小球藻保健飲料的研制

龐庭才,胡上英,熊 拯,鄧冬玲,李麗燕

(1.廣西北部灣海洋生物多樣性養(yǎng)護重點實驗室，廣西欽州 535099;2.北部灣海洋生物資源開發(fā)與保護重點實驗室，廣西欽州 535099；3.欽州學(xué)院,廣西欽州 535099)

小球藻保健飲料的研制

龐庭才1,2,3,胡上英3,熊 拯3,鄧冬玲1,2,3,李麗燕3

(1.廣西北部灣海洋生物多樣性養(yǎng)護重點實驗室，廣西欽州 535099;2.北部灣海洋生物資源開發(fā)與保護重點實驗室，廣西欽州 535099；3.欽州學(xué)院,廣西欽州 535099)

以小球藻粉為原料,采用超聲波輔助提取藻多糖,再利用木瓜蛋白酶與中性蛋白酶進行水解藻蛋白,合并濾液后,按一定比例添加適量蜂蜜、白糖、檸檬酸直接配制澄清型小球藻保健飲料。通過正交實驗確定提取藻多糖的最佳工藝為:料液比1∶15(g∶mL),pH7,溫度60℃,時間30min,小球藻多糖提取得率為18.94mg/g。水解藻蛋白的最佳工藝為:底物濃度100g/L,混合酶量12000U/g,pH6.5,溫度55℃,小球藻蛋白水解度達27.83%。研制成的產(chǎn)品營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨特,是一款老少皆宜的營養(yǎng)保健飲品。

小球藻,多糖,蛋白質(zhì),飲料

小球藻(Chlorellasp.)屬于單細胞綠藻[1],分布廣泛,生物量大,富含蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)等人體不可缺少的營養(yǎng)素,特別是糖蛋白、多糖以及核酸等物質(zhì),具有激活淋巴細胞、增強免疫力、抵抗外來疾病的入侵、促進人體受傷組織修復(fù)等功效[2-5]。小球藻是全世界微藻產(chǎn)業(yè)中產(chǎn)量最多的品種,全世界年產(chǎn)量2000噸,主要生產(chǎn)地為東南亞地區(qū)[6]。目前,在食品領(lǐng)域?qū)π∏蛟宓募庸?主要是將其經(jīng)過熱處理和破壁處理直接制成小球藻片、顆粒劑或膠囊[7]。而小球藻粉本身存在著特殊的藻腥味,因此制成其他食品如:面包、面條、餅干等時,雖然營養(yǎng)豐富,往往由于品相和濃郁的腥味不被大眾消費者所接受[8]。本文采用超聲波輔助提取小球藻多糖,再選用雙酶法水解小球藻蛋白,合并濾液后進行調(diào)配,從而研制出氣味清新、口感獨特、營養(yǎng)豐富且具有一定保健功效的小球藻飲料。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

小球藻粉 青島恒達精益貿(mào)易有限公司;木瓜蛋白酶 白色,粉狀,6萬U/g,南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司;中性蛋白酶 白色,粉狀,5萬U/g,南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司;白糖 湛江市金豐糖業(yè)有限公司;食品級檸檬酸 濰坊英軒實業(yè)有限公司。葡萄糖、苯酚、濃硫酸、無水乙醇均為分析純 廣東光華化學(xué)廠有限公司。

EL204分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;EL20酸度計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;VGT-1990QTD超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司;V-1800PC型可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇科析儀器有限公司;H-1850臺式離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

1.2 工藝流程

1.3 小球藻多糖的提取

1.3.1 小球藻多糖提取的單因素實驗 按設(shè)定的料液比加入小球藻粉和水,在設(shè)定的pH和溫度下超聲波輔助提取,經(jīng)設(shè)定時間后,5000r/min離心15min,過濾,濾液加入3倍體積85%乙醇進行沉淀,然后再過濾,將沉淀用無水乙醇洗滌2次,沉淀為藻多糖。將藻多糖溶于蒸餾水中并定容至100mL,測定多糖含量。每次處理重復(fù)測定3次,結(jié)果取平均值。單因素實驗考察料液比、提取溫度、提取時間和pH4個因素對多糖提取效果的影響:

料液比的選擇:溫度50℃、時間30min、pH7,料液比分別為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35(g∶mL)。

溫度的選擇:時間30min、pH7、料液比1∶20(g∶mL),溫度分別為40、50、60、70、80℃。

時間的選擇:溫度60℃、pH7、料液比為1∶20(g∶mL),時間分別為20、25、30、35、40min。

pH的選擇:溫度60℃、時間30min、料液比1∶20(g∶mL),pH3、5、7、9、11。

1.3.2 小球藻多糖提取正交實驗 在單因素實驗基礎(chǔ)上設(shè)計L9(34)正交實驗(見表1),以考察料液比、提取溫度、提取時間和pH 4個因素對藻多糖提取效果的影響,以確定最佳提取工藝。

表1 藻多糖提取正交水平表

1.3.3 多糖提取得率測定 以葡萄糖為標準系列采用苯酚-硫酸法[9-10]測定多糖含量,再按式(1)計算樣品中多糖含量:

多糖提取得率計算公式如下:

式(1)

式中:C-從標準曲線上查出的多糖質(zhì)量濃度,mg/g;N--樣品體積稀釋倍數(shù);V-原樣品液體積,mL;m-樣品的質(zhì)量,mg。

1.4 小球藻多肽的制備

取提多糖后的濾渣,加入100mL水,在設(shè)定的pH調(diào)節(jié)下,按設(shè)定的酶活力之比加入木瓜蛋白酶與中性蛋白酶,在設(shè)定溫度下恒溫攪拌水解3h,90℃滅酶10min,冷卻至50℃左右,于離心機中5000r/min離心15min,取上清液,即得到小球藻酶解液。

1.4.1 復(fù)合酶活力比的選取 小球藻濾渣加入純水使底物濃度為60g/L,按木瓜蛋白酶與中性蛋白酶酶活力比為1∶2、1∶1、2∶1分別加入12000 U/g的混合酶,滴加0.1mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.5,置于50℃恒溫水浴中水解3h,反應(yīng)過程中不斷加NaOH溶液使pH恒定。以水解度(DH)為指標,確定最佳復(fù)合酶活力比。

1.4.2 小球藻多肽制備的單因素實驗 小球藻多肽制備的單因素實驗,以水解度(DH)為指標,考察底物濃度、加酶量、pH和溫度4個因素對多肽制備效果的影響:

底物濃度的確定:酶活力比為2∶1,加酶量12600U/g,溫度50℃,pH7.5,底物濃度分別為60、80、100、120、140g/L。

加酶量的確定:酶活力比為2∶1,底物濃度為80g/L,溫度50℃,pH7.5,加酶量分別為12000、12600、13200、13800、14400U/g。

pH的確定:酶活力比為2∶1,加酶量12600U/g,底物濃度為80g/L,溫度50℃,pH分別為6.5,7.0,7.5,8.0,8.5。

溫度的確定:酶活力比為2∶1,加酶量12600U/g,底物濃度為80g/L,pH7.5,溫度分別40、45、50、55、60℃。

1.4.3 雙酶法水解正交實驗 在單因素實驗基礎(chǔ)上設(shè)計L16(45)正交實驗(見表2),考察以溫度、底物濃度、酶用量、pH 4個因素對小球藻蛋白水解效果的影響,以確定最佳的酶解工藝。

表2 酶解正交水平表

1.4.4 水解度(DH)測定 以NaOH溶液的消耗量為指標,采用pH-stat法檢測小球藻蛋白的水解度[11],用下列公式(2)計算出蛋白質(zhì)的水解度。

