豬股骨酶解液中降血壓肽的活性及其體外穩(wěn)定性研究

舒一梅,李 誠,李凌希,潘姝璇,王詩熠,郭 威,付 剛,肖 嵐

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,四川雅安 625014)

豬股骨酶解液中降血壓肽的活性及其體外穩(wěn)定性研究

舒一梅1,李 誠*,李凌希2,潘姝璇2,王詩熠2,郭 威2,付 剛2,肖 嵐2

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,四川雅安 625014)

采用0.22、0.45μm兩種孔徑濾膜過濾豬股骨酶解液,再利用截留分子量為5、3、2ku的超濾離心管對過濾后的酶解液進行超濾,比較兩種濾膜過濾的酶解液超濾分離后的各分子量段濾液的色值、澄清度、蛋白損失率及ACE(血管緊張素轉(zhuǎn)換酶)抑制活性,并將ACE抑制活性最高的分子量段進行模擬胃腸道及耐熱、耐酸堿實驗。研究顯示:0.22μm微孔濾膜處理的酶解液超濾后的色值、澄清度效果好于0.45μm微孔濾膜,兩者超濾后各個分子量段的ACE抑制率差異不顯著,蛋白回收率前者較低,分子量<2ku的濾液活性最高,其IC50值為0.83mg/mL。分子量<2ku經(jīng)胃蛋白酶、胰蛋白酶作用后,ACE抑制活性仍然保持原來的95%以上,該分子量段的濾液有良好的胃腸道耐受性、熱穩(wěn)定性及耐酸堿性。

豬股骨酶解液,降血壓肽,超濾,穩(wěn)定性,ACE半抑制濃度

超濾技術(shù)是以超濾膜作為分離介質(zhì),以膜兩側(cè)的壓力差為推動力,將不同分子量的溶質(zhì)進行選擇性分離。超濾技術(shù)的優(yōu)點是無相際間變化、能耗低、操作簡便、占地面積小,成本低廉,尤其是超濾技術(shù)的實驗條件溫和可以防止肽變性、失活,在提純蛋白質(zhì)過程中已得到廣泛應(yīng)用[1]。據(jù)研究報道大多數(shù)降血壓肽多是由10個以下氨基酸殘基組成的小肽[2-4],因此可用超濾法除去酶解物中的大分子量多肽,富集小分子量肽段。目前,已有較多有關(guān)蛋白水解物中的降血壓肽的超濾分離的報道,如,米糠蛋白水解物[5],鱈魚蛋白水解物[6],乳清蛋白ACE活性肽[7],鴨骨蛋白水解物[8],酪蛋白水解物[9]和大蒜渣ACE活性肽[10]等。

本文不僅對豬股骨酶解液超濾濾液的感官性狀、降血壓活性進行了研究,并通過體外穩(wěn)定性實驗進一步研究了其體外穩(wěn)定性,以期為促進降血壓肽產(chǎn)品的工業(yè)化提供一定的實驗基礎(chǔ)。一般情況下,降血壓肽如果在體外對胃腸道酶有良好的耐受性、耐熱性、耐酸堿性,在體內(nèi)才可能具有明顯的生理效果,才可能經(jīng)機體吸收后在體內(nèi)產(chǎn)生真正的降血壓作用[11]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬股骨骨粉 實驗室自制;胃蛋白酶(20U/mg)、胰蛋白酶(20U/mg)、木瓜蛋白酶(800U/mg)、風味蛋白酶(20U/mg)、堿性蛋白酶(200U/mg) DSM公司;超純水 優(yōu)譜公司;ACE、HHL 美國Sigma公司;其它均為國產(chǎn)分析純試劑。

