低溫下分別處理0、2、4、6、8h,液氮凍存后備用。

1.2.3 實時熒光定量PCR分析

1.2.3.1 菌絲體總RNA的提取和cDNA的合成 參照Redzol試劑盒說明書提取草菇菌絲體總RNA,并用DEPC預處理的水溶解,然后進行凝膠電泳檢測。測定RNA的濃度,依據PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser說明書,去除基因組DNA,并反轉錄成cDNA。

1.2.3.2 目的片段的克隆與測序 在草菇全基因組序列信息(http://172.17.37.2)中進行Blast搜索,獲得草菇的cat1基因序列,并設計特異性引物(表1),由上海捷瑞生物工程有限公司合成。以微管蛋白(Tubulin,TUB)基因作為內參基因,采用常規(guī)PCR擴增tub和cat1基因片段,并構建用于real-time PCR實驗的標準品質粒,質粒由上海生工生物工程股份有限公司測序,具體操作參照汪虹與陳明杰(2007)的方法[12]。

表1 實時熒光定量PCR擴增引物

1.2.3.3 Real-time PCR反應 將含有內參基因和目的基因的標準品質粒依次進行10倍稀釋,得到5個梯度的標準品濃度,在StepOne Plus熒光定量PCR儀上進行擴增,構建標準曲線,并將所得數據按ΔΔCT法計算cat1基因的相對表達量[13-14]。Real-time PCR反應體系為20μL:2×SYBR?PremixExTaqTMⅡ 10μL,10μmol/L forward primer 0.4μL,10μmol/L reverse primer 0.4μL,50×Rox 0.4μL,cDNA模板2μL,ddH2O 6.8μL。反應條件為:95℃預變性20s,1個循環(huán);95℃ 5s,60℃ 15s,72℃ 15s,該過程進行40個循環(huán)。每組樣品設置3個平行樣品孔,并設置無菌雙蒸水代替模板作為陰性對照。

2 結果與分析

2.1 生物信息學分析

生物信息學分析結果表明:cat1基因的cDNA序列全長為2274bp,包含2274bp的ORF,編碼1個由757個氨基酸殘基組成的蛋白質(圖1)。預測所編碼蛋白Cat1的分子量為84.03ku,等電點為6.40,有酸性氨基酸88個,堿性氨基酸79個,理論半衰期大于20h,不穩(wěn)定指數為29.88,屬于穩(wěn)定性蛋白質。

圖1 cat1基因cDNA序列及編碼的氨基酸序列注Fig.1 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of cat1 gene注：*為終止密碼子。

經Blast同源性分析發(fā)現,該蛋白質序列與多種真菌的CAT具有很高的同源性(圖2),與灰蓋鬼傘(Coprinopsiscinerea,XP_001833673.2)、褐腐菌(Postiaplacenta,XP_002475806.1)、雙孢蘑菇(Agaricusbisporus,XP_006458554.1)、粉孢革菌(Coniophoraputeana,XP_007763262.1)、毛韌革菌(Stereumhirsutum,XP_007307584.1)的同源氨基酸序列相似性分別達到了81%、81%、80%、79%、79%,表明草菇的Cat1較為保守。

圖2 草菇Cat1與其它真菌同源氨基酸序列比對Fig.2 Sequence alignment between Cat1 from Volvariella volvacea and other homologous sequences from different fungi注:*部分表示100%同源性,︰部分表示保守區(qū),·部分表示同源性低。

在http://smart.embl-heidelberg.de/網站上,利用在線分析軟件查找草菇Cat1的功能域,發(fā)現在該蛋白質序列中主要包含一個CAT功能域,其氨基酸序列為37～427(圖3)。

圖3 草菇Cat1的功能域Fig.3 Functional domain of Cat1 from Volvariella volvacea

利用SWISS-Model預測和模擬了草菇Cat1蛋白的三級結構(圖4)。參考模板為粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)的catalase-1蛋白(PDB:1sy7.1.A),且在該區(qū)域中(N端第35～757個氨基酸)兩者的氨基酸序列相似性達到了62.17%。

圖4 SWISS-Model模擬草菇Cat1蛋白質三級結構Fig.4 Structure prediction of Cat1 from Volvariella volvacea by SWISS-Model

2.2 低溫脅迫下草菇不同菌株中cat1基因表達變化分析

圖5是草菇cat1基因擴增后的溶解曲線,在85℃左右時出現單一峰,表明cat1基因擴增具有特異性,其相對定量的結果可信。低溫脅迫下草菇V23、VH3的cat1基因和tub基因經real-time PCR后得到CT值,并采用ΔΔCT法計算cat1基因的相對表達量(表2)。受低溫脅迫后,V23和VH3菌絲中的cat1基因相對表達量均整體呈下降趨勢(圖6)。在低溫處理2h時,兩菌株的cat1基因相對表達量差異最大,低溫敏感型菌株V23的表達量下降至0h的0.18倍,耐低溫型菌株VH3的表達量下降至0h的0.84倍;在低溫處理過程中,VH3菌株在4h時的cat1基因相對表達量最低,僅為0h的0.41倍,V23菌株的cat1基因在2h時達到最低值,隨后其表達量雖然略有回升,但一直維持在較低的水平上。在整個低溫脅迫期間,耐低溫型菌株VH3的cat1基因相對表達量始終高于低溫敏感型菌株V23。

