不同消化時間對原代心肌細胞的影響

屈雙麗，楊曉敏

0 引 言

原代心肌細胞培養(yǎng)是一項重要的體外實驗技術(shù)，其為建造心血管疾病發(fā)生發(fā)展過程的模型及探討基因、蛋白質(zhì)及信號通路的變化提供重要的基礎(chǔ)保障。此外，在體內(nèi)心肌細胞的活動受到神經(jīng)、體液等多方因素的影響，限制對其病理變化的過程的研究。而體外培養(yǎng)的原代心肌細胞不僅具有心肌細胞固有的活性，而且還有不受神經(jīng)、體液等因素的影響的可控制性。因此，原代心肌細胞培養(yǎng)的好壞，是影響實驗的結(jié)果的關(guān)鍵因素之一。本研究通過比較不同消化時間對原代心肌細胞的影響，探討一套簡便易行、成活率高的原代心肌細胞培養(yǎng)方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇出生1 ～2 d 的Wistar 大鼠，清潔級，雌雄不限，由內(nèi)蒙古大學(xué)動物研究中心提供，合格證編號:csxk(蒙)2002-0001。楊木小刨花墊窩，濕度45%～50%，溫度控制在21 ～27 ℃。

1.2 主要試劑及儀器 DMEM 高糖培養(yǎng)基(含100 U 青霉素+鏈霉素雙抗)、胎牛血清、Ⅱ型膠原酶(Worthington 公司，美國)、磷酸鹽緩沖液(PBS)、臺盼藍染色液;5-溴-2-脫氧尿苷(Brdu)、4%多聚甲醛、過氧化酶阻斷溶液、羊血清、α-actin 抗體(兔抗大鼠)、二氨基聯(lián)苯胺(3，3'-diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒、SABC(鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物法)免疫組化試劑盒、Mayor's 蘇木精、二甲苯、TritonX.100(生工生物工程有限公司，中國)、37 ℃恒溫浴鍋、醫(yī)用超凈工作臺、二氧化碳培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、恒溫離心機等。

1.3 實驗步驟 ①將大鼠浸沒在75%乙醇中消毒2 次，左手固定乳鼠暴露胸部，右手持眼科剪沿其胸骨左側(cè)剪開，壓住肺葉，心臟收縮時可見其膨出。眼科鑷鈍性分離下心臟，放入有10 mL 10%DMEM培養(yǎng)基(含雙抗)的培養(yǎng)皿中。②在第1 個培養(yǎng)皿中擠出心臟的積血并鈍性分離出1/2 ～2/3 心室下半部分，依次在第2、3 個平皿中洗滌后放入小燒杯中，用眼科剪快速將所有心臟剪成約1 mm3小塊。③取5 mL 消化液放入小燒杯，并輕晃燒杯5 ～8 次，棄去消化液。再次放入3 mL 消化液，用直頭吸管將燒杯中的混合物轉(zhuǎn)移到有膠塞的玻璃管中，并將其置于37 ℃水浴鍋中并不斷晃動8 ～10 min，隨后棄去消化液。④取新消化液5 mL 加入到玻璃管中，37℃水浴并晃動8 ～10 min。將組織消化液移入50 mL離心管，在此之前管中先放入20 mL 已溫育的含20%FBS 的DMEM(H+)，并混勻終止消化。重復(fù)此步驟6 ～7 次，直到組織快消化為白色絮狀物為止。⑤將收集的消化液800 r/min 的轉(zhuǎn)速離心5 min，棄上清。向離心沉淀中加入含10%FBS 的DMEM(H+)10 mL 混勻，用300 目濾網(wǎng)過濾。將濾液放入培養(yǎng)瓶中，于37 ℃孵箱中孵育90 min，差速貼壁90 min 后取出培養(yǎng)瓶，輕輕晃動，將上層懸濁液混勻移入孔板中(8 min 和10 min 接種濃度相同)，以每1 mL 培養(yǎng)基中加入10 μLBrdu，繼續(xù)溫箱培養(yǎng)，24 h 后更換10%FBS DMEM(H+)。⑥取出細胞爬片用PBS 緩沖液洗滌2 次，吸去PBS 后加入適量4%多聚甲醛固定30 min，蒸餾水洗滌2 min×2 次，吸干，加入適量蘇木精染色液室溫下染色8 min，流動水沖洗約10 min 后吸干，蒸餾水洗滌1 次后浸入95%乙醇5 s，吸干后加入適量伊紅染色液室溫下染色30 min，70%乙醇洗滌2 次，吸干后置室溫下晾干。