0.22、0.45μm微濾膜 上海新亞凈化器件廠;超濾管(5、3、2ku) 密理博公司;QT-2漩渦混勻器 上海琪特分析儀器有限公司;V-1100D型可見光分光光度計 上海美普達儀器有限公司;冷凍干燥機、高速冷凍離心機、移液槍 Thermo Fisher;pH計 方舟科技;氨基酸成分分析儀 日本日立公司;真空抽濾裝置 天津奧特賽恩斯儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 豬股骨降血壓肽的制備 按本研究室前期豬股骨酶解降血壓肽的優(yōu)選條件制備豬股骨降血壓肽,其工藝流程為:新鮮豬股骨→高壓蒸→粉碎→加酶水解→滅酶→離心→上清液→冷凍干燥[12]。

1.2.2 超濾分離

1.2.2.1 酶解液前處理 本實驗采用微孔過濾的方法對豬股骨酶解液進行前處理,利用真空抽濾裝置分別將酶解液用0.22、0.45μm微濾膜進行抽濾,并以色值、澄清度、蛋白回收率為指標比較兩種混合纖維素酯濾膜的過濾效果。

1.2.2.2 色值測定 以去離子水為空白對照,將濾液用分光光度計在420nm處測定吸光度值,用Abs表示,重復(fù)該實驗3次[13]。

1.2.2.3 澄清度測定 以去離子水為空白對照,將濾液用分光光度計在680nm處測定透光率,用T%表示,重復(fù)該實驗3次[14]。

1.2.2.4 超濾后蛋白回收率計算

C0:酶解液蛋白含量(mg/mL);V0:酶解液總體積(mL);C1:濾液蛋白含量(mg/mL);V1:濾液總體積(mL)

1.2.2.5 超濾 豬股骨酶解液分別經(jīng)兩種微孔濾膜過濾后,再分別透過截留分子量5、3、2ku的超濾離心管(4000r/min,10min),豬股骨酶解液0.22μm微濾后進行超濾的為A組,0.45μm微濾后超濾的為B組,得到A組酶解液分別為<5,3～5,<3,2～3,<2ku的濾液,以及B組酶解液分別為<5,3～5,<3,2～3,<2ku的濾液。

1.2.2.6 氨基酸的測定 將超濾后的A組<5,3～5,<3,2～3,<2ku濾液分別冷凍干燥后,分別稱取10mg測定其氨基酸成分,每個分子量段取三組進行平行實驗。采用酸水解法[15]對樣品進行處理,然后上機測定。

1.2.3 豬股骨降血壓肽的穩(wěn)定性實驗

1.2.3.1 豬股骨降血壓肽模擬胃腸道實驗 參照Megumi KUBA[16]、Yike Yu[17]等的方法進行測定。操作步驟:取適量1%(w/v)的最高ACE抑制活性的分子量段濾液溶于0.1mol/L HCl溶液(適宜緩沖溶液調(diào)節(jié)pH2.0)中,加入1%(w/w)胃蛋白酶,搖勻,于37℃保溫模擬消化4h,煮沸5min中止反應(yīng),立即冷卻,并用0.1mol/L的磷酸氫二鉀調(diào)pH至8.0。取水解液在5000r/min下離心20min,測定上清液的ACE抑制活性;在剩余水解液中加入1%(w/w)胰蛋白酶,于37℃保溫模擬消化2h,再置于沸水浴中5min,再取適量水解液在5000r/min下離心20min,測定上清液的ACE抑制活性。每組樣品經(jīng)酶處理后,經(jīng)離心分離,取上清液,pH調(diào)至8.0,取樣測定其IC50值,同時取超純水作為空白對照,重復(fù)該實驗3次。

1.2.3.2 豬股骨降血壓肽的熱穩(wěn)定性實驗 取超濾后的ACE抑制率最高的分子量段,調(diào)節(jié)濃度為1.0mg/mL,并用HCl(1mol/L)和NaOH(1mol/L)調(diào)節(jié)pH為7.0,分別置25、35、45、55、65、75、85、95℃的水浴中,保溫4h,然后迅速拿出,分別取樣檢測其IC50值,重復(fù)該實驗3次。

