普魯蘭多糖發(fā)酵液中色素及蛋白的脫除

賀曉晗,王海增,郝華偉,高學(xué)理

(中國海洋大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 海洋化學(xué)工程與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東青島 266100)

普魯蘭多糖發(fā)酵液中色素及蛋白的脫除

賀曉晗,王海增*,郝華偉,高學(xué)理

(中國海洋大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 海洋化學(xué)工程與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東青島 266100)

為解決普魯蘭多糖發(fā)酵液色素和蛋白脫除過程中多糖易降解、有機(jī)試劑用量大、重復(fù)次數(shù)多等問題,本論文采用D4020樹脂、硅藻土、凹凸棒土等三種吸附劑,同時(shí)脫除發(fā)酵液中的色素和蛋白。通過考察時(shí)間、溫度、pH、用量等因素對(duì)色素脫除率、蛋白脫除率和多糖保留率的影響,比較三種吸附劑的吸附條件和吸附效果,得出三種吸附劑對(duì)色素和蛋白均有較好的去除效果,其中硅藻土的去除效果最好。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上對(duì)硅藻土進(jìn)行了正交實(shí)驗(yàn),得到硅藻土的最優(yōu)吸附條件為:時(shí)間60min,溫度35℃,發(fā)酵液pH3.2,吸附劑用量1.6%,在該條件下脫色率為80.17%,脫蛋白率為76.28%,多糖保留率為89.82%。

吸附,脫色,脫蛋白,普魯蘭多糖,發(fā)酵液

普魯蘭多糖是一種細(xì)胞外水溶性大分子中性多糖,具有極佳的成膜性、成纖維性、阻氧性及易自然降解等獨(dú)特的理化和生物學(xué)特性,對(duì)人體無副作用,是一種極具開發(fā)價(jià)值和應(yīng)用前景的新型生物制品[1]。普魯蘭多糖通過微生物發(fā)酵法獲得,發(fā)酵液中含有色素和蛋白,去除這些雜質(zhì)是多糖純化過程中的重要步驟。目前,發(fā)酵液脫色和脫蛋白分兩步單獨(dú)進(jìn)行,脫色法主要有吸附法[2]、雙氧水氧化法[3]等,脫蛋白法主要有有機(jī)試劑法[4]、酶法[5]等。雙氧水法通過氧化實(shí)現(xiàn)脫色,易造成多糖降解[6];有機(jī)試劑法存在試劑用量大、重復(fù)次數(shù)多等問題[7];酶法滅活溫度高,易破壞多糖結(jié)構(gòu),且成本較高[8]。與之相比,吸附法具有脫除效果好、操作簡(jiǎn)單、處理量大、不易破壞多糖結(jié)構(gòu)等優(yōu)點(diǎn),常用于普魯蘭多糖發(fā)酵液的脫色過程[9-10],但吸附脫除該發(fā)酵液中蛋白的研究鮮有報(bào)道[10]。大孔樹脂具有吸附容量大、脫色范圍廣、可重復(fù)利用等特點(diǎn),廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的提取、分離純化過程[11];硅藻土具有比表面積大、吸附能力強(qiáng)、化學(xué)穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn),常用作助濾劑[12];凹凸棒土作為性能優(yōu)良的吸附劑,已在化工、環(huán)保、催化劑等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[13],尚未應(yīng)用于發(fā)酵液處理。

本實(shí)驗(yàn)采用D4020樹脂、硅藻土和凹凸棒土等三種吸附劑,同時(shí)去除普魯蘭多糖發(fā)酵液中的色素和蛋白。探究了時(shí)間、溫度、pH和用量等因素對(duì)色素和蛋白質(zhì)吸附效果的影響,篩選出同時(shí)去除色素和蛋白效果最佳的吸附劑,為普魯蘭多糖的理論研究及工業(yè)化提取提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種 普魯蘭多糖高產(chǎn)菌株Y68,中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院池振明教授提供;D4020樹脂 天津南開和成科技有限公司;硅藻土 吉林省長白縣青山源硅藻土有限公司;凹凸棒土 江蘇玖川納米材料科技有限公司;其他化學(xué)試劑 均為分析純;

