米糠蛋白ACE抑制肽在大鼠體內(nèi)降壓效果的研究

翟愛華，袁文帥

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江大慶 163319)

米糠蛋白ACE抑制肽在大鼠體內(nèi)降壓效果的研究

翟愛華，袁文帥

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江大慶 163319)

采用灌胃和靜脈注射的方法,觀察了米糠蛋白ACE抑制肽對應(yīng)激性高血壓(SHR)大鼠的降壓效果,并與卡托普利的降壓效果進行了比較。分別以50、100、150 mg/kg·bw 劑量的米糠蛋白ACE抑制肽一次性給藥后,每2 h測量大鼠血壓,連續(xù)測量8 h;實驗持續(xù)4周,每天灌胃一次,每周測量血壓及體重一次。SHR大鼠給予米糠蛋白ACE抑制肽后,血壓均顯著下降(p<0.05),并均在灌胃后2 h 達到最低值,血壓下降最大幅度為(31±6.8)mmHg;而正常大鼠灌胃米糠蛋白ACE抑制肽后血壓無顯著變化,灌胃卡托普利則會明顯降低其血壓;長期灌胃米糠蛋白ACE抑制肽可使SHR大鼠血壓下降明顯(p<0.05),且降壓效果穩(wěn)定。

米糠蛋白ACE抑制肽,SHR大鼠,降血壓

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Angioensin-I Converting Enzyme,簡稱ACE)抑制肽,又被稱為降血壓肽(ACEIP),是一種能夠抑制ACE活性的分子量偏小的多肽類物質(zhì)[1],降壓效果明顯而穩(wěn)定,且只對高血壓患者有降壓功效,對血壓正常的機體沒有影響,安全性高且無毒副作用[2-3]。

食源性ACE抑制肽由于其天然安全、降壓效果顯著等優(yōu)點,受到人們越來越多的關(guān)注。有研究證明人們分別從不同來源的原料中制備出了高效的ACE抑制肽[4-6],對植物蛋白源的研究則有大豆、玉米、花生等[7-11]。由于天然存在的ACE抑制肽的來源有限,化學(xué)合成的ACE抑制肽又有副作用,近年來對ACE抑制肽的研究大多集中在制備方法及分離純化上[12-13]。米糠是一種具有極大開發(fā)潛力的資源,研究人員發(fā)現(xiàn)米糠蛋白水解產(chǎn)物中具有較強的ACE 抑制活性肽成分[14],國內(nèi)還沒有對于米糠蛋白肽在體內(nèi)降血壓效果的研究。

ACE抑制肽口服后會被體內(nèi)各種酶類分解降低其降血壓活性[15]。米糠蛋白ACE抑制肽能否可以不被胃腸中的酶分解進入體內(nèi)達到降血壓效果,本實驗通過應(yīng)激性高血壓大鼠(SHR)的一次性給藥和長期給藥觀察,并與降壓藥物卡托普利的效果比較,從體內(nèi)實驗角度研究米糠蛋白ACE抑制肽的降血壓效果,為其開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously Hypertensive Rats,SHR) 雄性,8～10周齡,體重200～240 g,上海高血壓研究所;普通(Sprague-Dawley,SD)雄性大鼠,同周齡,由哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心提供;米糠蛋白ACE抑制肽為實驗室自制;卡托普利(Captopril)12.5 mg/片,自上?；氏箬F力藍天制藥有限公司購買。

BP-6型動物無創(chuàng)血壓測試系統(tǒng) 成都泰盟科技有限公司;ALPHA1-2LD plus冷凍干燥機 德國Christ公司;AR2140電子分析天平 梅特勒托多利儀器有限公司;TGL16B型臺式離心機 上海安亭科學(xué)儀器制造廠;JJ-1電動攪拌器 常州國華電器有限公司;C型超聲波藥品處理機 濟寧市金百特電子有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 米糠蛋白ACE抑制肽的制備 米糠蛋白采用堿性蛋白酶Alcalase在溫度45 ℃,加酶量3000 U·g-1,酶解pH8.5,米糠蛋白底物濃度3%酶解2 h后得到最大為71.1%的ACE抑制率的水解液[16],經(jīng)模擬移動硬床色譜分離純化,將純化后的ACE抑制肽經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和冷凍干燥處理,得到淡黃色粉末狀米糠蛋白肽進行ACE抑制活性檢測。

