響應(yīng)面法優(yōu)化馬奶酒對沙門氏菌抑菌效果發(fā)酵條件的研究

韓 磊,殷文政,岳智慧

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

響應(yīng)面法優(yōu)化馬奶酒對沙門氏菌抑菌效果發(fā)酵條件的研究

韓 磊,殷文政*,岳智慧

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

實驗中以新鮮馬奶作為原料,通過單因素實驗探討了發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、乳酸菌和酵母菌接種量及接種比例等發(fā)酵條件對馬奶酒抑菌效果的影響,并進一步通過響應(yīng)面分析對馬奶酒抑菌效果的最佳發(fā)酵條件進行優(yōu)化。結(jié)果表明,馬奶酒最佳抑菌效果出現(xiàn)在發(fā)酵溫度33 ℃、發(fā)酵時間89 h、接種比例為5.6%∶2.4%。在此條件下,馬奶酒抑菌圈直徑理論值為17.794 mm,實驗驗證值17.70 mm,相對誤差為0.53%,說明響應(yīng)面優(yōu)化后得到的馬奶酒抑菌效果真實可靠。

馬奶酒,抑菌效果,響應(yīng)面分析,發(fā)酵條件

馬奶酒是蒙古族飲食文化中的重要部分,時至今日各地都保留著馬奶酒的制作工藝。馬奶具有非常高的營養(yǎng)價值和研究價值,并且含有人體不可或缺的氨基酸和脂肪酸[1]。馬乳非常接近人乳,馬乳蛋白易于消化,馬乳作為消化不良的嬰幼兒及成人的乳用品,可以起到良好的營養(yǎng)和保健作用[2-3]。沙門氏菌是一類寄生于人類和動物腸道內(nèi)的一種革蘭氏陰性桿菌,一些沙門氏菌如鼠傷寒沙門氏菌、腸沙門氏菌腸亞種是引起人類食物中毒主要病原菌。在中國,由沙門氏菌引起的病原微生物爆發(fā)事件位居第二,僅次于副溶血性弧菌[4]。成熟的馬奶酒對鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、單核增生李斯特菌有明顯的抑制作用[5],而且馬奶酒中所產(chǎn)的抑菌物質(zhì)多種多樣,其中主要以酸類、醇類和細菌素為主,尤其可以抑制一些病原菌和腐敗菌[6-7]。在內(nèi)蒙古自治區(qū)呼倫貝爾、錫林郭勒盟蒙醫(yī)醫(yī)院都可以見到將酸馬奶酒作為輔助治療飲料治療呼吸系統(tǒng)、胃腸道疾病的現(xiàn)象。

目前,有很多關(guān)于利用響應(yīng)面法優(yōu)化乳酒和果酒發(fā)酵條件的研究[8-11],其中采用響應(yīng)面法優(yōu)化馬奶酒抑菌效果和馬奶酒抑制腸沙門氏菌的研究較少。因為酸馬奶酒本身具有一定的營養(yǎng)及醫(yī)療價值,為了充分開發(fā)利用內(nèi)蒙古馬奶產(chǎn)業(yè),本實驗以分離于蒙古國酸馬奶中的乳酸菌和酵母菌為發(fā)酵菌種,以腸沙門氏菌腸亞種為指示菌,以鮮馬奶為原料,結(jié)合單因素實驗和響應(yīng)面分析軟件確定馬奶酒抑制腸沙門氏菌的最佳發(fā)酵條件,為內(nèi)蒙古馬奶酒研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮馬奶 錫林郭勒地區(qū):乳酸菌、酵母菌 分離于蒙古國地區(qū)酸馬奶:指示菌 腸沙門氏菌腸亞種1.1859(Salmonellaentericasubsp.enterica)購于中國科學(xué)院普通微生物菌種保藏管理中心。

MRS培養(yǎng)基(g/L) 葡萄糖20、蛋白胨10、牛肉膏10、酵母膏5、檸檬酸二胺2、磷酸氫二鉀2、乙酸鈉5、硫酸鎂0.58、硫酸錳0.25、吐溫-80 1 mL和蒸餾水 1000 mL;酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(g/L) 酵母膏10、蛋白胨20、葡萄糖20、蒸餾水1000 mL;營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(g/L) 牛肉膏3、蛋白胨10、氯化鈉5、瓊脂15、蒸餾水1000 mL。