紫外可見分光光度計(jì)(UV-2450) 島津公司;臺(tái)式高速離心機(jī)(Neofuge15) 力康生物醫(yī)療科技控股有限公司;水浴恒溫振蕩器(SHZ-82) 江蘇金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠;循環(huán)水式多用真空泵(SHB-Ⅲ) 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;分析天平(FA2004N) 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵液的制備 挑取普魯蘭多糖高產(chǎn)菌株Y68 1～2環(huán)接入培養(yǎng)基中,活化24h,以10%接菌量接入裝有30L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中,28℃培養(yǎng)4d,得到普魯蘭多糖發(fā)酵液。將發(fā)酵液在80℃下加熱60min進(jìn)行預(yù)處理,殺死菌體并鈍化發(fā)酵液中的普魯蘭酶,減少其對(duì)普魯蘭多糖的分解。滅酶的發(fā)酵液冷卻至室溫,冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 吸附劑預(yù)處理 硅藻土、凹凸棒土預(yù)處理:分別將硅藻土和凹凸棒土放入烘箱內(nèi),在120℃下烘干4h,冷卻后置于干燥器中保存。

樹脂預(yù)處理:將樹脂用95%乙醇浸泡24h,充分溶脹后用蒸餾水洗至無醇味,再次用95%乙醇浸泡3～5h,洗至無醇味后用5%HCl溶液浸泡5h,洗至中性,最后用蒸餾水浸泡保存。實(shí)驗(yàn)前將浸泡在水中的樹脂于60℃下烘干[14]。

1.2.3 吸附劑脫色脫蛋白實(shí)驗(yàn) 為了解D4020樹脂、硅藻土和凹凸棒土的吸附性質(zhì),挑選出最適合普魯蘭多糖發(fā)酵液脫色、脫蛋白的吸附劑及其吸附條件,分別對(duì)三種吸附劑的吸附時(shí)間、溫度、發(fā)酵液pH以及吸附劑用量進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

1.2.3.1 吸附時(shí)間對(duì)脫色和脫蛋白效果的影響 分別取用量(w/v)為2.4%的D4020樹脂、硅藻土和凹凸棒土于25mL發(fā)酵液中,室溫下,設(shè)定吸附時(shí)間為10、20、30、40、60、80、100、140、180和240min,吸附完成后,離心(5000r/min,10min)、抽濾得上清液,按1.2.5所示方法分別測(cè)得色素脫除率、蛋白脫除率和多糖保留率。

1.2.3.2 吸附溫度對(duì)脫色和脫蛋白效果的影響 分別取用量為2.4%的D4020樹脂、硅藻土和凹凸棒土于25mL發(fā)酵液中,三種吸附劑對(duì)應(yīng)的振蕩時(shí)間分別為80、40、100min,設(shè)定溫度為15、25、35、45、55和65℃,按上述方法測(cè)得色素脫除率、蛋白脫除率和多糖保留率。

1.2.3.3 pH對(duì)脫色和脫蛋白效果的影響 分別取用量為2.4%的D4020樹脂、硅藻土和凹凸棒土于25mL發(fā)酵液中,三種吸附劑對(duì)應(yīng)的振蕩時(shí)間分別為80、40、100min,對(duì)應(yīng)的溫度分別為25、25、35℃,設(shè)定發(fā)酵液pH為2、3、4、5、6、7、8、9和10,按上述方法測(cè)得色素脫除率、蛋白脫除率和多糖保留率。

1.2.3.4 用量對(duì)脫色和脫蛋白效果的影響 分別取D4020樹脂、硅藻土和凹凸棒土于25mL、pH為3.2的發(fā)酵液中,三種吸附劑對(duì)應(yīng)的振蕩時(shí)間分別為80、40、100min,對(duì)應(yīng)的溫度分別為25、25、35℃,設(shè)定吸附劑用量(w/v)為0.2%、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%和2.4%,按上述方法測(cè)得色素脫除率、蛋白脫除率和多糖保留率。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 綜合考慮單因素實(shí)驗(yàn)中D4020樹脂、硅藻土和凹凸棒土對(duì)多糖溶液色素、蛋白的脫除效果,選取硅藻土進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)?？紤]到發(fā)酵液原始pH為3.2,且在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液的顏色隨pH的增加而加深,故確定正交實(shí)驗(yàn)發(fā)酵液pH為3.2,選取吸附時(shí)間、溫度和吸附劑用量3個(gè)因素,各取3個(gè)水平,以脫色率、脫蛋白率和多糖保留率為指標(biāo),設(shè)計(jì)L9(34)正交實(shí)驗(yàn)表。實(shí)驗(yàn)因素水平見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.2.5 分析方法