1.4 原代心肌細胞活力測定 ①臺盼藍染色法:取細胞懸濁液100 μL，加入100 μL 臺盼藍溶液(2×)，混勻。其鏡下表現(xiàn)為死細胞被染成淡藍色，而活細胞拒染。取10 μL 用細胞計數(shù)板計數(shù)，計數(shù)4 個大格中的活細胞總數(shù)和染成藍色的細胞數(shù)。使用血球計數(shù)板在倒置顯微鏡下分別計數(shù)分離純化前和分離純化后的細胞成活率，分別計數(shù)3 次，取其平均值。計算公式:

細胞存活率(%)=活細胞總數(shù)/(活細胞總數(shù)+死細胞總數(shù))×100%

②比較8 min 和10 min 消化時間下原代心肌細胞的活力:在倒置顯微鏡下觀察胞搏動頻率，每次觀察10 個細胞取平均值，對2 種消化時間下原代心肌細胞搏動頻率進行比較。

1.5 原代心肌細胞的鑒定 制作細胞爬片，培養(yǎng)48 h后取出，采用橫紋肌肌動蛋白(α-actin)作免疫染色，進行心肌細胞的鑒定。α-actin 為一抗，同時用PBS作為一抗進行對照。取爬片，4%多聚甲醛室溫固定、0.1%Triton100 室溫孵育穿透及滅活內(nèi)源性過氧化物酶各30 min 后，滴加1∶100 的α-actin 抗體(兔IgG)，4 ℃過夜，孵育二抗20 min，最后DAB 顯色，蘇木精輕度復(fù)染。封固后，顯微鏡下拍照。

1.6 建立心肌肥大模型 原代心肌細胞孔板中加入血管緊張素II(Angiotensin II，Angll)，使其終濃度為10-5mmoI/L，形成心肌肥大模型(即實驗組);對照組加入相同體積的10%FBS DMEM(H+)培養(yǎng)液，作用48 h 后，采用RT-PCR 技術(shù)觀察原代心肌細胞肥大標志性基因心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide，ANP)mRNA 表達變化［1］。培養(yǎng)的原代心肌細胞經(jīng)胰蛋白酶消化懸浮后，在相同相差顯微鏡下拍攝照片，用圖像處理系統(tǒng)測量細胞的截面面積。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差()表示，2組間比較采用獨立樣本t 檢驗。以P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細胞形態(tài)

2.1.1 倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài) 培養(yǎng)12 h后，細胞部分貼壁，多呈圓形、梭形及三角形。培養(yǎng)24 h 后，細胞基本上全部貼壁，并呈有自發(fā)搏動，8 min 及10 min 消化時間的細胞形態(tài)未見明顯異常。培養(yǎng)48h后，8 min 消化時間的細胞少量伸出偽足，多呈三角形及多邊形，而10 min 消化時間的細胞大部分伸出偽足相互接觸交織成網(wǎng)，逐漸形成細胞簇，立體感明顯，細胞搏動及收縮均較明顯而有力。