DH(%)=VNaOH×CNaOH/(α×Mp×htot)×100

式(2)

式中:VNaOH-NaOH消耗量,mL;CNaOH-NaOH摩爾濃度,mol/L;α-大豆分離蛋白氨基的平均解離度,α=10pH-pK/(1+10pH-pk),pK可取7;Mp-蛋白質(zhì)總量,g;htot-每克蛋白質(zhì)中肽鍵的克當(dāng)量數(shù),取8. 38。

1.5 混合

取上述處理得到的多糖提取液和酶解液混合,攪拌均勻，冷藏備用。

1.6 灌裝與殺菌

利用灌裝設(shè)備將調(diào)配好的小球藻混合液裝瓶(100mL/瓶),置于90℃滅菌15min,冷卻即可。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖提取實驗結(jié)果與分析

以空白為參比,在波長490nm處測定標準液的吸光度A,以吸光度A為縱坐標,以葡萄糖標準液濃度C為橫坐標,繪制標準曲線。該標準曲線方程:Y=5.6757X+0.0067,R2=0.9999。表明葡萄糖的質(zhì)量濃度在0.02～0.14mg/mL內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.1.1 藻多糖提取單因素實驗結(jié)果 料液比的選擇:由圖1可知,在料液比1∶20(g∶mL)時藻多糖的提取得率最高,說明水溶性藻多糖基本全部溶出。料液比高于1∶20(g∶mL)時,藻多糖提取得率都有所降低,這可能是因為小球藻多糖幾乎被全部溶出后,過多加水增大了其他雜質(zhì)的大量溶出,還會使?jié)饪s過程中多糖損失增大,從而導(dǎo)致小球藻多糖提取得率有所降低。因此最佳料液比選擇1∶20(g∶mL)。

圖1 料液比對藻多糖提取得率的影響Fig.1 The influence of solid-liquid ratio on the algae polysaccharide extraction rate

提取溫度的選擇:由圖2可知,提取溫度為60℃時,藻多糖提取得率達到最大。溫度低于60℃時,溫度的逐漸升高加速了藻多糖的溶出,而當(dāng)超過60℃時,由于溫度過高容易導(dǎo)致小球藻內(nèi)多糖分子結(jié)構(gòu)被破壞而分解,提取得率也隨之下降,因此最佳提取溫度選擇60℃。

圖2 溫度對藻多糖提取得率的影響Fig.2 The influence of temperature on the algae polysaccharide extraction rate

提取時間的選擇:由圖3可知,當(dāng)超聲處理30min 時,藻多糖提取得率達到最大值,而后隨超聲時間延長,提取量有所下降。這是由于超聲波處理能夠促使細胞組織破裂,加速溶劑與胞內(nèi)物質(zhì)的相互溶解滲透,但當(dāng)超聲時間超過30min后,由于超聲時間過長導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)被破壞,導(dǎo)致提取得率有所下降。因此最佳的提取時間選擇30min。

圖3 時間對藻多糖提取得率的影響Fig.3 The influence of time on the algae polysaccharide extraction rate

pH的選擇:由圖4可知,pH7時藻多糖提取得率達到最大。pH<7時,提取量隨pH的增加而增加,提取量增加幅度較大。pH>7時,藻多糖提取得率反而有降低的趨勢。這主要是由于多糖上具有不同官能團而造成的,質(zhì)子的官能團可影響多糖在不同 pH提取溶液中的親水性,導(dǎo)致多糖所含官能團可能會有一定的差異,使得不同pH提取溶液中多糖的提取得率有所不同[12]。因此最佳的pH選擇7。

圖4 pH對藻多糖提取得率的影響Fig.4 The influence of pH on the algae polysaccharide extraction rate

