幾種體外評價乳酸菌無細胞提取物抗氧化活性方法的比較研究

顧品品,邢家溧,王 剛,*,張秋香,印伯星,房東升,張 灝,陳 衛(wèi),2,*

(1.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫 214122;2.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室,江蘇無錫 214122;3.揚州市揚大康源乳業(yè)有限公司,江蘇揚州 225004)

幾種體外評價乳酸菌無細胞提取物抗氧化活性方法的比較研究

顧品品1,邢家溧1,王 剛1,*,張秋香1,印伯星3,房東升3,張 灝1,陳 衛(wèi)1,2,*

(1.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫 214122;2.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室,江蘇無錫 214122;3.揚州市揚大康源乳業(yè)有限公司,江蘇揚州 225004)

乳酸菌的抗氧化活性與其對人體的健康促進作用密切相關(guān)。本研究以DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力、還原活性等為體外抗氧化能力評價指標(biāo),對17株不同來源乳酸菌的無細胞提取物抗氧化能力進行評價,并對評價結(jié)果進行了比較和篩選,然后進一步研究了抗氧化活性強和低的菌株的抗氧化酶活性。結(jié)果顯示不同來源乳酸菌的無細胞提取物抗氧化活性存在種間和種內(nèi)差異,而3種體外化學(xué)方法具有顯著相關(guān)性(p<0.01)。3種評價指標(biāo)均顯示嗜酸乳桿菌CCFM8具有很強的抗氧化活性,發(fā)酵乳桿菌CCFM381抗氧化活性最弱。進一步乳酸菌無細胞提取物抗氧化酶活性的測定結(jié)果也與上述3種體外抗氧化能力評價指標(biāo)的綜合結(jié)果具有很好的一致性。該研究為綜合評價乳酸菌抗氧化能力以及體外篩選具有高抗氧化活性的乳酸菌提供了可靠的參考依據(jù)。

乳酸菌,抗氧化,自由基,抗氧化酶

氧化應(yīng)激是機體自由基的產(chǎn)生和內(nèi)在抗氧化系統(tǒng)消減之間不平衡造成的,可引發(fā)癌癥、關(guān)節(jié)炎、心血管等疾病[1]。因此,補充抗氧化物質(zhì)增強機體抗氧化能力是十分必要的。然而許多化學(xué)合成的抗氧化物存在安全隱患,因此找到天然的抗氧化物是解決此類問題最為有效的途徑[2-3]。目前,乳酸菌由于其健康保健作用,能夠降低ROS的生成,受到越來越多的關(guān)注。大量研究表明乳酸菌可以緩解氧化應(yīng)激從而阻止疾病的發(fā)生[4]。因此,無論從營養(yǎng)保健還是安全性考慮,乳酸菌作為天然抗氧化物質(zhì)吸引了眾多學(xué)者的研究興趣,成為近年來抗氧化研究的新熱點。目前對乳酸菌抗氧化能力的研究和利用多是針對活菌和無細胞提取物,很多體內(nèi)與體外實驗研究證明,乳酸菌細胞和無細胞提取物在體外具有類似抗氧化劑的活性[5]。張?zhí)觳┑萚6]測定了52株菌株的細胞和無細胞提取物DPPH清除能力,研究發(fā)現(xiàn)菌株無細胞提取物的清除率均高于細胞。Lin和Yen[7]在對19株乳酸菌無細胞提取物進行抗氧化實驗發(fā)現(xiàn),所有菌株對抗壞血酸的自動氧化均具有抑制作用。

表1 本實驗所用的菌株

注:CCFM-JU*:江南大學(xué)微生物菌種保藏中心。

本文通過DPPH自由基清除能力,羥自由基清除能力和還原能力3種化學(xué)方法,對來源于自然發(fā)酵食品中的17株乳酸菌的無細胞提取物抗氧化活性進行了分析和比較,并且比較了該3種化學(xué)方法所得結(jié)果的相關(guān)性。此外,本研究進一步對抗氧化活性較高和較低菌株中的SOD、GSH-PX以及CAT的含量進行了測定,并分析抗氧化活性與抗氧化物酶之間的關(guān)系,為全面分析乳酸菌的抗氧化能力提供了可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本實驗所用的菌株均為乳酸菌,由江南大學(xué)微生物菌種保藏中心提供,均分離自發(fā)酵泡菜,青海老酸奶,海南的酸豆角等自然發(fā)酵食品[8]。

