丹參水提物對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

張東濤 黃偉哲 陳喜珊

丹參水提物對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

張東濤 黃偉哲 陳喜珊

目的 觀察丹參水提物對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。方法 采用大鼠離體心臟灌流技術(shù)制備心臟缺血再灌注損傷模型, 用不同濃度丹參水提物灌流心臟。觀察記錄復(fù)灌50 min時的心肌功能變化。結(jié)果 丹參水提物可提高心臟缺血再灌期的左心室舒張壓(LVDP)、左心室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)、左心室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dtmax)水平, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01), 降低左心室舒張末壓(LVEDP)、肌酸激酶(CK)和乳酸脫氫酶(LDH)水平, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01), 提高心肌中p-Akt水平, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)論 丹參水提物對缺血再灌注損傷心臟具有保護(hù)作用, 這一保護(hù)作用與它調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)信號通路有關(guān)。

離體心臟缺血再灌注；丹參水提物；磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶

丹參, 唇形科植物丹參的根。臨床上丹參廣泛應(yīng)用于心血管系統(tǒng)疾病, 具有改善微循環(huán)、抗菌等作用［1］。心肌缺血再灌注損傷主要包括四個方面的病理生理學(xué)改變：再灌注性心律失常, 心肌收縮功能障礙, 心肌細(xì)胞壞死以及冠狀微循環(huán)障礙［2］。本研究采用阻斷離體大鼠心臟冠脈血流45 min后復(fù)灌, 模擬缺血再灌注損傷模型, 從心肌酶的漏出及心肌細(xì)胞凋亡檢查等方面觀察丹參水提物對心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料 丹參水提物是作者試驗室自制。

1.2 模型制備 大鼠腹腔注射(i.p.)肝素100 U/kg 抗凝, 30 min后i.p.戊巴比妥鈉 50 mg/kg麻醉。快速取下心臟放于改良的K-H緩沖液(4℃)中沖洗, 迅速主動脈插管懸掛心臟于Langendorff灌流裝置上, 用改良的K-H緩沖液(以95%O2和5% CO2飽和)行主動脈逆行灌流［灌注壓為70 cm H2O(1 cm H2O =0.098 kPa), 速度5～8 ml/min］, 溫度穩(wěn)定在37℃, 自制銅電極置于心臟表面的左上及右下角, 連接Medlab生物信號處理系統(tǒng)記錄心外膜電圖。灌注液及心臟周圍溫度用恒溫循環(huán)水浴維持在(37±5)℃。平衡灌注20 min, 待心臟各項功能穩(wěn)定,關(guān)閉灌流液停止灌流, 造成全心缺血, 30 min后打開灌流液再復(fù)灌50 min。

1.3 分組與灌流方案 將大鼠分為空白對照組、I/R模型組、丹參水提物組、LY294002組, 每組 12只, 臨用前將丹參水提物或LY294002溶于灌流液中, 使終質(zhì)量濃度為0.15 g/L或20 μmol/L, 空白對照組用K-H液持續(xù)灌注100 min；模型組以K-H液灌流穩(wěn)定20 min后, 停止灌流30 min, 復(fù)灌50 min；丹參水提物組和LY294002組復(fù)灌K-H 液中含丹參水提物或LY294002, 其他同I/R組。

1.4 LVDP、LVEDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax測定 LVDP、LVEDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax的測定參照參考文獻(xiàn)［3］相關(guān)內(nèi)容操作。1.5 CK和LDH分析 心臟再灌流出液CK和LDH水平使用試劑盒測定。

1.6 TUNEL法檢測凋亡 試劑為美國CHEMICON公司產(chǎn)品。組織切片常規(guī)脫蠟至水, 0.3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性, 0.1 mg/ml蛋白酶K消化40 min, TdT反應(yīng)液,鏈霉親和素-辣根過氧化物酶(SP-HRP)37℃各作用1 h, 二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色, 蘇木素復(fù)染, 脫水, 透明, 封片。實驗設(shè)加脫氧核糖核酸酶Ⅰ(DnaseⅠ)的為陽性對照, 加不含TdT反應(yīng)液的為陰性對照。普通光學(xué)顯微鏡隨機選5個高倍視野(×400), 計數(shù)其中凋亡細(xì)胞數(shù), 并算出凋亡細(xì)胞占腫瘤細(xì)胞總數(shù)的百分比值, 即凋亡指數(shù)(AI)。

1.7 Western blot實驗 提取心臟組織蛋白, 經(jīng) BCA法測定蛋白質(zhì)濃度, 煮沸變性, 4%濃縮膠, 12%分離膠, 上樣, 電泳, 轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上, 脫脂牛奶封閉過夜, 一抗p-Akt(1：300)室溫孵育2 h, 辣根過氧酶標(biāo)記的二抗于室溫2 h孵育, 洗滌, ECL發(fā)光顯色, 曝光顯影, Image J分析軟件進(jìn)行分析, 將目的蛋白與β-actin 光密度比值作為目的蛋白的相對表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 采用方差分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 同對照組相比, I/R組LVDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax水平顯著降低, 而LVEDP顯著增加, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；同I/R組比較, 丹參水提物能夠顯著提高LVDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax水平, 降低LVEDP水平, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。LY294002能夠降低丹參水提物的作用效果,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01或P＜0.05)。見表1。

2.2 同對照組相比, I/R組CK和LDH水平顯著增加, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；同I/R組比較, 丹參水提物能夠顯著降低CK和LDH水平, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01), LY294002能夠降低丹參水提物的作用效果, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。見表2。