1.2.2 ACE抑制肽的活性測定 參照黎觀紅[17]體外檢測方法經(jīng)適當(dāng)調(diào)整方法如下:將ACE(血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑)底物HHL(馬尿酰-組胺酰-亮氨酸)溶于0.1 mol/L的含0.3 mol/L NaCl的硼酸鹽緩沖液中(pH8.3),配成5 mmol/L的濃度。精確量取5 mol/L HHL溶液80 μL,并且與40 μL ACE抑制劑進行混合,保持37 ℃溫度不變,置于水浴鍋中5 min。之后用移液槍加入10 μL 0.1 U/mL ACE溶液,37 ℃反應(yīng)30 min。加入200 μL 1 mol/L HCl溶液終止反應(yīng)。再加入1.2 mL乙酸乙酯均勻混合15 s,以萃取反應(yīng)體系中的馬尿酸。離心(1000×g)10 min后取出0.9 mL酯層溶液轉(zhuǎn)入另一試管中,80 ℃烘干,并重新溶于3 mL去離子水中,用紫外分光光度計228 nm處的波長的吸光度值,計算出ACE抑制的程度。計算公式如按公式1所示計算:

式(1)

注:Aa:水解液組的吸光度;Ab:對照組吸光度;Ac:空白組吸光度。

1.2.3 大鼠飼養(yǎng)條件 自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)隨機分籠飼養(yǎng),每籠6只,環(huán)境溫度(22±1)℃,相對濕度55%±5%,標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng),自由進食和飲水,自然光照。大鼠適應(yīng)環(huán)境7d后開始實驗[18]。

1.2.4 灌胃給藥實驗SHR大鼠30只在實驗室適應(yīng)一周后,根據(jù)所測基礎(chǔ)血壓和體重的大小,按隨機分組設(shè)計分為5組,每組6只:SHR大鼠空白對照組,灌胃同等劑量生理鹽水;低劑量組,灌胃劑量按50mg/kg·bw肽計算;中劑量組,灌胃劑量按100mg/kg·bw肽計算;高劑量組,灌胃劑量按150mg/kg·bw肽計算;藥物對照組,灌胃劑量按5mg/kg·bw加入卡托普利。

給藥分為2種:一次性給藥實驗,測定大鼠在給藥前及給藥后2、4、6、8h的血壓值,每只大鼠每次測定3次取平均值;長期給藥實驗,連續(xù)28d每天定時給藥一次,每7d測量血壓和體重一次。

普通SD大鼠12只,實驗室適應(yīng)一周后,根據(jù)所測基礎(chǔ)血壓和體重的大小,按隨機分組設(shè)計分為2組每組6只:(SD)正常血壓大鼠對照組,灌胃劑量按150mg/kg·bw肽計算;(SD)正常大鼠藥物對照組,灌胃劑量按5mg/kg·bw加入卡托普利。也按一次性給藥實驗,與SHR大鼠的空白對照組和高劑量組進行對比。

1.2.5 靜脈注射給藥實驗SHR大鼠30只在實驗室適應(yīng)一周后,根據(jù)所測基礎(chǔ)血壓和體重的大小,按隨機分組設(shè)計分為5組,每組6只:SHR大鼠空白對照組,灌胃同等劑量生理鹽水;低劑量組,灌胃劑量按20mg/kg·bw肽計算;中劑量組,灌胃劑量按40mg/kg·bw肽計算;高劑量組,灌胃劑量按60mg/kg·bw肽計算;藥物對照組,灌胃劑量按2mg/kg·bw加入卡托普利。

靜脈注射實驗按照一次性給藥測定注射前及注射后2、4、6、8、10h的大鼠血壓,每只大鼠每次測定三次取平均值。

1.2.6 實驗動物血壓測定 將待測大鼠裝入鼠籠,按實驗的待測順序放入BP-6動物無創(chuàng)血壓測試儀的保溫箱中,在36 ℃下將大鼠預(yù)熱10min,待電腦顯示器上出現(xiàn)待測大鼠的脈搏波形圖后,加壓,保氣10s后放氣[19],記錄波形圖中收縮壓值。如此反復(fù)3次,取其平均值。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 采用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,實驗數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,實驗用單因素方差分析進行比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 米糠蛋白ACE抑制肽的抑制率

經(jīng)模擬移動硬床色譜純化后的米糠蛋白水解液測定其ACE抑制率,經(jīng)計算得制備的米糠蛋白ACE抑制肽的抑制率為83.1%。

2.2 一次性灌胃米糠蛋白ACE抑制肽對SHR大鼠血壓的影響

一次性灌胃米糠蛋白ACE抑制肽,觀察其對SHR大鼠血壓的影響,多次測量取平均值以繪制折線圖,結(jié)果如圖1所示。

表1 連續(xù)灌胃米糠蛋白ACE抑制肽對SHR大鼠血壓的影響(n=6,x±s)