2.1.2 HE 染色后光學(xué)顯微鏡下觀察細胞形態(tài) 細胞核染成藍色，細胞質(zhì)染成淡紅色，核膜較為清晰。原代心肌細胞數(shù)量較多呈簇狀聚集，細胞呈多角形、伸出多量偽足，細胞核豐滿、大小均勻，細胞質(zhì)豐富且著色均勻，見圖1a、b。心肌成纖維細胞細胞核染成藍色，細胞質(zhì)染成淡紅色，細胞核膜較為清晰，平坦，細胞體較大，細胞質(zhì)透明而薄，細胞核較大，呈橢圓形，顏色淡，見圖1c。

圖1 原代心肌細胞形態(tài)圖Figure 1 Morphology of primary cardimyocytes after digested for different times

2.2 心肌細胞活力檢測結(jié)果

2.2.1 臺盼藍染色結(jié)果 分離純化前活細胞的平均存活率＞90%，消化8 min 組和10 min 組比較未見明顯區(qū)別(P ＞0.05)。分離純化后活細胞的平均存活率也＞90%，且10 min 組的平均存活率高于8 min 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，見表1。

表1 不同消化時間心肌細胞分離純化前后平均存活率的比較，%)Table 1 Mean survival rate of cardimyocytes after digested for different times，%)

表1 不同消化時間心肌細胞分離純化前后平均存活率的比較，%)Table 1 Mean survival rate of cardimyocytes after digested for different times，%)

與8 min 組比較，#P ＜0.05

組別 分離純化前 分離純化后8 min 組93.5±0.9 93.0±0.8 10 min 組 93.0±1.7 95.4±0.8#

2.2.2 原代心肌細胞搏動 原代心肌細胞培養(yǎng)48 h后，2 種消化時間的細胞搏動均達40 ～50次/min;細胞培養(yǎng)5 d 后，發(fā)現(xiàn)8 min 消化時間的細胞搏動的數(shù)量及次數(shù)均明顯減少，而10min的細胞搏動未見明顯變化。

2.3 免疫組化結(jié)果 原代心肌細胞呈陽性反應(yīng)，細胞質(zhì)呈深棕色，8 min 和10 min 消化時間的細胞陽性率均＞95%，而心肌成纖維細胞呈陰性反應(yīng)，細胞質(zhì)無棕色顆粒，見圖2。

圖2 不同消化時間心肌細胞免疫組化鏡下結(jié)果(×10)Figure 2 Immunohistochemical results of primary cardimyocytes after digested for different times(×10)

2.4 細胞截面平均面積 10 min 消化時間的原代心肌細胞ANP 的CT 值比較，實驗組較對照組表達顯著升高(P ＜0.05)，而內(nèi)參GADPH 的CT 值比較，實驗組和對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)。Angll 作用原代心肌細胞48 h 后，實驗組較對照組細胞截面平均面積比較明顯增加(P ＜0.05)，而8 min的原代心肌細胞截面面積和ANP 值未見顯著變化(P ＞0.05)。

表2 肥大模型中各組相關(guān)指標的比較Table 2 Comparison of relevant indexes between the experimental and control groups of cardiac hypertrophy models

表2 肥大模型中各組相關(guān)指標的比較Table 2 Comparison of relevant indexes between the experimental and control groups of cardiac hypertrophy models

與對照組比較，*P ＜0.05

組別 ANP(CT 值)GADPH(CT 值)截面平均面積(μm2)對照組15.8±0.5 32.74±0.58 14.11±4.29實驗組 20.8±0.7* 32.53±0.88 34.77±8.43*