二苯代苦味肼基(DPPH) 美國Sigma 公司;SOD和GSH檢測試劑盒南京建成科技有限公司;硫代巴比妥酸(TBA),三氯乙酸(TCA),1,10-菲啰啉,FeSO4均為國產(chǎn)分析純。

MRS培養(yǎng)基:蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母5 g、檸檬酸氫二銨2 g、葡萄糖20 g,吐溫8～10 mL、乙酸鈉5 g、磷酸氫二鉀2 g、硫酸鎂0.58 g、硫酸錳0.25 g,蒸餾水1000 mL,pH6.2～pH6.6,121 ℃滅菌15min[9]。

H.H.S21-4電熱恒溫水浴鍋 上海醫(yī)療器械五廠;101-1型干燥箱 中國上海市實驗儀廠;Delta320-S型pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;PYX-DHS隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械廠;LS-B50L立式壓力蒸汽滅菌器 上海三申醫(yī)療器械有限公司;WFJ 2000型可見光分光光度計尤尼柯 上海儀器有限公司;Multiskan MK3酶標(biāo)儀 美國Thermo公司;TGL-16C離心機 上海安婷科學(xué)儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的活化與無細胞提取物的制備 (1)菌株的活化17株乳酸菌菌株來源于7個種屬(L.rhamnosus,L.acidophilus,L.casei,L.fermenti,L.reuteri,L.farciminis,L.plantarum)保存于含30%(v/v)甘油的MRS培養(yǎng)基中,-80 ℃凍存。使用前按1%(v/v)接種量接于MRS液體培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)18 h,連續(xù)活化2次。

(2)無細胞提取物的制備乳酸菌無細胞提取物的制備參考Liu和Pan的方法[4],收集活化后的乳酸菌(4 ℃,6000 r/min,10 min),用PBS清洗2次后,重懸于PBS中(1×109CFU/mL)超聲破碎。超聲破碎條件設(shè)置為:功率60 W,工作3 s停8 s,共15 min。將超聲后的破碎液以12000 r/min離心20 min后取其上清,經(jīng)過0.22 μm的濾膜過濾后得到無細胞提取物。

1.2.2 乳酸菌無細胞提取物DPPH清除率的測定 參考Lin和Chang的方法[10],取乳酸菌無細胞提取物1 mL加入試管中,再加入1 mL 0.2 mmol/L的DPPH-無水乙醇溶液,充分混勻后,避光反應(yīng)30 min,然后取上清液,于517 nm處測定吸光值,以等體積的PBS代替樣品溶液作為對照組。

按照以下公式計算:

DPPH自由基清除率(%)=(1-A517樣品/A517對照)×100

式中:A517樣品和A517對照分別為樣品組和對照組在517 nm處測得的吸光值。

1.2.3 乳酸菌無細胞提取物清除羥自由基能力的測定 參考相關(guān)文獻[11-12],將2.5 mmol/L的1,10-菲啰啉溶液、PBS(pH7.4)和樣品溶液各1 mL混勻,再加入1 mL 2.5 mmol/L的FeSO4溶液,充分混勻后加入1 mL 20 mmol/L的H2O2溶液。將混合液放入37 ℃水浴中恒溫反應(yīng)1.5 h。6000 r/min離心10 min收集上清,于536 nm波長處測定其吸光值。同時按照上述方法,以1 mL PBS替代混合液中1 mL待測樣品溶液作為空白對照組,測定在536 nm處的吸光值。

按照以下公式計算:

羥自由基清除率(%)=(1-A536樣品/A536對照)×100

式中:A536樣品和A536對照分別為樣品組和對照組在波長536nm處測得的吸光值。

1.2.4 乳酸菌無細胞提取物還原能力的測定 參照Lin等人的方法[7]略有改進:取0.5 mL待測無細胞提取物,向其中加入0.5 mL 1% 鐵氰化鉀溶液及0.5 mL PBS(pH6.6),混勻后置于50 ℃水浴恒溫反應(yīng)20 min。從水浴中取出后放入冰浴中急速冷卻,再加入0.5 mL10%的三氯乙酸溶液,混勻后離心收集上清(3000 r/min,10 min)。取上清液1 mL,再加入1 mL 0.1%的三氯化鐵溶液,混合均勻。10 min后在700 nm處測定其吸光值,其中以L-半胱氨酸鹽酸鹽作為標(biāo)品。同時,將上述混合液中的樣品換成蒸餾水作為對照組,于700 nm波長處測定其吸光值。吸光值越大表示待測樣品的還原能力越強[7]。

1.2.5 乳酸菌無細胞提取物GSH-Px,SOD,CAT活性的測定 按照試劑盒說明操作。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 采用Excel 2003和SPSS 13.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件處理實驗數(shù)據(jù),每個實驗重復(fù)3次。采用SPSS的單因素方差分析(ANOVA)樣品的顯著性差異,相關(guān)性分析采用Pearson測試。

2 結(jié)果與分析

2.1 DPPH自由基清除率

DPPH自由基清除率的測定是一種廣泛使用的篩選和評價抗氧化劑抗氧化能力的方法[5]。DPPH清除率越大表明抗氧化能力越強。本研究測定了17株乳酸菌的無細胞提取物對DPPH自由基的清除情況,實驗結(jié)果如圖1所示。17株菌株都表現(xiàn)出一定的DPPH清除能力,所有菌株的DPPH清除率都在70%以上。其中,CCFM137、CCFM8、CCFM620具有較強的清除能力,而CCFM237、CCFM381表現(xiàn)出較低的DPPH清除率。同時,研究也發(fā)現(xiàn)在菌株種間和種內(nèi)也存在著一定的差異。其中,CCFM381、CCFM424、CCFM620都屬于發(fā)酵乳桿菌,但存在明顯的種內(nèi)差異(p<0.05);CCFM137、CCFM6、CCFM8這3株嗜酸乳桿菌的DPPH自由基清除率明顯高于CCFM469,CCFM237和CCFM310這3株鼠李糖乳桿菌,表現(xiàn)出一定的種間差異。此研究結(jié)果與Sharma,P. K[13]等的研究結(jié)果是一致的,Sharma,P. K等發(fā)現(xiàn)4種乳酸菌菌株LB06,LBS3,LB02 和 LBS1的DPPH清除率均有差異,這種差異可能是由不同菌株中起到抗氧化作用的活性物質(zhì)種類或濃度不同造成的。

圖1 乳酸菌無細胞提取物的DPPH清除率Fig.1 DPPH radical scavenging activity of cell free extracts of lactobacilli注:圖中 a,b,c,d,e 表示不同編號菌株具有顯著性差異(p<0.05),含有相同字母表示沒有顯著差異(p>0.05),圖2、圖3同。

2.2 清除羥自由基能力

羥自由基是體內(nèi)氧化性很強的自由基,會造成大分子損傷,因此清除羥自由基的能力也是反映抗氧化能力的重要指標(biāo)。測定乳酸菌無細胞提取物的清除羥自由基能力的實驗原理是芬頓反應(yīng)[14-15]。目前芬頓反應(yīng)體系已經(jīng)成為評價抗氧化能力高低的一種方法[5]。

本研究測定了不同乳酸菌無細胞提取物對芬頓反應(yīng)形成的羥自由基的清除能力,實驗結(jié)果如圖2所示。所有菌株都表現(xiàn)出一定的羥自由基清除能力,清除能力在16.48%±0.15%～48.30%±0.83%范圍內(nèi)。其中CCFM137、CCFM8、CCFM620表現(xiàn)出較強的羥自由基清除能力,而CCFM381表現(xiàn)出最低的還原能力。類似于DPPH清除率,菌株的羥自由基清除能力也表現(xiàn)出了種間和種內(nèi)差異。CCFM238、CCFM239均屬于植物乳桿菌,CCFM381、CCFM424、CCFM620均屬于發(fā)酵乳桿菌,羥自由基清除能力存在明顯的種內(nèi)差異;而干酪乳桿菌CCFM9、CCFM5、CCFM30與植物乳桿菌CCFM238、CCFM239相比,羥自由基清除能力有顯著的種間差異。干酪乳桿菌CCFM9、CCFM5、CCFM30與嗜酸乳桿菌CCFM469、CCFM237、CCFM310又存在明顯的種間差異。