圖5 cat1基因擴增熔解曲線Fig.5 Melt curve of cat1 gene

圖6 低溫脅迫下V23和VH3中cat1基因的相對表達量變化Fig.6 Relative expression of cat1 gene in V23 and VH3 under low temperature stress

3 結論與討論

與其它活性氧種類相比,雖然H2O2毒性相對較小,但高濃度的H2O2則會引起過氧化脅迫,造成細胞程序性死亡[15]。與此同時,H2O2還能擴散到細胞其它部位,并且在金屬離子的作用下,通過Fenton反應產生毒性更強的羥基自由基[16],羥基自由基幾乎能夠與包括DNA、蛋白質、脂質在內的所有生物大分子發(fā)生反應,給細胞帶來損傷[7]。CAT作為直接催化H2O2分解的抗氧化酶,具有維持H2O2平衡,保證細胞正常生命活動的重要作用[17-18]。本研究首先對草菇cat1基因編碼的蛋白質序列進行了生物信息學分析,發(fā)現在Cat1蛋白序列中含有一個catalase功能域,表明草菇Cat1具有催化H2O2分解的功能。對Cat1及其同源序列的多序列比對結果顯示,草菇與灰蓋鬼傘、褐腐菌、雙孢蘑菇、粉孢革菌、毛韌革菌等同源性都很高(79%～81%),表明草菇的Cat1在進化過程中具有較高的保守性。隨后選用低溫敏感型菌株V23和耐低溫型菌株VH3作為實驗材料,其中V23是草菇生產上的主栽菌株,而VH3則是通過對V23的原生質體進行復合誘變得到的相對耐低溫菌株[19],并利用real-time PCR技術研究了低溫脅迫對草菇兩菌株的cat1基因表達影響。實驗結果顯示,在整個低溫處理期間,V23和VH3的cat1基因相對表達量總體呈下降趨勢;在相同低溫處理時間下,VH3的cat1基因下降幅度要比V23小,這可能是VH3更耐低溫的原因之一。王松華等[20]的研究表明,草菇菌絲在低溫處理2～8h時,CAT的活性隨低溫處理時間的延長而逐漸降低,這與本研究的cat1基因表達量變化趨勢相似,說明低溫脅迫可能通過影響cat1基因的轉錄表達進而影響酶活,最終使得低溫下草菇的部分防御功能被破壞而引發(fā)自溶。通

表2 低溫脅迫下草菇V23和VH3菌絲中的cat1基因相對表達量

過對草菇cat1基因的序列分析及其低溫下表達量變化的研究,將有助于深入了解草菇的低溫應答機制,為后續(xù)篩選耐低溫新菌株服務,從而更好地延長草菇的低溫保鮮期。與此同時,由于本文只研究了cat1基因受低溫脅迫的表達變化,而CAT僅是生物防御系統(tǒng)中的關鍵酶之一,因而后續(xù)需要對生物防御系統(tǒng)的其它關鍵酶進行研究,才能進一步了解草菇低溫自溶的相關機制,為延長草菇低溫保鮮時間提供理論依據。

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Sequence analysis ofcat1 and its relative expression inVolvariellavolvaceaunder low temperature stress

ZHAO Yan1,LIN Feng1,2,+,JIANG Wei1,YAN Su-ya1,CHEN Ming-jie1,2,*

(1.Institute of Edible Fungi,Shanghai Academy of Agricultural Sciences,Shanghai Key Laboratory of Agricultural Genetics and Breeding,Key Laboratory of Edible Fungi Resources and Utilization(South),Ministry of Agriculture,P. R. China,National Engineering Research Center of Edible Fungi,Shanghai 201403,China;2. College of Food Science & Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

In order to screen the relative expression ofcat1 gene during low temperature stress inVolvariellavolvaceafor getting a better understanding of its autolysis. The sequence ofcat1 gene and its relative expression in mycelia of twoVolvariellavolvaceastrains differing in cold tolerance,V23(cold-sensitive)and VH3(cold-tolerant),being exposed to low temperature stress were analyzed. Results showed thatcat1 gene included 2274bp open reading frame and consisted of 757 amino acid residues. Sequence alignment analysis indicated that Cat1 fromVolvariellavolvaceawas similar with the homologous sequence fromCoprinopsiscinerea,Postiaplacenta,Agaricusbisporus,ConiophoraputeanaorStereumhirsutum. Cat1 fromVolvariellavolvaceawas conservative with a catalase functional domain. The real time-PCR analysis showed that the relative expression ofcat1 gene decreased both in V23 and VH3 during low temperature process. However,the relative expression ofcat1 gene in VH3 was higher than that in V23 under the same low temperature treatment. All these results indicated that the less decline ofcat1 gene may be associated with the better adaptation of VH3 to low temperature stress,which would help to solve the problem of autolysis inVolvariellavolvacea.

Volvariellavolvacea;low temperature stress;cat1 gene;real-time PCR;bioinformatics

2014-06-30 +共同第一作者

趙妍(1981-),女,博士,助理研究員,研究方向:食用菌遺傳育種與生理生化。 林鋒(1989-),男,碩士研究生,研究方向:食用菌遺傳育種與功能基因。

*通訊作者:陳明杰(1965-),男,博士,研究員,研究方向:食用菌遺傳育種與生理生化。

國家自然科學基金項目(31301828)；上海市科技興農重點攻關項目應用基礎類(2014第7-1-5號)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)07-0196-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.033