3 討 論

原代心肌細胞培養(yǎng)為建立心肌模型提供有效的技術(shù)手段，并逐漸趨于成熟。自1960 年Harary 等［2］首次成功的培養(yǎng)出Wister 乳鼠的原代心肌細胞起，國內(nèi)外許多學(xué)者對心肌細胞原代培養(yǎng)方法不斷地進行研究及改進，并取得一定成果。現(xiàn)有資料顯示，影響原代心肌細胞成活率及活性的主要因素有消化溫度、消化酶及消化時間。目前，消化酶的選擇主要有2 種，即單獨使用胰酶［3-4］和胰酶+膠原酶合用［5-6］。胰酶能分解組織間質(zhì)的蛋白成分，膠原酶的作用是特異性地水解細胞間質(zhì)中的膠原纖維，因胰酶作用較強易破壞細胞膜，而膠原酶作用緩和，近年來主要采用胰酶和膠原酶合用來進行消化。在選用胰酶+膠原酶的實驗中多數(shù)采用其最適溫度37℃進行消化，或單獨應(yīng)用胰酶4 ℃過夜［7］，采用其較弱的活性充分分解心肌組織間質(zhì)，之后在應(yīng)用膠原酶進行消化，以減少對細胞膜的損傷，提高細胞的成活率和活性。

原代細胞培養(yǎng)計數(shù)的步驟已趨于成熟，本研究在結(jié)合自身實驗室條件及環(huán)境下進行反復(fù)摸索，得到了一套簡便易行并且能或得較高成活率、純度及活性的原代心肌細胞的培養(yǎng)方法。同時，在其他操作條件不變的情況下，探討不同消化時間如8 min及10 min 對原代心肌細胞的成活率、活性的影響。在本實驗中，應(yīng)用了目前有關(guān)原代心肌細胞培養(yǎng)實驗中相對成熟的步驟，如選擇出生3 d 內(nèi)的乳鼠［8］及采用90 min 差速貼壁法和Brdu 抑制法分離純化細胞［9-10］等。在消化酶方面，只采用作用較緩和的膠原酶在37 ℃進行消化，同時，采用短時間多次消化的方式，防止膠原酶消化不徹底，從而增加細胞的產(chǎn)量。在消化時間方面，本研究采用8 min 和10 min消化時間，通過對比發(fā)現(xiàn)，2 組純度鑒定陽性率均達到95%以上，而8 min 組的細胞形態(tài)明顯滯后于10 min 組，且10 min 組的存活時間和存活率顯著高于8 min 組。本研究認為采用8 min 消化法獲得的細胞生存時間短可能的原因是由于膠原酶消化不徹底，細胞在震蕩中從組織中分離下來，也可能損傷細胞膜，所以導(dǎo)致成活率較10 min 低。另一方面，由于細胞數(shù)量少，接種到孔板中的細胞濃度低而影響到單個細胞的搏動及同步化搏動。最后，利用消化時間為10 min 心肌細胞成功的建立心肌肥大模型，AngII 作用48 h 后心肌細胞即實驗組ANP 和表面積與對照組相比表達顯著升高和增加，而消化時間為8 min 的心肌細胞表面積和ANP 值未見顯著變化。與其他原代心肌細胞培養(yǎng)實驗相比，本研究成功的從活性和實用性方面說明消化時間是其重要的影響因素。同時說明，該心肌細胞的培養(yǎng)方法能夠應(yīng)用于基礎(chǔ)實驗的研究。

應(yīng)用本實驗方法獲取心肌細胞要注意以下幾個方面:①選擇有正常生育周期及哺乳周期的育齡期母鼠進行生育。因母鼠的狀態(tài)會直接影響幼鼠的成活率和生長狀態(tài)及心臟發(fā)育的狀態(tài);②心肌細胞培養(yǎng)的過程中要遵守?zé)o菌操作的規(guī)則，用到的器械及玻璃制品要進行高壓滅菌。乳鼠也需要在75%乙醇中消毒2 次，取心臟時應(yīng)快速，以使取出的心臟仍有搏動。此外，還要避免剪破腹腔，防止污染;③丟棄第1 次消化心肌組織的膠原酶，以去除組織中的血細胞及表面的纖維細胞;④37 ℃消化時應(yīng)不斷搖晃使消化液與組織充分混勻;⑤經(jīng)過反復(fù)驗證，在心肌細胞培養(yǎng)的最初24 h 內(nèi)越少移動細胞，其生長狀態(tài)越好。

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