本研究與劉洋等[16]進行的實驗結(jié)果相比較,17株乳酸菌無細胞提取物的羥自由基清除率都高于發(fā)酵乳桿菌、乳酸乳球菌、嗜酸乳桿菌、瑞士乳桿菌這4 株乳酸菌的無細胞提取物,即這17株乳酸菌無細胞提取物清除羥自由基方面體現(xiàn)出來的抗氧化能力均優(yōu)于以上4株乳酸菌。

圖2 乳酸菌無細胞提取物的羥自由基清除能力Fig.2 Hydroxyl radical scavenging activity of cell free extracts of lactobacilli

表2 3種抗氧化活性測定方法之間的相關(guān)性

注:*p<0.05;**p<0.01。

2.3 還原能力

前人研究表明抗氧化能力與還原能力是直接相關(guān)的[17-18]。如圖3所示,17株菌的無細胞提取物的還原能力的測定結(jié)果均顯示乳酸菌均具有一定的還原能力。其中CCFM8表現(xiàn)出較強的還原能力;而CCFM381表現(xiàn)出最低的還原能力。除了陽性對照LGG所在的鼠李糖乳桿菌之外,其余6個種屬均表現(xiàn)出種內(nèi)差異;干酪乳桿菌CCFM 9、CCFM5、CCFM30與嗜酸乳桿菌CCFM137、CCFM6、CCFM8又存在明顯的種間差異。這個結(jié)果與LiuC等[4]的研究是一致的,該研究指出12株菌株有不同的還原能力,其中L.acidophilusBCRC 14079是B.infantisBCRC 14602還原能力的6倍。

劉洋[14]等對4株乳酸菌的細胞提取物進行了研究,均未發(fā)現(xiàn)具有還原能力,而劉宏宇[19]等研究發(fā)現(xiàn),測定的25株乳酸菌均表現(xiàn)出一定的還原能力,活性范圍在4.3～322.58 μmol/L之間。本研究測定的17株菌株的無細胞提取物還原力范圍在(12.31±0.69)～(134.19±0.45)μmol/L之間,表明本研究采用的乳酸菌菌株有一定的還原能力。

圖3 乳酸菌無細胞提取物的還原能力Fig.3 Reducing power of cell free extracts of lactobacilli

2.4 相關(guān)性分析

3種不同的化學(xué)方法測定結(jié)果表明本研究中的不同乳酸菌無細胞提取物有一定的抗氧化能力,其中CCFM8表現(xiàn)出最強的抗氧化能力,CCFM381抗氧化水平最低。Zhu[17]等研究發(fā)現(xiàn)豆渣和豆腐的水提物通過不同的化學(xué)方法檢測,表現(xiàn)出了不同的抗氧化水平。本研究通過比較3種化學(xué)方法的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)3種體外方法具有顯著的相關(guān)性。這與王妍等[20]的研究結(jié)果是一致的,王妍等用DPPH羥自由基清除率、超氧自由基清除率和還原能力測定了3種漿果花色苷的抗氧化活性,研究發(fā)現(xiàn)3種化學(xué)方法具有顯著相關(guān)性。因此,通過體外測定乳酸菌無細胞提取物的抗氧化活性,可以首選這3種方法,但是考慮到這3種化學(xué)方法的機理不同[21],因此,使用單一的化學(xué)方法來篩選高抗氧化活性的乳酸菌菌株有一定局限性。

2.5 SOD,POD,GSH-PX活性

研究表明SOD,CAT和GSH-Px是機體抵御氧化損傷的第一道屏障[21]?；?種化學(xué)方法綜合評價CCFM8的抗氧化活性最強,CCFM381的抗氧化能力最弱。本研究進一步比較這2株菌株無細胞提取物的抗氧化物酶SOD,CAT和GSH-Px水平。由表3可見,2株菌株均含有SOD、CAT和GSH-Px活性,2株菌株的SOD活性高于GSH-PX活性,2株菌株的CAT活性最低,且CCFM8的3個指標(biāo)均高于CCFM381的3個指標(biāo),該結(jié)果與之前3種化學(xué)方法得到的抗氧化能力綜合評價具有較好的相關(guān)性。

