HPLC法同時(shí)檢測(cè)復(fù)方產(chǎn)品中西洋參、紅景天和刺五加的皂苷含量

郭 棟,張振華,于 淼,趙升強(qiáng),王楚綺,張 娟,趙海鋒,*

(1.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東廣州 510640;2.暨南大學(xué)理工學(xué)院,廣東廣州 510632)

HPLC法同時(shí)檢測(cè)復(fù)方產(chǎn)品中西洋參、紅景天和刺五加的皂苷含量

郭 棟1,張振華2,于 淼2,趙升強(qiáng)2,王楚綺2,張 娟2,趙海鋒1,*

(1.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東廣州 510640;2.暨南大學(xué)理工學(xué)院,廣東廣州 510632)

采用高效液相色譜法建立了同時(shí)檢測(cè)復(fù)方產(chǎn)品中人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、紅景天苷、刺五加苷B和刺五加苷E含量的方法。以60%乙醇作為提取溶劑,用色譜柱Kromasil 100-5C18(250×4.6mm,5μm)進(jìn)行分離,以0.1%磷酸-乙腈混合液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫,結(jié)果表明,在此條件下5種皂苷得到了良好的分離。人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、紅景天苷、刺五加苷B和刺五加苷E分別在80～800、80～800、40～400、20～160μg/mL和40～320μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,平均加標(biāo)回收率在99.5%～106.8%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.5%～2.3%。本方法具有重現(xiàn)性好、回收率高等優(yōu)點(diǎn),適用于復(fù)方產(chǎn)品中人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、紅景天苷、刺五加苷B和刺五加苷E的同時(shí)檢測(cè)。

復(fù)方,皂苷,高效液相色譜

西洋參又名洋參、美國(guó)人參、花旗參,為五加科多年生草本植物。其味甘、微苦,性涼,具有滋陰補(bǔ)氣、清熱生津的雙重功效。研究表明其主要功能成分為人參皂苷,可有效增強(qiáng)中樞神經(jīng),保護(hù)心血管和提高人體免疫力[1]。紅景天亦為亞洲地區(qū)公認(rèn)滋補(bǔ)食材,是稀珍野生植物,其主要功效成分為紅景天苷,具有活血益氣的功效;藥理實(shí)驗(yàn)表明,紅景天苷具有抗氧化、降血糖、抗炎癥等功用[2]。刺五加又名五加參,可補(bǔ)虛扶弱、滋補(bǔ)強(qiáng)壯、延年益壽,其主要功效成分為刺五加苷[3]。目前關(guān)于檢測(cè)人參皂苷、紅景天苷、刺五加苷的方法有比色法、薄層掃描法、高效液相色譜法等[4-9],但于同一色譜條件下同時(shí)檢測(cè)多種皂苷尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。

西洋參、紅景天和刺五加作為滋補(bǔ)食材常以復(fù)方形式被提取利用,因此開(kāi)發(fā)一種能同時(shí)檢測(cè)復(fù)方產(chǎn)品中主要皂苷含量的方法尤為必要。本文建立了同時(shí)檢測(cè)復(fù)方(由西洋參、紅景天和刺五加構(gòu)成)提取液中主要功效成分人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、紅景天苷、刺五加苷B和刺五加苷E含量的高效液相色譜法。該方法可實(shí)現(xiàn)復(fù)方中不同皂苷成分的高效分離,具有重現(xiàn)性好、回收率高的優(yōu)點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西洋參、紅景天、刺五加 無(wú)限極(中國(guó))有限公司;人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、紅景天苷、刺五加B和E標(biāo)準(zhǔn)品 廣州市藥檢所;乙腈 色譜純;其余試劑 分析純。

SHIMADZMLC-20AT HPLC分析系統(tǒng) 日本島津儀器公司;電動(dòng)攪拌器 江蘇省金壇市神科儀器廠;Kromasil 100-5C18(250mm×4.6mm,5μm)色譜柱 安捷倫公司。

表1 五種皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及線性范圍

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品溶液的準(zhǔn)備 單方樣品制備:分別準(zhǔn)確稱取經(jīng)粉碎、過(guò)4號(hào)篩的西洋參、紅景天和刺五加各5.00g,用200mL 80%乙醇索氏抽提12h,抽濾后定容到250mL。