2.3 同對照組相比, I/R組AI顯著增加, 而p-Akt蛋白表達(dá)水平顯著降低, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；同I/R組比較,丹參水提物能夠顯著提高p-Akt蛋白表達(dá)水平, 降低AI水平,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。LY294002能夠降低丹參水提物的作用效果, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。見表3。

表1 四組LVDP、LVEDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax水平變化n=12)

表1 四組LVDP、LVEDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax水平變化n=12)

注：與對照組比較,aP＜0.01；與I/R組比較,bP＜0.01；與I/R+丹參水提物組比較,cP＜0.05,dP＜0.01；1 mm Hg=0.133 kPa

組別LVDP(mm Hg)LVEDP(mm Hg)+dp/dtmax(mm Hg/s)-dp/dtmax(mm Hg/s)對照組122.5±13.62 9.04±1.154518.4±472.6-2617.3±319.7 I/R組 80.7±9.07a38.19±4.27a3281.5±351.4a-1274.1±131.6aI/R+丹參水提物組 114.2±13.11b15.37±1.66b4208.4±442.7b-2283.5±247.5bI/R+丹參水提物+LY294002組 96.3±10.42c29.41±3.28d3714.6±381.5d-1537.7±160.3d

表2 四組CK和LDH水平變化( x-±s, n=12)

表3 四組AI 和p-Akt水平變化( x-±s, n=12)

3 討論

動物離體心臟模擬缺血-再灌注過程, 同樣證實了再灌注過程誘導(dǎo)了心肌細(xì)胞凋亡［4］, 細(xì)胞凋亡是不同于細(xì)胞壞死的另一種細(xì)胞死亡方式, 它是在誘導(dǎo)因子作用下, 細(xì)胞啟動內(nèi)部自身基因調(diào)控機制, 引起細(xì)胞主動的自殺過程, 它涉及一系列基因的激活、表達(dá)及調(diào)控等過程［5］。本試驗發(fā)現(xiàn)丹參水提物能夠提高LVDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax水平, 降低LVEDP水平, 這表明丹參水提物能改善離體心臟的收縮功能,同時, 丹參水提物能降低心肌組織中CK和LDH的滲漏。

PI3K/Akt是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路, 在細(xì)胞的凋亡、存活以及增值等活動中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。PI3K下游有多種效應(yīng)分子, Akt處于這一通路的中心環(huán)節(jié), 不僅是PI3K下游的直接靶點, 也是其最主要的靶酶, 傳遞由PI3K始動的信息。Akt的磷酸化是PI3K/Akt信號通路活化, 發(fā)揮抗凋亡作用的關(guān)鍵［6］。激活的Akt通過磷酸化其下游靶點,發(fā)揮抑制凋亡或促進(jìn)增殖等效應(yīng)保護(hù)心肌。本試驗發(fā)現(xiàn)丹參水提物能夠提高Akt的磷酸化水平, 降低心肌細(xì)胞凋亡率, Akt的抑制劑LY294002能夠減弱丹參水提物的作用功效, 這表明丹參水提物能通過激活PI3K/Akt信號通路來改善離體心臟的收縮功能和降低心肌細(xì)胞的凋亡率。

［1］ Fong CC, Wei F, Chen F, et al.Danshen-Gegen decoction exerts proliferative effect on rat cardiac myoblasts H9c2 via MAPK and insulin pathways.Journal of Ethnopharmacology, 2011, 138(1):60-66.

［2］ 徐叔云, 卞如濂, 陳修.藥理實驗方法學(xué).北京:人民衛(wèi)生出版社, 1991:986-987.

［3］ Koyama T, Tawa M, Yamagishi N, et al.Role of superoxide production in post-ischemic cardiac dysfunction and norepinephrine overflow in rat hearts. European Journal of Pharmacology, 2013, 711(1-3):36-41.

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［5］ Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR.Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics .Br J Cancer, 1972, 26(4):239-257.

［6］ Cantley LC.Thephosphoinositide3-kinasepathway.Science, 2002, 296(11):1655-1657.

Protective effect of Salvia Miltiorrhiza aqueous extract for mice isolated heart ischemia reperfusion

ZHANG Dong-tao, HUANG Wei-zhe, CHEN Xi-shan.Department of Cardiovascular Medicine, The First Affiliated Hospital of Medical College of Shantou University, Shantou 515041, China

Objective To observe the protective effect of Salvia Miltiorrhiza aqueous extract for mice isolated heart ischemia reperfusion.Methods Perfusion technique of isolated heart was applied to make isolated heartischemia reperfusion model, and different concentrations of Salvia Miltiorrhiza aqueous extracts were used for reperfusion.Records were made on the changes of myocardial function at 50 min of reperfusion.Results Salvia Miltiorrhiza aqueous extract could improve levels of LVDP, left heart interior maximum pressure rise rate (+dp/dtmax), left heart indoor pressure maximum decline rate (-dp/dtmax) during heart ischemia reperfusion, and the difference had statistical significance (P＜0.01).Levels of LVEDP, CK, and LDH could be reduced, and the difference had statistical significance (P＜0.01).Level of p-Akt in myocardium could also be improved, and the difference had statistical significance (P＜0.01).Conclusion Salvia Miltiorrhiza aqueous extract provides protective effect for isolated heart ischemia reperfusion, and its effect is related with its regulation of PI3K/ Aktsignal channel.

Isolated heart ischemia reperfusion; Salvia Miltiorrhiza aqueous extract; PI3K/Akt

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.10.004

2014-11-05］

515041 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科(張東濤), 心胸外科(黃偉哲)；汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院心血管外科(陳喜珊)