圖1 一次性灌胃實驗對SHR大鼠血壓的影響(n=6)Fig.1 Variation trends of SHR blood pressure value with a single administration(n=6)

注:與空白對照組比較*表示p<0.05,**表示p<0.01。

給藥前各實驗組SHR大鼠的血壓均在195 mmHg以上。給藥后除空白對照組外,其他實驗組SHR大鼠的血壓值均開始下降,給藥2 h后各實驗組血壓值下降最顯著(p<0.05),之后血壓值開始緩慢回升,8 h后血壓值基本恢復(fù)到灌胃前的水平,卡托普利組與高劑量組均能最大限度的降低SHR大鼠的血壓值,其中高劑量組下降幅度達到(31±6.8)mmHg,這表明150 mg/kg·bw劑量的米糠蛋白ACE抑制肽的降血壓活性可能與5 mg/kg·bw劑量的卡托普利接近。但是卡托普利組血壓回升的較慢,給藥后8 h時高劑量組SHR大鼠基本與灌胃前血壓值持平。從給藥時間看,給藥后2～4 h出現(xiàn)血壓最低值(p<0.05),之后各組SHR大鼠的血壓開始緩慢回升,降壓效果可以維持6 h左右,給藥后8 h各組SHR大鼠血壓值與空白對照組相差無幾。實驗結(jié)果表明,米糠蛋白ACE抑制肽對SHR大鼠的降血壓效果有一定的持續(xù)性,說明米糠蛋白ACE抑制肽具有良好的短期降壓功能,同時給藥劑量越大,降壓效果越明顯。

2.3 一次性灌胃米糠蛋白ACE抑制肽對正常SD大鼠血壓的影響

對正常血壓的SD大鼠進行高劑量的灌胃處理,每隔2 h測定其血壓值,與灌胃SHR大鼠的陰性對照組、高劑量組、卡托普利組進行比較,實驗結(jié)果如圖2所示。

圖2 一次性灌胃對正常SD大鼠血壓的影響(n=6)Fig.2 Variation trends of SD blood pressure value with a single administration(n=6)

正常SD大鼠的一般在110 mmHg沒有SHR大鼠的血壓值高,可以看出正常SD大鼠組與SHR大鼠的空白對照組類似,從給藥前到給藥后8 h血壓值均變化不顯著,而相同劑量的SHR大鼠的血壓出現(xiàn)顯著性降低(p<0.05)。實驗結(jié)果表明,米糠蛋白ACE抑制肽對正常大鼠血壓沒有抑制作用,有研究表明,卡托普利對正常大鼠血壓和SHR大鼠的血壓都降低[20],說明米糠蛋白ACE抑制肽降壓更安全。

2.4 連續(xù)性灌胃米糠蛋白ACE抑制肽對SHR大鼠血壓的影響

對SHR大鼠進行連續(xù)灌胃實驗,結(jié)果如表1所示。

從表1中可知,在給藥期間,空白對照組中SHR大鼠的血壓值一直在190 mmHg以上,差異沒有顯著性(p>0.05)。與未給藥時比較,灌胃給藥后的低劑量組、中劑量組和高劑量組SHR大鼠的血壓值均隨著服用時間的增加有明顯下降,且隨著給藥時間增加SHR大鼠血壓下降的速度減慢并逐漸趨于穩(wěn)定。低劑量組和中劑量組SHR大鼠的血壓從第三周第四周開始才有差異顯著性(p<0.05),但中劑量組在第四周有更大的差異性(p<0.01)。高劑量組比卡托普利組降壓效果較差,但血壓下降平緩。同時也可以看出隨著給藥劑量的增高,SHR大鼠的血壓下降值也隨之增大。該結(jié)果表明,長期服用米糠蛋白ACE抑制肽可以較好且穩(wěn)定地降低血壓,不會因降壓不穩(wěn)定造成對機體的損傷。

2.5 靜脈注射米糠蛋白ACE抑制肽對SHR大鼠血壓的影響

靜脈注射不同劑量的米糠蛋白ACE抑制肽,分別在注射前及注射后2、4、6、8 h測定SHR大鼠的血壓值。結(jié)果如圖3。

從圖3可以看出,靜脈注射后,各組SHR大鼠的血壓值均明顯下降,注射兩小時后各組均降到最低值,而后開始緩慢回升,降壓效果可以維持4～6 h,除卡托普利組外各劑量組血壓值均恢復(fù)到給藥前的水平,由此可見,卡托普利組的降壓效果更持久。SHR大鼠的血壓值隨著注射劑量加大下降幅度增大,其中高劑量組血壓值在注射2 h后低于卡托普利組,但回升較快,沒有卡托普利組的效果持久。