復(fù)方樣品制備:西洋參5.00g,紅景天5.00g,刺五加5.00g,采用80%乙醇(料液比1∶12)在90℃條件下用電動(dòng)攪拌器攪拌(200r/min)提取3h。

1.2.2 色譜條件 采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的混合物經(jīng)過(guò)6次實(shí)驗(yàn),確定色譜條件如下:

色譜柱:Kromasil 100-5 C18(250mm×4.6mm,5μm);

流動(dòng)相:0.1%磷酸水溶液-乙腈(0～45min,乙腈15%～30%;45～65min,乙腈30～40%;65～80min,乙腈40%;80～90min,乙腈15%);

流速:0.9mL/min;柱溫:28℃;

檢測(cè)波長(zhǎng):采用DAD二極管陣列檢測(cè)器,對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描,得到人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、紅景天苷、刺五加苷B和刺五加苷E的檢測(cè)波長(zhǎng)分別為203、203、275、220、206nm[4-6]。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 西洋參皂苷:精確稱量20mg人參皂苷Rb1和人參皂苷Re,用80%乙醇溶解,定容到25mL,得800μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品母液;分別移取1、2、4、8、10mL母液,用80%乙醇定容到10mL,得濃度為80、160、320、640、800μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,采用HPLC測(cè)定,進(jìn)樣10μL。以濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

紅景天苷、刺五加苷B和刺五加苷E:分別精確稱量20mg紅景天苷、刺五加苷B和刺五加苷E,用80%乙醇溶解,定容到50mL,得400μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品母液;分別移取1、2、4、8、10mL母液,用80%乙醇定容到10mL,得濃度為40、80、160、320、400μg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,采用HPLC測(cè)定,進(jìn)樣10μL。以濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 精密度實(shí)驗(yàn) 分別取人參皂苷Rb1和人參皂苷Re、紅景天苷,刺五加苷B和刺五加苷E的標(biāo)準(zhǔn)品母液,連續(xù)進(jìn)樣5次,每次進(jìn)樣量為10μL,計(jì)算RSD值[7]。

1.2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 分別取1.2.1復(fù)方提取樣品溶液10μL,每隔2h進(jìn)樣一次,每次進(jìn)樣量為10μL,連續(xù)進(jìn)樣6次,測(cè)定供試品溶液在12h內(nèi)的穩(wěn)定性[8]。

1.2.6 回收率實(shí)驗(yàn) 根據(jù)復(fù)方樣品配比分別取西洋參、紅景天和刺五加5.00g,加入人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、紅景天苷、刺五加B和刺五加E標(biāo)準(zhǔn)品,按照實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行樣品處理,然后根據(jù)所建立的色譜方法在不同檢測(cè)波長(zhǎng)下測(cè)定,計(jì)算回收率。

1.2.7 復(fù)方樣品中皂苷的檢測(cè) 取復(fù)方樣品液,按1.2.2所述的色譜條件測(cè)定皂苷,觀察其分離效果,并在不同波長(zhǎng)下測(cè)定其含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。數(shù)據(jù)處理和分析采用Origin8.0和SPSS19.0軟件分析。

表2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、紅景天苷、刺五加苷B和刺五加苷E的回收率

2 結(jié)果與討論

2.1 線性關(guān)系

采用Kromasil 100-5C18(250×4.6mm,5μm)色譜柱、0.1%磷酸水溶液-乙腈作流動(dòng)相,分別在203、203、275、220和206nm下測(cè)定人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、紅景天苷、刺五加苷B和刺五加苷E,得到回歸方程如表1所示。由表1可知,五種皂苷在所測(cè)范圍內(nèi),線性關(guān)系良好。

2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、紅景天苷、刺五加苷B和刺五加苷E的RSD分別為:0.33%、0.42%、0.33%、0.44%和0.88%,精密度良好,結(jié)果如表2所示。

2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

五種皂苷穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果如表3所示。由表3可知,該方法的穩(wěn)定性良好,RSD為0.14%～3.72%。

2.4 回收率實(shí)驗(yàn)