1.2.3.3 豬股骨降血壓肽的酸堿穩(wěn)定性實驗 取超濾后的ACE抑制率最高的分子量段,調(diào)節(jié)濃度為1.0mg/mL,用適宜的緩沖液分別調(diào)pH為4、5、6、7、8、9、10、11、12常溫放置4h后,分別取樣檢測其IC50值,重復(fù)該實驗3次[18]。

1.2.4 ACE抑制活性的測定 ACE抑制率的測定主要采用經(jīng)典的紫外分光光度法[19]。

1.2.5 IC50值測定方法 將樣品配制成不同的濃度,分別測定其ACE抑制率,以樣品濃度為橫坐標,ACE抑制率為縱坐標,繪制圓滑曲線,從曲線中計算出IC50值。

1.2.6 蛋白質(zhì)濃度測定 蛋白質(zhì)濃度的測定主要采用Lowry法[20]蛋白含量檢測試劑盒測定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)經(jīng)3次平行實驗后得到,通過計算其平均值與誤差,采用SPSS 20.0分析數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 微孔濾膜過濾的影響

豬股骨酶解液經(jīng)0.22、0.45μm微孔濾膜處理后,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析,其色值、澄清度、蛋白回收率如表1。由于0.22μm微濾膜膜孔較小,所得濾液色值較小,澄清度較大,但膜孔更容易發(fā)生阻塞;兩種濾液性質(zhì)差異不顯著(p>0.05):兩種濾液顏色均為亮淺黃色,澄清透明,與酶解液相比,整體得到改善。

表1 微濾處理后酶解液色值、澄清度、蛋白回收率

表2 A組酶解液超濾濾液評價

表3 B組酶解液超濾濾液評價

2.2 超濾

A組與B組的豬股骨酶解液,分別用5、3、2ku超濾離心管在4000r/min下離心10min,共收集到分子量為<5、3～5、<3、2～3、<2ku的A、B兩組濾液。A、B兩組蛋白回收率、ACE抑制活性、色值、澄清度見表2、表3。

由表2、表3可知,A、B兩組超濾濾液在色值、澄清度、蛋白回收率上差異顯著(p<0.05)。就ACE抑制活性而言,A組、B組超濾濾液差異不顯著(p>0.05),因為不同的膜過濾后進行超濾只是對于酶解液中的雜質(zhì)、蛋白分子等通過的影響,而對ACE抑制活性沒有影響。酶解液經(jīng)0.22μm微濾過濾后進行超濾,可得到感官評價較好的超濾組分,若是進行豬股骨降血壓肽產(chǎn)品的開發(fā),可選擇0.22μm微濾膜過濾酶解液,其產(chǎn)品的感官性狀較好。若是進一步分離豬股骨降血壓肽單體,由于0.45μm微濾膜過濾的效率較高,因此選擇0.45μm微濾膜過濾酶解液較好。

2.3 氨基酸成分分析

酶解液及超濾后各分子量段的氨基酸成分分析如表4。

如表4中的氨基酸組成及其含量,從原液依次到分子量為<5、3～5、<3、2～3、<2ku的濾液其中的氨基酸種類沒有發(fā)生變化。經(jīng)統(tǒng)計分析,其疏水性氨基酸、脯氨酸所占的比例依次增大,可能因為高活性的降血壓肽多由疏水性氨基酸、脯氨酸等組成,其中分子量<2ku的濾液ACE抑制活性最高,其疏水性氨基酸比例最高為49.11%,脯氨酸所占比例為13.78%,降血壓肽的ACE抑制活性很可能跟疏水性氨基酸的含量相關(guān)[21]。這也符合了Saito[22],Cheung[19]等人的研究:ACE抑制肽的抑制活性主要取決于C端氨基酸,當C端氨基酸為疏水性氨基酸和脯氨酸時其抑制活性較高。