HFsafe-900手動型生物安全柜 上海力新儀器有限公司:梅特勒PB-10 pH計 梅特勒托利多公司:KDC-140HR高速冷凍離心機 河南兄弟儀器設(shè)備有限公司:BCN-1360B生物潔凈工作臺 蘇凈安泰技術(shù)有限公司:KG-SX-500高壓蒸汽滅菌器 日本Tomy Digital Biology公司:HZQ-X100振蕩培養(yǎng)箱 華城敏科實驗儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 分析測定方法 酸度測定:酸堿滴定法進行測定(以乳酸計);糖含量測定:參考GB/T 23546-2009S《奶酒》進行測定;酒精度測定:使用酒精計進行測定[12];抑菌效果測定:牛津杯打孔平板法進行測定。

1.2.2 酸馬奶加工工藝流程 新鮮馬奶→4層紗布過濾→殺菌(90～95 ℃,保持45 s)→冷卻→接種乳酸菌和酵母菌→發(fā)酵(120 r/min恒溫培養(yǎng))→裝罐→成品

1.2.3 操作要點 鮮馬奶原料需新鮮采集,且無腐敗氣味,無任何添加劑,新鮮的馬奶需要通過過濾處理,將其中的一些雜質(zhì)去除,加熱殺菌后冷卻至常溫。指示菌經(jīng)過活化之后接種于指示菌培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)24 h,6500 r/min離心收集菌體配制成待測菌液,測定活菌數(shù),以生長量在107cfu/mL的培養(yǎng)液為指示菌懸液。

采用牛津杯打孔法測定抑菌效果。取已經(jīng)融化的瓊脂水培養(yǎng)基10 mL倒入無菌平皿中,等待瓊脂凝固后用滅菌鑷子將8 mm牛津杯均勻放置到培養(yǎng)皿中,取指示菌菌液100 μL加入25 mL已融化的指示菌培養(yǎng)基中,充分震蕩,等到培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基凝固后用鑷子去除牛津杯,在孔徑中加入200 μL已經(jīng)發(fā)酵好的酸馬奶,用游標卡尺準確測量抑菌圈直徑(mm)[13]。

種子發(fā)酵液:將待測乳酸菌和酵母菌活化三代接種于培養(yǎng)基中,在適宜溫度下培養(yǎng)24 h放入4 ℃冰箱待用[14]。母發(fā)酵液:滅菌處理后的鮮馬奶按總接種體積5%接種乳酸菌和酵母菌發(fā)酵液,搖勻分別在38 ℃和30 ℃培養(yǎng)24 h和48 h。

1.2.4 發(fā)酵條件優(yōu)化

1.2.4.1 單因素實驗 以接種量4%∶4%[10](乳酸菌/酵母菌),發(fā)酵時間96 h篩選發(fā)酵溫度,發(fā)酵溫度分別為18、22、26、30、34、38、42 ℃。以接種量4%∶4%(乳酸菌/酵母菌),發(fā)酵溫度34 ℃篩選發(fā)酵時間,選取的發(fā)酵時間分別為48、60、72、84、96、108、120 h。以發(fā)酵溫度34 ℃,發(fā)酵時間84 h篩選接種量(乳酸菌/酵母菌),接種量分別為7%∶1%、6%∶2%、5%∶3%、4%∶4%、3%∶5%、2%∶6%、1%∶7%。通過測定抑菌活性、鮮馬奶總酸度和總酒精度等指標對馬奶酒進行考察。

1.2.4.2 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計實驗 結(jié)合單因素實驗結(jié)果,根據(jù)Box-Behnken中實驗設(shè)計,選擇影響抑菌效果(Y)的3個因素:發(fā)酵溫度(A)、發(fā)酵時間(B)、接種量(乳酸菌/酵母菌)(C)為自變量,利用Design-Expert軟件對數(shù)據(jù)進行分析,根據(jù)其中的Box-Behnken實驗組合設(shè)計進行3因素3水平實驗。

表1 響應(yīng)面實驗的因素和水平編碼值

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 不同發(fā)酵溫度對發(fā)酵的影響 發(fā)酵溫度是影響抑菌物質(zhì)產(chǎn)生重要因素,在適宜的溫度條件下,乳酸菌和酵母菌具有相互促進代謝產(chǎn)物生成的作用。乳酸菌主要進行蘋果酸-乳酸發(fā)酵,酵母菌主要進行酒精發(fā)酵,當(dāng)溫度達到酵母菌適宜生長溫度時,酵母菌通過利用乳酸鹽進一步促進乳酸菌的生長和代謝[15]。所以在適宜的溫度下,由于乳酸菌和酵母菌的活躍以及代謝產(chǎn)物的積累,馬奶酒的抑菌效果會達到最佳。由表2可知,發(fā)酵溫度由30 ℃上升至42 ℃時,溫度逐漸達到乳酸菌最適生長溫度,乳酸菌進行乳酸發(fā)酵,馬奶酒的酸度顯著升高(p<0.05)。當(dāng)發(fā)酵溫度在34 ℃時,馬奶酒的抑菌效果達到17.36 mm,酒精度達到0.7%vol。當(dāng)溫度在38 ℃時抑菌效果和酒精度反而下降,說明過高的溫度對馬奶酒抑菌效果和酒精積累反而不利,因此選擇34 ℃為最佳發(fā)酵溫度。