表4的結(jié)果表明,本文所建立的檢測(cè)方法對(duì)五種皂苷的回收率在99.5%～106.8%之間,RSD為0.5%～2.3%,回收率較高,準(zhǔn)確性好[9]。

2.5 樣品檢測(cè)

采用HPLC檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)樣品,確定了人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、紅景天苷,刺五加苷B和刺五加苷E的保留時(shí)間分別為58.9、36.8、5.57、5.93和13.9min。圖1的結(jié)果表明,西洋參、紅景天和刺五加提取物中的皂苷在HPLC上分離效果良好,雜峰較少。

圖1 四種檢測(cè)波長(zhǎng)下單方樣品中各皂苷含量Fig.1 Saponins contents of single samples under four detection wavelengths注:人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、紅景天苷、刺五加苷B和刺五加苷E的檢測(cè)波長(zhǎng)分別為03、203、275、220、206nm,圖2同。

采用HPLC檢測(cè)復(fù)方中的皂苷時(shí),雜峰增多,但它們并未干擾皂苷的檢測(cè),結(jié)果如圖2所示。根據(jù)表1中各皂苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算得到復(fù)方中人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、紅景天苷、刺五加苷B和刺五加苷E的含量分別為:2.5%、1.6%、0.85%、1.0%和0.89%。

圖2 四種檢測(cè)波長(zhǎng)下復(fù)方樣品中各皂苷含量Fig.2 Saponins contents of mixture samples under four detection wavelengths

3 結(jié)論

本文采用Kromasil 100-5C18(250mm×4.6mm,5μm)色譜柱、0.1%磷酸水溶液-乙腈作為流動(dòng)相,運(yùn)用梯度洗脫的高效液相色譜法可以同時(shí)檢測(cè)復(fù)方產(chǎn)品(西洋參、紅景天和刺五加)中人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、紅景天苷、刺五加苷B和刺五加苷E的含量,供試復(fù)方中五種皂苷的含量分別為:2.5%、1.6%、0.85%、1.0%、0.89%。該方法回收率高,重現(xiàn)性好,可以準(zhǔn)確測(cè)定復(fù)方產(chǎn)品中皂苷的種類和含量,為復(fù)方產(chǎn)品的質(zhì)量控制奠定了基礎(chǔ)。

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Simultaneous determination of saponins in the mixture extracts ofPanaxquinquefolius,RhodiolaroseaandEleutherococcussenticosusby HPLC

GUO Dong1,ZHANG Zhen-hua2,YU Miao2,ZHAO Sheng-qiang2,WANG Chu-qi2,ZHANG Juan2,ZHAO Hai-feng1,*

(1.College of Light Industry and Food Sciences,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China;2.College of Science and Engineering,Jinan University,Guangzhou 510632,China)

HPLC has been applied to determine the contents of ginsenoside Rb1,ginsenoside Re,salidroside,acanthopanax B and acanthopanax E in the mixture extracts ofPanaxquinquefolius,Rhodiolarosea,andEleutherococcussenticosus.The samples extracted with 60% alcohol were separated on a Kromasil 100-5 C18column(250×4.6mm,5μm),and were eluted with 0.1% phosphoric acid-acetonitrile at a flow rate of 0.9mL/min under gradient elution conditions. The results showed that all of the saponins in the mixture extracts were well separated on HPLC. The linear ranges of the ginsenoside Rb1 and ginsenoside Re,salidroside,acanthopanax B and acanthopanax E were 80～800,80～800,40～400,20～160μg/mL and 40～320μg/mL,respectively. Their average recovery rates were 99.5%～106.8%,with the relative standard deviations of 0.5%～2.3%. In conclusion,the proposed method had a good linearity and sensitivity which was suitable to detect simultaneously the contents of the ginsenoside Rb1,ginsenoside Re,salidroside,acanthopanax B and acanthopanax E in the mixture extracts or formulations.

mixture extracts;saponins;HPLC

2014-06-11

郭棟(1985-)，男，碩士研究生，研究方向：功能食品開(kāi)發(fā)。

*通訊作者:趙海鋒(1977-)，男，博士，副研究員，主要從事食品生物技術(shù)方面研究。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31000810)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2011A020102001)。

TS207.3

A

1002-0306(2015)07-0272-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.049