2.1.2 藻多糖提取正交實驗 由表3可知,影響小球藻多糖提取的因素大小分別是溫度(B)、pH(D)、時間(C)、料液比(A),最優(yōu)提取條件為A1B2C2D2,即:料液比1∶15(g:mL),pH7,溫度60℃,時間30min,小球藻多糖提取得率為18.94mg/g,經(jīng)驗證實驗證明結(jié)果與正交實驗結(jié)果相符。

表4為以對小球藻多糖提取得率影響最小的因素(料液比)為空列,對各因素對多糖提取得率的影響進行方差分析,由表4可以看出,提取溫度(B)對小球藻多糖提取得率的影響達到了非常顯著的水平(p<0.01),是影響小球藻多糖提取得率的最主要影響因素;提取時間(C)、pH(D)對小球藻對小球藻多糖提取得率的影響不顯著(p>0.05)。此項結(jié)論也印證了表3的結(jié)果。

2.2 小球藻多肽制備實驗結(jié)果與分析

2.2.1 木瓜蛋白酶與中性蛋白酶的酶活力比 由圖5可知,木瓜蛋白酶與中性蛋白酶酶活力比為2∶1時水解度最大,因此選擇酶活力比為2∶1。

表3 藻多糖提取正交實驗結(jié)果

表4 方差分析表

注:“*” 表示顯著,“**”表示非常顯著。

圖5 酶活力比對水解度的影響Fig.5 The influence of enzymatic activity on the degree of hydrolysis

2.2.2 小球藻蛋白酶解單因素實驗結(jié)果 底物濃度的確定:由圖6可知,隨著反應(yīng)底物濃度的增加,水解度呈先上升后下降的趨勢,底物濃度小于100g/L時,適當(dāng)增加底物濃度有利于反應(yīng)向生成物方向進行。當(dāng)?shù)孜餄舛却笥?00g/L時,水解度反而下降,這是因為底物濃度較大時,在不斷受熱情況下,蛋白分子易產(chǎn)生交鏈聚合現(xiàn)象,使蛋白酶分子與底物蛋白分子之間的接觸機會減少,從而導(dǎo)致水解度下降,影響反應(yīng)速度[13]。因此,底物濃度選擇100g/L。

圖6 底物濃度對水解度的影響Fig.6 The influence of substrate concentration on the degree of hydrolysis

酶用量的確定:由圖7可知,隨著復(fù)合酶用量的增加,小球藻蛋白的水解度也有所增加,但當(dāng)復(fù)合酶量大于12600U/g后,小球藻蛋白的水解度增加變緩,在12600U/g以后增大幅度趨向平緩,這可能是由于酶與底物接觸達到飽和,過多的酶之間相互抑制的原因。所以,再繼續(xù)添加水解酶,水解度將不再增加而出現(xiàn)下降的趨勢[14]。因此,選擇加酶量12600U/g較合適。

圖7 酶用量對水解度的影響Fig.7 The influence of enzyme dosage on the degree of hydrolysis

pH的確定:由圖8可知,pH6.5時,小球藻蛋白水解度最高。這是由于酶催化反應(yīng)的能力與環(huán)境pH密切相關(guān),環(huán)境pH會影響酶分子的構(gòu)象和酶分子及底物分子的解離狀態(tài),從而影響酶的活性和酶促反應(yīng)速度,pH過高、過低均對酶促反應(yīng)不利。因此,選擇最佳pH為6.5。

圖8 pH對水解度的影響Fig.8 The influence of pH on the degree of hydrolysis

溫度的確定:由圖9可知,當(dāng)溫度低于50℃時,隨著溫度的升高,酶促反應(yīng)增強,藻蛋白水解度逐漸增大;當(dāng)溫度高于50℃時,水解度有所下降。這是因為溫度對酶促反應(yīng)的影響是雙效性,適宜的溫度能使酶催化反應(yīng)加速,溫度過高則使得酶變性而失活,導(dǎo)致水解度下降。因此,選擇最適溫度為50℃。