1.2.5.1 脫色率的測(cè)定 發(fā)酵液中色素含量的相對(duì)值以721分光光度計(jì)在320nm處的吸光度值來表示。脫色率采用如下公式來進(jìn)行計(jì)算:

脫色率(%)=(A0-Ae)/A0×100

其中,A0、Ae分別代表發(fā)酵液經(jīng)吸附劑處理前后在320nm下的吸光值[15]。

1.2.5.2 蛋白含量的測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定蛋白質(zhì)含量,蛋白脫除率采用如下公式來進(jìn)行計(jì)算:

蛋白脫除率(%)=(C0-Ce)/C0×100

其中,C0、Ce分別代表普魯蘭多糖發(fā)酵液經(jīng)吸附劑處理前后所含蛋白質(zhì)含量[16]。

1.2.5.3 多糖含量的測(cè)定 用95%的冰凍乙醇沉淀多糖,將混合物于4℃下放置數(shù)小時(shí),離心棄上清液,將獲得的多糖在60℃烘干至恒重,稱重,既得多糖含量。多糖保留率采用以下公式來進(jìn)行計(jì)算:

多糖回收率(%)=Me/M0×100

其中,M0、Me分別代表普魯蘭多糖發(fā)酵液經(jīng)吸附劑處理前后多糖的含量[15]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel統(tǒng)計(jì)函數(shù)STDEV計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差,數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示;采用FDIST函數(shù)計(jì)算p值,p值小于0.05被認(rèn)為差異顯著,p值小于0.01被認(rèn)為差異極顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 吸附時(shí)間對(duì)脫色和脫蛋白效果的影響

室溫下,在經(jīng)過相同預(yù)處理的發(fā)酵液中分別加入等量的D4020樹脂、硅藻土和凹凸棒土,比較吸附時(shí)間對(duì)吸附效果的影響,如圖1和圖2所示。由圖可知,三種吸附劑對(duì)色素、蛋白、多糖的吸附規(guī)律相近,開始時(shí)吸附較快,隨著吸附時(shí)間的延長,吸附量逐漸增大,但增加速率減緩。這可能是由于開始時(shí)吸附質(zhì)分子的擴(kuò)散率較快所以吸附率增加較快,隨著吸附時(shí)間的延長接觸越來越充分,吸附劑表面及孔道內(nèi)吸附質(zhì)分子增多,分子間傳質(zhì)阻力增加,分子擴(kuò)散率減小,所以吸附率增加緩慢。D4020樹脂對(duì)色素、蛋白和多糖的吸附在80min時(shí)基本達(dá)到平衡;硅藻土在40min時(shí)對(duì)三種吸附質(zhì)的吸附達(dá)到平衡;凹凸棒土的吸附較慢,100min時(shí)達(dá)到平衡。

圖1 吸附時(shí)間對(duì)脫色率和脫蛋白率的影響Fig.1 Effect of adsorption time on decolorization and deproteinization ratios

圖2 吸附時(shí)間對(duì)多糖保留率的影響Fig.2 Effect of adsorption time on polysaccharide recovery ratios

2.2 吸附溫度對(duì)脫色和脫蛋白效果的影響

吸附溫度對(duì)脫色、脫蛋白效果以及多糖保留率的影響如圖3和圖4所示。

圖3 吸附溫度對(duì)脫色率和脫蛋白率的影響Fig.3 Effect of adsorption temperature on decolorization and deproteinization ratios

由圖3知,吸附劑的吸附性能與溫度有較大關(guān)系,三種吸附劑對(duì)色素和蛋白的吸附規(guī)律均為吸附率隨溫度的升高先增大后減小。由圖4可知,溫度對(duì)三種吸附劑吸附多糖的能力影響較小。D4020樹脂和硅藻土在25℃下,凹凸棒土在35℃下達(dá)到了最佳脫色、脫蛋白效果。這是由于隨著溫度的升高,被吸附的分子熱運(yùn)動(dòng)加快,更容易達(dá)到吸附劑表面并附著于其上。與此同時(shí),傳質(zhì)速度的加快也使得已經(jīng)吸附的分子較易解吸,所以吸附率隨溫度的繼續(xù)升高而降低。綜上三種吸附劑進(jìn)行脫色脫蛋白溫度不宜過高,在以下實(shí)驗(yàn)中確定25℃為D4020樹脂和硅藻土的吸附溫度,35℃為凹凸棒土的吸附溫度。