2.4 體外穩(wěn)定性實驗

2.4.1 模擬胃腸道穩(wěn)定性實驗 降血壓肽或酶解超濾濾液經(jīng)口服是否具有降血壓作用的前提條件是不被腸道酶和肽酶降解,到達體內(nèi)目標點時抑制了這些目標點的ACE活性。

從表5可知,分子量段<2ku的濾液與胃蛋白酶作用后IC50值增大,但其ACE抑制活性仍保持原來的95%以上,經(jīng)統(tǒng)計分析,胃蛋白酶的降解作用不顯著(p>0.05)。進一步與胰蛋白酶作用后,其IC50值升高微小。這說明胃蛋白酶、胰蛋白酶對分子量<2ku濾液的降解作用不顯著(p>0.05)。

Yamamoto等[23],Doyen等[24]研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)源降血壓肽能發(fā)揮功能活性或營養(yǎng)作用,若其IC50值于12～60mg/mL范圍內(nèi),經(jīng)口服后依然有活性。由豬股骨酶解液分離的分子量<2ku的濾液經(jīng)胃腸道酶作用后,IC50值僅為0.83mg/mL,遠低于12～60mg/mL,這個范圍,這說明分子量<2ku的豬股骨降血壓肽經(jīng)口服后很可能具有良好的降血壓作用。

表4 不同分子量段濾液的氨基酸含量

表5 消化酶對豬股骨<2ku濾液的影響

2.4.2 豬股骨降血壓肽熱穩(wěn)定性 由圖1可知,分子量<2ku濾液在不同溫度下水浴6h后,其ACE抑制活性差異不顯著(p>0.05)。隨著溫度的升高,分子量<2ku濾液ACE抑制率基本不變。當溫度達到95℃時,其ACE抑制活性仍很高。由此可知,分子量<2ku濾液具有良好的耐高溫性能。

圖1 不同溫度對分子量<2ku濾液的影響Fig.1 Effect of temperature on the activity of the<2ku

2.4.3 豬股骨降血壓肽的酸堿穩(wěn)定性結(jié)果分析 從圖2可知,當pH在4～6、8～12之間時,分子量<2ku濾液的活性變化幅度很小(p>0.05),當pH為7時,其ACE抑制率最低,但仍有較高的抑制活性。由此可知,分子量<2ku濾液在酸性和堿性的條件下最穩(wěn)定,在中性條件下較穩(wěn)定。

圖2 不同pH對分子量<2ku濾液的影響Fig.2 Effect of pH value on the activity of the<2ku

3 結(jié)論

利用兩種微孔濾膜過濾酶解液,發(fā)現(xiàn)酶解液經(jīng)0.22μm微濾膜過濾后進行超濾,可得到感官評價較好的超濾組分,兩者的ACE抑制活性差異不顯著。豬股骨酶解液超濾后,蛋白回收率分布在80%～95%之間,分子量<2ku的濾液具有最好的ACE的抑制效果;通過對各個分子量段的氨基酸成分分析,隨著各個分子量段的ACE抑制活性的增大,其疏水性氨基酸和脯氨酸的比例逐漸增大,降血壓肽的活性很可能與疏水性氨基酸和脯氨酸的含量相關(guān)。分子量<2ku的濾液對胃蛋白酶、胰蛋白酶有良好的耐受性,還有良好的耐熱和耐酸堿性。