表2 灌胃給藥4周后米糠蛋白ACE抑制肽對SHR大鼠體重的影響(n=6,x±s)

圖3 靜脈注射實驗對SHR大鼠血壓的影響(n=6)Fig.3 Variation trends of SHR blood pressure value with intravenous injection(n=6)

將圖1與圖2 比較可以看出,一次性灌胃米糠蛋白ACE抑制肽與靜脈注射對SHR大鼠的降壓效果相似,都隨著給藥劑量的增加而降壓效果更好,同時,高劑量組的短期降壓效果與卡托普利相當(dāng),但藥效沒有卡托普利持久。但是靜脈注射實驗的劑量是一次性灌胃實驗劑量的0.4倍,由此可見,靜脈注射的降壓效果遠遠好于灌胃[19],這可能是因為胃和腸道中存在某些蛋白酶將米糠蛋白ACE抑制肽中的降壓組分分解成沒有活性的組分,從而影響降壓效果。靜脈注射是直接進入機體的血液循環(huán)能夠更快速的達到降壓目的而不需要經(jīng)過胃液和腸道,可以更有效的降低SHR大鼠的血壓。

2.6 長期灌胃米糠蛋白ACE抑制肽對SHR大鼠體重的影響

連續(xù)灌胃給藥4周后,各組SHR大鼠體重變化情況如表2。與給藥前體重比較,空白對照組體重增加了29.8 g,隨著藥物劑量的增加,SHR大鼠體重增加幅度加大,說明米糠蛋白ACE抑制肽不僅具有降血壓的效果,還有促進機體生長的作用。

3 結(jié)論

本實驗對SHR大鼠進行不同劑量的一次灌胃、連續(xù)灌胃及靜脈注射,分析及討論了米糠蛋白ACE抑制肽對SHR大鼠降血壓效果的影響,證明了與卡托普利相比,米糠蛋白ACE抑制肽在降壓效果和持續(xù)時間上略有不足,且使用劑量要高于卡托普利。靜脈注射的降壓效果要好于灌胃,可能由于腸道或胃液中的酶類對米糠蛋白ACE抑制肽有一定的分解作用。米糠蛋白ACE抑制肽在機體內(nèi)具有良好的降壓效果,但對正常的SD大鼠沒有影響,有促進生長、適合長期服用等優(yōu)點。米糠蛋白ACE抑制肽組分簡單、制備工藝安全,以稻米加工副產(chǎn)物為原料,原料純天然且成本低廉,因此,米糠蛋白ACE抑制肽作為具有降血壓功能的活性肽具有良好的開發(fā)價值。

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Study on antihypertensive effect of the rice bran protein ACE inhibitory peptides on rats

ZHAI Ai-hua,YUAN Wen-shuai

(School of Food Science & Technology,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing 163319,China)

Through adopting the method of gavage and intravenous injection,the antihypertensive effect of rice bran protein ACE inhibitory peptides on the stress-induced hypertension(SHR)rats was observed and then compared with the captopril. Rice bran protein ACE inhibitory peptide one-time dosing of respectively 50,100,150 mg/kg·bw was conducted,with blood pressure measuring for the rats every 2 hours which continuously 8 hours. The experiment lasted four weeks with gavage once daily and weekly measurement of blood pressure and weight once. After the SHR rats were given rice bran protein ACE inhibitory peptides,the blood pressure was decreased significantly(p<0.05),and reached the lowest value in two-hours’ gavage,which was reduced by(31±6.8)mmHg. While the normal rats did not change significantly after it,but captopril can significantly reduce their blood pressure. Long-term gavage of rice bran protein ACE inhibitory peptides can significantly decrease SHR blood pressure(p<0.05)and had a stable antihypertensive effect.

rice bran protein ACE inhibitory peptides;SHR rats;antihypertensive effect

2015-01-15

翟愛華(1971-),女,博士，教授,主要從事糧油精深加工的研究,E-mail:zhaiaihua@sina.com。

高端配方米加工及副產(chǎn)物綜合精深加工技術(shù)產(chǎn)業(yè)化示范(HNK11KF-01)。

TS201.4

A

1002-0306(2015)23-0348-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.064