圖4 吸附溫度對(duì)多糖保留率的影響Fig.4 Effect of adsorption temperature on polysaccharide recovery ratios

2.3 pH對(duì)脫色和脫蛋白效果的影響

pH對(duì)脫色、脫蛋白效果以及多糖保留率的影響如圖5和圖6所示。

圖5 pH對(duì)脫色率和脫蛋白率的影響Fig.5 Effect of pH value on decolorization and deproteinization ratios

pH決定著溶液中分子的帶電性質(zhì),對(duì)吸附劑的吸附性能影響較大。如圖5和圖6所示,三種吸附劑對(duì)色素、蛋白、多糖的吸附效果均在酸性條件下較好,在堿性條件下較差,但吸附率隨pH增加而變化的趨勢(shì)不盡相同。D4020樹脂在pH2條件下,同時(shí)達(dá)到了最佳脫色和脫蛋白效果,這可能是由于酸性條件下樹脂與色素、蛋白、多糖易形成氫鍵,所以較易吸附,而在高pH條件下氫鍵容易破壞,所以吸附量減小[14]。硅藻土在pH2、pH4條件下分別獲得最佳脫色、脫蛋白效果,隨著pH的繼續(xù)升高脫色率和脫蛋白率急劇下降。堿性條件下脫色率較低,可能是由于在堿性條件下部分還原糖發(fā)生了美拉德反應(yīng),發(fā)酵液顏色加深,故脫色效果較差[17]。蛋白脫除率在酸性條件下較高的原因可能是溶液中的蛋白在酸性條件下帶正電荷,硅藻土表面帶負(fù)電性,所以在酸性條件下蛋白吸附效果好。而在pH2強(qiáng)酸性條件下,硅藻土表面羥基在水溶液中解離困難,使表面的負(fù)電性降低[18],阻礙了硅藻土與蛋白分子的有效作用,所以硅藻土在pH4條件下較pH2下蛋白脫除效果好。凹凸棒土在pH2下脫色和脫蛋白效果較高,隨pH的增加變化不大。綜上,在酸性環(huán)境下三種吸附劑對(duì)色素和蛋白的脫除效果較好,但同時(shí)多糖損失率也較大。綜合色素、蛋白脫除率和多糖保留率分析,且考慮到發(fā)酵液初始pH為3.2,確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)發(fā)酵液pH為3.2。

圖6 pH對(duì)多糖保留率的影響Fig.6 Effect of pH value on polysaccharide recovery ratios

2.4 用量對(duì)脫色和脫蛋白效果的影響

吸附劑用量對(duì)脫色、脫蛋白效果以及多糖保留率的影響如圖7和圖8所示。

圖7 吸附劑用量對(duì)脫色率和脫蛋白率的影響Fig.7 Effect of dosage of adsorbents on decolorization and deproteinization ratios

圖8 吸附劑用量對(duì)多糖保留率的影響Fig.8 Effect of dosage of adsorbents on polysaccharide recovery ratios

從圖可知,隨著吸附劑用量的增加,三種吸附劑對(duì)色素、蛋白和多糖的吸附量均明顯增多。這是由于隨著吸附劑用量的增加吸附面積增加,吸附劑與吸附質(zhì)接觸充分,從而雜質(zhì)去除率逐漸增加而多糖保留率降低。硅藻土、D4020樹脂、凹凸棒土的用量分別達(dá)到1.6%、1.2%和2.0%時(shí),脫色和脫蛋白基本達(dá)到平衡,而多糖保留率隨用量的增加繼續(xù)降低。達(dá)到平衡時(shí)硅藻土的雜質(zhì)去除率較高,而凹凸棒土的多糖保留率較高。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

2.5 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取硅藻土進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn),確定普魯蘭多糖發(fā)酵液脫色、脫蛋白的最佳工藝條件,結(jié)果見表2。