國內(nèi)外較多學(xué)者利用超濾分離蛋白水解物,獲得了高活性的目的產(chǎn)物。國外學(xué)者Alain[25]等、Antonio[26]等利用超濾分離對亞麻籽蛋白水解物、墨魚水解物分離出高活性的降血壓肽濾液。本研究中經(jīng)超濾分離出的分子量<2ku的濾液ACE抑制活性較高,較李誠[8]等對鴨骨水解物進行超濾后得到的最高活性肽段活性有了提高,為豬股骨降血壓肽的工業(yè)化生產(chǎn)提供了一定的理論基礎(chǔ)。此外,ACE的抑制作用與體外降血壓效果之間有時會出現(xiàn)不一致的情況。因此在體外進行降血壓肽抗腸道酶降解的研究是非常必要的。降血壓肽的熱穩(wěn)定性、耐酸堿性的研究,也為豬股骨降血壓肽產(chǎn)品的開發(fā)提供了理化條件的參考。然而,要得到單一的豬股骨降血壓肽成分還需結(jié)合更多分離技術(shù)進行分離,以期分離出純度更高的豬股骨降血壓肽,促進以其為功能因子的保健品的開發(fā)。

[1]Myroslav S,Iryna K,Boguslaw B.The separation ofuranium ions by natural and modified diatomite from aqueous solution[J].Journalof Hazardous Materials,2010(181):700-707.

[2]Yoshii H,Tachi N.Antihypertensive effect of ACE inhibitory oligo peptides from chinken egg yolks[J].Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol,2001,128(1):27-33.

[3]Byun HG,Kim SK.Structure and activity of angiotensin I converting enzyme inhibitory peptides derived from Alaskan Pollack skin[J].J Biochem Mol Biol,2002,35(2):239-243.

[4]L.Vandanjon,M.Grignon,E.Courois,et al.Fractionating white fish fillet hydrolysates by ultrafiltration and nanofiltration[J]. Journal of Food Engineering,2009(95):36-44.

[5]丁青芝,馬海樂,駱琳,等.米糠蛋白ACEI活性肽的超濾分離及其穩(wěn)定性研究[J].食品研究與開發(fā)雜志,2008(9):48-51.

[6]You-Jin Jeon.Improvement of functional properities of cod frame protein hydrolysates using ultrafiltration membranes[J]. Process bio-chemistry,1999,16(35):471-478.

[7]沈小琴,李朝惠,羅永康.乳清蛋白酶解ACE抑制肽分離純化技術(shù)的研究[J].中國乳品工業(yè),2005,33(11):4-6.

[8]李誠,張小麗,付剛.酶解鴨骨制取ACE抑制肽工藝條件的優(yōu)化[J].中國釀造,2011(8):64.

[9]馮彪,倪晉仁,毛學(xué)英.超濾技術(shù)處理酪蛋白酶解液的研究[J].中國乳品工業(yè),2005,33(3):32-34.

[10]徐霞.大蒜ACEI活性肽制備技術(shù)的研究[D].鎮(zhèn)江:江蘇大學(xué),2004:38-12.

[11]方科偉,孫海燕,劉冬,等.基因工程法高效表達降血壓肽的穩(wěn)定性及降壓效果[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2008,27(12):16-20.

[12]劉小紅,李誠,付剛,等.豬股骨頭膠原蛋白降血壓肽的分離純化[J].食品科學(xué)，2014，35(6)：50-54.

[13]陳瑜,李志遠,侯小禎.膜分離技術(shù)在菠蘿汁澄清中的應(yīng)用研究[J].食品工業(yè)科技,2005,26(9):63-66.

[14]Jaeger L M,Bento C A. Clarification of pineapple juice by ultrafiltration and microfiltration:physicochemical evaluation of clarified juices,soft drink formulation,and sensorial evaluation

[J]. Journal of agricultural and food chemistry,1998(6):2185-2189.

[15]GB/T5009.124-2003 食品中氨基酸的測定[G].

[16]KUBA M,TANAKA K,TAWATA S,et al.Angiotensin Ⅰ-Converting Enzyme Inhibitory Peptides Isolated from Tofuyo Fermented Soybean Food[J].Biosci Biotechnol Biochem,2003,67(6):1278-1283.

[17]Yu Y,Jianen Hu.Yuji Miyaguchi,et al.Isolation and characterization of angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides derived from porcine hemoglobin[J].Peptides,2006,27(22):2950-2956.

