脂肪酶固定化工藝優(yōu)化及其酶學性質(zhì)研究

王華，王瑩，詹長娟，王翼，徐偉，陳海燕

（1.南京理工大學泰州科技學院化工學院，江蘇泰州225300；2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院動物藥學院，江蘇泰州225300）

脂肪酶（EC 3.1.1.3）廣泛地用于催化水解[1]、醇解[2]、酯化[3]和轉(zhuǎn)酯反應(yīng)[4]，是繼蛋白酶、糖基水解酶之后，銷量最大的食品和工業(yè)用酶類，具有廣闊的市場空間和經(jīng)濟價值[5]。研究人員嘗試了利用多種載體來固定脂肪酶，如水滑石[6]、多孔玻璃珠[7]等無機材料，天然高分子材料殼聚糖[8]、海藻酸鈉[9]，聚偏氟乙烯膜[10]、芳香聚酰胺中空纖維膜[11]及珠狀環(huán)氧乙烷丙烯酸類多孔樹脂[12]等有機載體。通過吸附法、交聯(lián)吸附、共價結(jié)合及包埋法等對南極假絲酵母脂肪酶B（Candida antarctica B，CAL.B）、柱狀假絲酵母脂肪酶（Candida rugosa lipase，CRL）和豬胰脂肪酶（Porcine pancreatic lipase，PPL）等常見脂肪酶進行固定化。

本文以黑曲霉脂肪酶（Aspergillus niger lipase）為研究對象，采用大孔樹脂為載體，通過物理吸附固定化脂肪酶，并對固定化脂肪酶的性質(zhì)進行探討，為脂肪酶的固定化和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

脂肪酶（＞20 000 U/g）：寧夏和氏璧；牛白蛋白（BR）：國藥集團；考馬斯亮藍-G250（BR）：上海強順化學；橄欖油（CR）：國藥集團；聚乙烯醇（1750±50）：國藥集團；S-8、AB-8、D101大孔樹脂（孔徑 25 nm～28 nm，粒度0.3 mm～1.25 mm）：國藥集團；其余試劑均為市售分析純。

PHS-25型精密pH計、UV754N型紫外可見分光光度計：上海精密科學儀器；AL104型電子天平：梅特勒-托利多；78-1型磁力加熱攪拌器、SHA-8型雙功能水浴恒溫振蕩器：金壇市杰瑞爾電器。

1.2 脂肪酶的固定化

用0.1 mol/L磷酸緩沖液（PBS）配制20 mg/mL的脂肪酶溶液。在150 mL的錐形瓶中加入5 g預(yù)處理好的大孔樹脂和適量酶液，一定溫度下振蕩數(shù)小時。抽濾，用磷酸緩沖液沖洗，得固定化脂肪酶。

收集濾液，用考馬斯亮藍法測出其中的酶蛋白含量，并計算脂肪酶的固定化率[13]。

脂肪酶固定化率/%=（加入酶的總量-濾液中酶量）/加入酶的總量×100。

1.3 脂肪酶的活力測定

1.3.1 酶活的定義

在40℃、pH為7.5的條件下，1 s水解產(chǎn)生1 mol脂肪酸所需的脂肪酶酶量定義為一個活力單位（kat）。

1.3.2 NaOH滴定法測酶活

將聚乙烯醇與橄欖油（體積比=3∶1）在磁力攪拌器的攪拌下配制成乳化液，將磷酸緩沖溶液和橄欖油乳化液（體積比=5∶4）加入錐形瓶中混勻，在40℃水浴中預(yù)熱5 min，加入適量游離或固定化脂肪酶，40℃反應(yīng)15 min后，立即加入15 mL 95%乙醇以終止脂肪酶的催化反應(yīng)。脂肪酶能將乳化的橄欖油水解成脂肪酸和甘油，用標準NaOH溶液和酚酞指示劑對脂肪酸進行酸堿滴定至粉紅色。由消耗的NaOH的體積求出脂肪酶的酶活[14]。

固定化脂肪酶的活力回收率/%=固定化脂肪酶活力/（加入游離酶的總活力-濾液中脂肪酶活力）×100。

1.4 大孔樹脂的篩選

取3只150 mL錐形瓶，各加入5 g經(jīng)預(yù)處理的S-8、AB-8和D-101大孔樹脂和10 mL脂肪酶溶液（pH 7.5 PBS配制，20 mg/mL），40℃，振蕩 2 h。分別測定不同大孔樹脂作為載體的固定化脂肪酶的固定化率和固定化脂肪酶活力回收率。

1.5 固定化脂肪酶性質(zhì)研究

1.5.1 最適反應(yīng)溫度

分別取1 mL脂肪酶液和0.2 g固定化脂肪酶各9份，pH 7.5，在 30、32、34、36、38、40、42、44、46 ℃的條件下，測算游離和固定化脂肪酶的相對酶活。