圖9 溫度對水解度的影響Fig.9 The influence of temperature on the degree of hydrolysis

2.2.3 正交實驗結(jié)果與驗證 由表5可知,各因素對小球藻蛋白的水解度影響程度順序為D>A>C>B,即:pH、溫度、酶用量、底物濃度。pH對小球藻蛋白水解效果有顯著影響,溫度和酶用量對水解度的影響相差不大,底物濃度影響最不明顯。小球藻蛋白最佳水解方案為 A3B2C1D4,即底物濃度100g/L,混合酶用量12000U/g,pH6.5,溫度55℃。

按最優(yōu)水解條件下進行驗證實驗,計算得小球藻蛋白水解度為27.83%,與正交實驗結(jié)果相符。

表5 酶解正交實驗結(jié)果

表6 方差分析表

注:“*” 表示顯著,“**”表示非常顯著。

表6為對各因素水解的影響進行方差分析,由上表可以看出,pH(D)對雙酶法水解小球藻蛋白的影響達到了非常顯著的水平(p<0.01),pH(D)成為本實驗的最主要影響因素;溫度(A)、酶用量(C)對雙酶法水解小球藻蛋白的影響達到顯著水平(p<0.05);底物濃度(B)對雙酶法水解小球藻蛋白的影響不顯著(p>0.05)。此項結(jié)論也印證了表5的結(jié)果。

3 結(jié)論

3.1 采用超聲波法提取小球藻多糖最優(yōu)條件為:料液比1∶15g/mL,pH7,溫度60℃,時間30min,小球藻多糖提取得率為18.94mg/g。

3.2 采用雙酶法水解小球藻蛋白的最優(yōu)條件為:底物濃度100g/L,混合酶量12000U/g,pH6.5,溫度55℃。在最優(yōu)水解條件下做驗證實驗,小球藻蛋白水解度達27.83%。

3.3 在以上最優(yōu)組合工藝條件下研制出的小球藻保健飲料成品呈現(xiàn)清亮的黃綠色,無明顯藻腥味,風(fēng)味獨特,具有良好口感。

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Study on the health drink ofChlorella

PANG Ting-cai1,2,3,HU Shang-ying3,XIONG Zheng3,DENG Dong-ling1,2,3,LI Li-yan3

(1.Guangxi Key Laboratory of Beibu Gulf Marine Biodiversity Conserration,Qinzhou 535099,China;2.Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Exploitation and Protection of Beibu Gulf Marine Biological Resources,Qinzhou 535099,China;3.Qinzhou University,Qinzhou 535099,China)

WithChlorellapowder as raw material,the algae polysaccharide was extracted by the method of ultrasonic assisted,then papain and neutral protease were used to hydrolyze alga protein. A kind of health drink was manufactured by adding right amount honey,sugar and citric acid into the filtrate. The optimal extraction condition by orthogonal test was as follows:solid-liquid ratio of 1∶15(g∶mL),pH7.0,extraction temperature of 60℃,extraction time 30min,under which condition,extraction yield ofChlorellapolysaccharide was 18.94mg/g.The optimal condition of hydrolyzing alga protein was as follows:substrate concentration of 100g/L,the amount of composite enzyme of 12000U/g,pH6.5,temperature of 55℃. Under which the degree of hydrolysis ofChlorellaprotein was up to 27.83%. The nutritional health drink was obtained with rich nutrition,unique flavor .

Chlorella;polysaccharide;protein;drinks

2014-06-11

龐庭才(1985-)，男，碩士，研究方向：海藻食品開發(fā)與研究。

廣西高校科學(xué)技術(shù)研究項目(2013YB260); 廣西高?？茖W(xué)技術(shù)研究項目(2013LX161)；廣西北部海洋生物多樣性養(yǎng)護重點實驗室、北部灣海洋生物資源開發(fā)與保護重點實驗聯(lián)合資助(2015ZC01)。

TS201.2

B

1002-0306(2015)07-0252-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.045