表2表明,以脫色率為指標(biāo)時(shí),各因素的主次順序?yàn)锳>B>C,由表3知三個(gè)因素對(duì)脫色率影響均顯著,最優(yōu)脫色條件為A3B2C3;以脫蛋白率為指標(biāo)時(shí),各因素的主次順序也為A>B>C,由表4知時(shí)間對(duì)脫蛋白率影響顯著,最優(yōu)脫蛋白條件為A3B2C3;以多糖保留率為指標(biāo)時(shí),各因素的主次順序?yàn)锳>C>B,由表5知吸附時(shí)間和吸附劑用量影響顯著,最優(yōu)條件為A1B2C1。對(duì)于因素A、C,不同指標(biāo)所對(duì)應(yīng)的最優(yōu)水平不同,但本著在保證發(fā)酵液雜質(zhì)脫除率高的前提下,盡可能得到較高多糖保留率的原則,優(yōu)先考慮脫色率、脫蛋白率指標(biāo),故選取A3、C3;因素B,對(duì)于脫色率、脫蛋白率指標(biāo)來說以B2為優(yōu),而因素B對(duì)多糖保留率影響不顯著,故選取B2。綜上分析,最優(yōu)組合條件為A3B2C3,即時(shí)間60min,溫度35℃,吸附劑用量1.6%。

表3 脫色率方差分析表

注:F0.05(2,2)=19,F0.01(2,2)=99。

表4 脫蛋白率方差分析表

表5 多糖保留率方差分析表

2.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

對(duì)最優(yōu)工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證,在A3B2C3條件下,進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn),脫色率為80.17%,脫蛋白率為76.28%,多糖保留率為89.82%。該結(jié)果在保證較高脫色率、脫蛋白率的前提下,得到了較高的多糖保留率,為普魯蘭多糖工業(yè)化生產(chǎn)提供工藝基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)采用D4020樹脂、硅藻土、凹凸棒土等三種吸附劑脫除普魯蘭多糖發(fā)酵液中的色素和蛋白,結(jié)果表明:三種吸附劑對(duì)普魯蘭多糖發(fā)酵液色素和蛋白的脫除均有明顯效果,其中硅藻土所需時(shí)間最短、用量最少,且脫除效果最好。硅藻土的最優(yōu)吸附條件為:時(shí)間60min,溫度35℃,發(fā)酵液pH3.2,吸附劑用量1.6%。在上述條件下硅藻土脫色率為80.17%,脫蛋白率為76.28%,多糖保留率為89.82%。

實(shí)際應(yīng)用中,可以選用硅藻土同時(shí)去除普魯蘭多糖發(fā)酵液中的色素和蛋白,大大降低后續(xù)純化工作的負(fù)荷。相比于硅藻土,D4020大孔樹脂在吸附完成后吸附劑較易去除,而凹凸棒土具有多糖保留率高的優(yōu)點(diǎn),因此,在選擇某種吸附劑時(shí)應(yīng)考慮所需產(chǎn)品的具體要求進(jìn)行取舍,才能達(dá)到預(yù)期的目的和效果。但無論采用哪種吸附劑,發(fā)酵液中仍含有少量色素和蛋白,可能是其與多糖牢固結(jié)合形成了復(fù)合物,如要獲得純多糖制品,還需要經(jīng)過其他一系列提純工序。

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Decolorization and deproteinization of pullulan from fermentation broth

HE Xiao-han,WANG Hai-zeng*,HAO Hua-wei,GAO Xue-li

(Key Laboratory of Marine Chemistry Theory and Technology,Ministry of Education,College of Chemistry and Chemical Engineering,Ocean University of China,Qingdao 266100,China)

There are many problems in decolorization and deproteinization of pullulan from fermentation broth,such as large toxic organic reagents usage,high repetition times and easy polysaccharide degradation etc. To solve these issues,study for the decolorization and deproteinization of pullulan was developed through static adsorption tests of D4020 macroporous resins,diatomite and attapulgite. This paper investigated how the ratios of decolorization,deproteinization and polysaccharide recovery changed along with the adjustments of adsorption time,temperature,pH and dosage. The results showed that these three kinds of adsorbents all performed well in adsorbing the impurities,and diatomite was the most suitable one. Based on the single factor experiment,diatomite was then chosen for the orthogonal experiment. The results showed that the optimal processing conditions were as follows:60min adsorption time,35℃ adsorption temperature,pH value 3.2 and 1.6% diatomite. Under such conditions,the decolorization ratio was 80.17%,the deproteinization ratio was 76.28% and the polysaccharide recovery ratio was 89.82%.

adsorption;decolorization;deproteinization;pullulan;fermentation broth

2014-07-14

賀曉晗(1990-)，女，碩士，研究方向：多糖的純化及其性質(zhì)研究。

*通訊作者:王海增(1965-)，男，博士，教授，研究方向：海水化學(xué)資源的綜合利用研究。

國家863計(jì)劃項(xiàng)目(2012AA021505)。

TS201.1

A

1002-0306(2015)07-0138-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.021