表3 2株菌株的抗氧化酶活性

注:圖中a,b表示不同編號菌株具有顯著性差異(p<0.05),含有相同字母表示沒有顯著差異(p>0.05),顯著性分析是同行之間比較。

3 結(jié)論

乳酸菌抗氧化活性一直是乳酸菌研究的熱點,以往的研究更多關(guān)注某一類或者幾株菌株的抗氧化活性[16,22],而本研究中使用了來自于7個種屬(L.rhamnosus,L.acidophilus,L.casei,L.fermenti,L.reuteri,L.farciminis,L.plantarum)的17株乳酸菌,通過3種化學(xué)方法系統(tǒng)的評價了乳酸菌無細胞提取物的抗氧化活性,并且分析了3種體外化學(xué)方法的相關(guān)性。結(jié)果顯示,17株乳酸菌無細胞提取物均具有抗氧化活性,CCFM8表現(xiàn)出最強的抗氧化活性,CCFM381的抗氧化活性最低。進一步檢測了以上2株菌株無細胞提取物的抗氧化物酶SOD、GSH-PX和CAT的活性。與3種化學(xué)方法綜合評價的結(jié)果一致,CCFM8的3種抗氧化物酶活性顯著高于CCFM381的抗氧化物酶活性。本研究結(jié)果表明,DPPH清除率、羥自由基清除率以及還原力這3種化學(xué)測定方法所得結(jié)果之間具備較高的相關(guān)性。但是鑒于不同化學(xué)測定方法的原理有所不同,為了能夠更客觀更全面的分析乳酸菌的抗氧化活性,在通過化學(xué)方法篩選高抗氧化活性的乳酸菌方面,還需要以多種化學(xué)測定方法進行綜合評價。

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A comparison of severalinvitroevaluation methods of lactobacillus cell-free extract antioxidant activity

GU Pin-pin1,XING Jia-li1,WANG Gang1，*,ZHANG Qiu-xiang1,YIN Bo-xing3,FANG Dong-sheng3,ZHANG Hao1,CHEN Wei1,2，*

(1.School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;3.Kangyuan Dairy Co.,Ltd.,Yangzhou University,Yangzhou 225004,China)

The antioxidant activity of lactic acid bacteria and their role in promoting human health are closely related. In this study,3 classic chemical antioxidant capacity evaluation indicatorsinvitrosuch as DPPH radical scavenging activity,hydroxyl radical scavenging activity and reduction activity were engaged to evaluate the antioxidant capacity of cell-free extract of 17 lactic acid bacteria from different sources. The results showed the presence of interspecific and intraspecific differences among the cell-free extract antioxidant activity of lactic acid bacteria from different sources. Significant correlation was found among the results got with 3 chemical evaluation indicators. All 3 chemical evaluation showedLactobacillusacidophilusCCFM 8 had the highest antioxidant activity,whileL.fermentumCCFM381 had the weakest antioxidant activity. Further evaluation results of antioxidase activity of lactobacillus cell-free extract showed perfect consistency with that got with comprehensive evaluation of 3 chemical evaluation indicators. This study provided a reliable reference for comprehensive evaluation of the anti-oxidation ability of lactic acid bacteria andinvitroscreening of lactic acid bacteria with high antioxidant activity.

lactobacilli;antioxidant;free radical;antioxidase

2015-03-23

顧品品(1994-)，女，本科，研究方向：食品科學(xué)，E-mail:583695062@qq.com。

*通訊作者:王剛(1980-)，男，博士，副教授，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail:wanggang@jiangnan.edu.cn。 陳衛(wèi)(1966-)，男，博士，教授，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail:chenwei66@jiangnan.edu.cn。

國家自然科學(xué)基金-青年科學(xué)基金項目(31301407)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)23-0084-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.009