1.5.2 最適反應(yīng)pH

分別取1 mL脂肪酶液和0.2 g固定化脂肪酶各7份，40 ℃，在 pH 為 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0 下，測定游離和固定化脂肪酶的相對酶活。

1.5.3 熱穩(wěn)定性

分別取1 mL肪酶液和0.2 g固定化脂肪酶各7份，在 20、30、40、50、60、70、80 ℃的條件下水浴振蕩 1 h，在40℃、pH 7.5的條件下，測定游離和固定化脂肪酶的相對酶活。

1.5.4 酸堿穩(wěn)定性

取0.2 g固定化脂肪酶7份，在pH為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0 的條件下水浴振蕩 1 h，過濾后，在40℃、pH 7.5的條件下，測定游離和固定化脂肪酶的相對酶活。

2 結(jié)果與討論

2.1 大孔樹脂的選擇

分別以S-8、AB-8、D-101為載體制備的固定化脂肪酶的固定化率和固定化脂肪酶活力回收率見表1。

表1 不同大孔樹脂的固定化脂肪酶的效果Table 1 Effect of various macroporous resin on the activity of lipase

根據(jù)表1可以看出載體的類型對脂肪酶的固定化率尤其是活力回收率影響較大，以極性大孔樹脂S-8為載體制備的固定化脂肪酶固定化率和活力均為最低。其原因可能是，脂肪酶有較強的疏水性[15-16]，能較好地吸附于弱極性的AB-8樹脂和非極性的D-101樹脂的表面及內(nèi)部孔道[17]?；谙嗤脑?，AB-8樹脂和D-101樹脂對非極性底物橄欖油存在較強的吸附作用力，增加了固定化脂肪酶與底物的接觸面積，從而使固定化酶具有相對高的活力[18]。其中，非極性大孔樹脂D-101在固定化脂肪酶固定化率及活力回收率效果最佳，因此，本文選擇D-101為脂肪酶固定化的載體。

2.2 響應(yīng)曲面法對固定化脂肪酶技術(shù)的研究

2.2.1 脂肪酶固定化響應(yīng)曲面實驗的設(shè)計與結(jié)果

在預(yù)試驗的基礎(chǔ)上，以固定化脂肪酶活力回收率（Y）為指標，考察pH、溫度、時間及給酶量等因素對D-101大孔樹脂固定化脂肪酶的影響，并采用Box-Benhnken試驗設(shè)計法對脂肪酶的固定化工藝進行進一步優(yōu)化[19]。分析因素及水平編碼表見表2，試驗方案及結(jié)果見表3。

表2 脂肪酶固定化因素水平表Table 2 Assigned concentrations of variables at different levels in Box-Behnken design for the immobilization of lipase

表3 脂肪酶固定化Box-Behnken試驗方案與結(jié)果Table 3 Experimental design and results of Box-Behnken design for the activity recovery ratio of lipase

對表3中的試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到活力回收率與pH、溫度、時間、給酶量之間的二次多元回歸方程：

固定化脂肪酶活力回收率/%=100.41+1.85A-2.71B+2.92C-1.59D+0.67AB+1.87AC-0.63AD-2.92BC+1.74BD+0.020CD-5.10A2-14.88B2-6.21C2-4.51D2

2.2.2 二次多元回歸模型方差分析

活力回收率試驗回歸方程方差分析結(jié)果見表4。

表4 活力回收率回歸方程系數(shù)估計及方差分析Table 4 Analysis of regression coefficient

方程模型的顯著性P＜0.000 1屬極顯著范疇，pH、溫度、時間和給酶量的影響均為極顯著，二次項BC 以及 A2、B2、C2、D2亦為極顯著，AC、BD 的影響為顯著。回歸模型的決定系數(shù)R2=0.982 8，校正決定系數(shù)R2(Adj)=0.965 6，表明該回歸方程可很好地描述pH等因素與響應(yīng)值活力回收率之間的相應(yīng)關(guān)系。

2.2.3 固定化脂肪酶活力回收率曲面分析

固定化脂肪酶活力回收率曲面分析見圖1。

從圖1（A～F）中可以知道：6個響應(yīng)曲面圖均為開口向下的凸形曲面，響應(yīng)值Y隨著每個因素的改變而發(fā)生變化，其中溫度對試驗結(jié)果的影響最大，表現(xiàn)為曲面最陡。這是因為酶蛋白長時間在相對高溫的環(huán)境中，可能會發(fā)生變性，導致酶活下降。圖 1（B）、1（D）和1（F）中等高線呈橢圓形，表明pH和溫度、給酶量和溫度、時間和溫度的交互作用比較明顯，與方差分析一致。

圖1 不同因素及其交互作用對固定化脂肪酶活力回收率的影響Fig.1 Curved surface plots（A～F）for reciprocal effect of each two factors on the activity recovery ratio of lipase