[18]鄧慧玲,劉嘉,陳光鏡，等.豬血紅蛋白ACE抑制肽的分離和理化性質(zhì)研究[J].食品工業(yè)科技,2013,34(10):281-284.

[19]Cushman D W,Cheung H S.Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin I-converting enzyme of rabbit lung[J]. Biochem Pharmacol,1971,20:1637-1648.

[20]侯曼玲.食品分析[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2004:132-133.

[21]鄭炯,鄧惠玲,林茂.ACE抑制肽的酶法制備及其構(gòu)效關(guān)系的研究進展[J].食品工業(yè)科技,2012,33(15):418-427.

[22]Saito Y,Wanezaki K,Kawato A,et al.Structure and activity of angiotensin I converting enzyme inhibitory peptides fromsake and sake lees[J].Bioscience,biotechnology,and biochemistry,1994,58(10):176-1771.

[23]Yamamoto N,Akino A,Takano T.Antihypertensive effect of the peptides derived from casein by an extracelluar proteinase from Lactobacillus helveticus CP790[J]. Food Chemistry,1994,77(4):917-922.

[24]Alain Doyen,Lucie Beaulieu,Linda Saucier,et al.Demonstration ofinvitroanticancer properties fractions from a snow crab by-products hydrolysate after separation by electrodialysis with ultrafiltration membranes[J].Separation and Purification Technology,2011,26(78):321-329.

[25]Alain Doyen,Chibuike C,Udenigwe Patricia L. Mitchell. Anti-diabetic and antihypertensive activities of two flaxseed protein hydrolysate fractions revealed following their simultaneous separation by electrodialysis with ultrafiltration membranes[J]. Food Chemistry,2014,16(14):66-76.

[26]José Antonio Vázquez,Ma Pilar González,Miguel Anxo Murado. Production of antihypertensive and antioxidant activities by enzymatic hydrolysis of protein concentrates recovered by ultrafiltration from cuttlefish processing wastewaters[J]. Biochemical Engineering Journal,2013,18(76):43-54.

Study on antihypertensive peptides activity of enzymolysis liquid of pig femoral collagen and of it’s stabilityinvitro

SHU Yi-mei1,LI Cheng*,LI Ling-xi2,PAN Shu-xuan2,WANG Shi-yi2,GUO Wei2,FU Gang2,XIAO Lan2

(College of Food,Sichuan Agriculture University,Ya’an 625014,China)

Pig femoral collagen enzymatic hydrolysate was pretreatmented by 0.22μm and 0.45μm microfiltration membranes,then used the MWCO 5,3,2ku ultrafiltration membrane for ultrafiltration step by step,and the color value,clarity,protein recovery and ACE inhibitory as index,the effect of the different permeate on enzymatic hydrolysate were compared,taken the test to remain activity under acid,alkaline conditions,hot environment and trypsinl enzymes proteolysis.The results showed:the enzymatic hydrolysate was pretreatmented by 0.22μm better than 0.45μm in color value and clarity,but the former was lower in protein recovery,they had no difference in ACE inhibitory.All of the permeate were obtained and the MW<2ku had the best activity with the IC50was 0.83mg/mL. The stability of antihypertensive peptide,lower than 2ku,was investigated and the results this kind of peptide could remain activity under acid,alkaline conditions and hot environment could had the ability to resist trypsinl enzymes proteolysis.However,the activity decreased when treated by pepsin,and it’s activity keep more than 95% of the original.

enzymolysis liquid of pig femoral;antihypertensive peptides;ultrafiltration;stability;Half inhibitory concentration of ACE

2014-06-03

舒一梅(1989-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：畜產(chǎn)品質(zhì)量與安全。

*通訊作者:李誠(1964-)，男，碩士，教授，研究方向：畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全控制。

TS201.1

A

1002-0306(2015)07-0074-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.006