經(jīng)Design-Expert 8.0.6軟件分析，大孔樹脂固定化脂肪酶的最優(yōu)條件為pH 7.62、38.72℃、4.30 h、給酶量為8.92 mL，固定化脂肪酶活力回收率的預(yù)測結(jié)果為101.417%?？紤]到試驗操作的可控性，在條件為pH7.6、溫度為39℃、時間為4.3 h、給酶量為9.0 mL的條件進行3組重復性驗證試驗，其實際測得的固定化脂肪酶平均固定化率為95.11%，活力回收率為101.36%，與預(yù)測值較為接近，驗證了響應(yīng)面法回歸模型的合理性。

2.3 固定化脂肪酶性質(zhì)討論

2.3.1 最適反應(yīng)溫度的測定

最適反應(yīng)溫度的測定見圖2。

圖2 游離酶和固定化脂肪酶反應(yīng)最適溫度Fig.2 Effect of temperature on lipase activity

由圖2可知，游離脂肪酶的最佳反應(yīng)溫度為38℃，而固定化脂肪酶的最佳反應(yīng)溫度為40℃。溫度低于40℃時，固定化酶的相對活力較游離酶低，這是因為脂肪酶吸附于D-101樹脂孔道中，脂肪酶分子的尺寸為幾個到十幾個納米，D-101大孔樹脂的孔徑為25nm～28 nm，底物橄欖油的擴散速度受到影響[20-21]，隨著溫度的升高，橄欖油分子運動速度加快，表現(xiàn)出酶活力迅速增大。溫度繼續(xù)升高，固定化脂肪酶酶的活力下降比游離酶慢，這是因為吸附于D-101樹脂孔道中的脂肪酶空間構(gòu)象相對穩(wěn)定，在一定程度上提高了脂肪酶的耐熱性，使脂肪酶能夠在更廣的溫度范圍內(nèi)催化反應(yīng)。

2.3.2 最適pH的測定

最適pH的測定見圖3。

圖3 游離酶和固定化脂肪酶反應(yīng)最適pHFig.3 Effect of pH on lipase activity

由圖3可知，在pH＜7.5時，固定化脂肪酶相對酶活由酸堿度引起的變化比游離酶大，在pH＞7.5時，固定化脂肪酶相對酶活由酸堿度引起的變化比游離酶小。橄欖油水解產(chǎn)生的脂肪酸受到樹脂孔道的擴散限制。當固定化酶位于酸性環(huán)境中時，脂肪酶周圍微環(huán)境中短時間內(nèi)積累較多的脂肪酸，酶活受到抑制，當固定化酶位于堿性環(huán)境中時，產(chǎn)生的脂肪酸可被快速中和，故固定化后，脂肪酶在偏堿性環(huán)境下表現(xiàn)出較強的催化活性[22]。

2.3.3 脂肪酶的熱穩(wěn)定性

脂肪酶的熱穩(wěn)定性見圖4。

圖4 脂肪酶酶的熱穩(wěn)定性比較Fig.4 The plots of thermal stability of the immobilized and free lipase

圖4顯示，在較低的溫度中（＜40℃），游離脂肪酶和固定化脂肪酶的活力都很高，但隨著保溫溫度的提高（＞50℃），游離脂肪酶的相對酶活驟然下降。說明游離脂肪酶的熱穩(wěn)定性差，固定化脂肪酶熱穩(wěn)定性更好。這是因為酶經(jīng)固定化后，脂肪酶分子被吸附于大孔樹脂中，酶分子整體運動受阻，活性中心的穩(wěn)定性增加。

2.3.4 脂肪酶的酸堿穩(wěn)定性

脂肪酶的酸堿穩(wěn)定性見圖5。

圖5 脂肪酶的酶酸堿穩(wěn)定性Fig.5 The plots of pH stability of the immobilized and free lipase

固定化脂肪酶在不同pH條件下保存1 h后，相對酶活力均維持在70%以上（見圖5），酸堿穩(wěn)定性較好。

3 結(jié)論

本文以D-101大孔樹脂為載體，采用物理吸附法制備了固定化脂肪酶。通過Box-Benhnken原理設(shè)計了四因素三水平的響應(yīng)曲面試驗，優(yōu)化的脂肪酶固定化工藝為：pH 7.6、溫度39℃、時間4.3 h、給酶量為9.0 mL（20 mg/mL），在此條件下，固定化脂肪酶平均固定化率為95.11%，活力回收率為101.36%。固定化脂肪酶的最適溫度提高2℃和pH無明顯變化，向堿性方向偏移，熱穩(wěn)定性較游離酶有所提高（＞50℃），酸堿穩(wěn)定性好。

以價格低廉、性質(zhì)穩(wěn)定的D-101大孔樹脂為載體，制備的固定化脂肪酶，工藝簡單，固定化率和酶活回收率高，穩(wěn)定性好，具有較好的工業(yè)前景。

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