表2 不同發(fā)酵溫度對發(fā)酵的影響

2.1.2 不同發(fā)酵時間對酸馬奶抑菌效果的影響 隨著培養(yǎng)時間的延長,乳酸菌和酵母菌充分生長并且抑菌效果開始上升,同時酒精度和酸度也逐步上升,酒精和酸類物質(zhì)對抑菌效果有一定的促進作用[16]。由表3可知,當(dāng)培養(yǎng)時間由48 h增加到84 h時由于乳酸菌和酵母菌同步生長,抑菌效果和酒精度同時上升,84 h時抑菌圈直徑和酒精度達到最大值,在84～96 h處抑菌效果達到最佳,酸度趨于平穩(wěn)并保持在70 °T。在96 h之后酒精度積累量開始下降而酸度開始逐步上升,抑菌效果開始下降。這是由于發(fā)酵后期乳酸菌和酵母菌活性下降,導(dǎo)致乳酸菌和酵母菌代謝產(chǎn)物積累量的下降。因此選擇抑菌圈和酒精度最大的84 h為最佳發(fā)酵時間。

表3 不同發(fā)酵時間對發(fā)酵的影響

2.1.3 不同接種量對發(fā)酵的影響 乳酸菌接種量是影響馬奶發(fā)酵產(chǎn)抑菌物質(zhì)的關(guān)鍵因素,也是影響馬奶酸度的主要因素[15],適量的酵母菌可以與乳酸菌產(chǎn)生共生作用。在發(fā)酵初期乳酸菌接種量較高時,乳酸菌迅速生長并積累代謝產(chǎn)物,當(dāng)酸度上升至一定水平時,乳酸菌的生長受到影響,這時酸度趨于平穩(wěn)[17]。所以在乳酸菌高接種量7%∶1%和6%∶2%時酸度沒有表現(xiàn)過高。由表4可知,當(dāng)乳酸菌接種量和所占比例較小時,抑菌效果較差的同時酸度較低。隨著乳酸菌接種比例增大,馬奶酒的抑菌效果和酸度開始上升,當(dāng)接種比例在4%∶4%、5%∶3%和6%∶2%時抑菌效果達到最佳。在接種量為4%∶4%時,因為酵母菌接種量較高,營養(yǎng)物質(zhì)部分被用于酒精發(fā)酵,所以其酒精度為1.3%vol,其抑菌效果不如5%∶3%的17.56 mm。當(dāng)乳酸菌接種比例達到6%∶2%時抑菌效果反而呈下降趨勢,說明酵母菌接種比例較少時反而對抑菌物質(zhì)的積累不利,因此選擇接種量較為均衡且抑菌圈直徑最大的5%∶3%為最適接種量。

2.2 酸馬奶酒發(fā)酵響應(yīng)面分析

綜合以上單因素發(fā)酵結(jié)果,選取對抑菌效果影響較大的3個因素(發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、接種量)作為主要因素,以Box-Behnken Design響應(yīng)面分析法對其進行優(yōu)化。表5為響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果,由表5結(jié)果建立以馬奶酒抑菌效果(Y)與發(fā)酵溫度(A)、發(fā)酵時間(B)、接種量(C)的擬合方程。

Y=17.60-0.52A+0.63B+0.022C-0.31AB-0.23AC+0.28BC-1.72A2-0.93B2-0.27C2

表4 不同接種量對發(fā)酵的影響

表5 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

表6 響應(yīng)面結(jié)果及方差分析

注:“*”表示顯著(p<0.05);“**”表示極顯著(p<0.01)。

圖1 發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對抑菌圈直徑影響的響應(yīng)面圖Fig.1 Response surface of fermentation temperature and fermentation time on the zone of inhibition effect

圖2 發(fā)酵溫度和接種量對抑菌圈直徑影響的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface of fermentation temperature and inoculums on the zone of inhibition effect

圖3 發(fā)酵時間和接種量對抑菌圈直徑影響的響應(yīng)面圖Fig.3 Response surface of fermentation time and inoculums on the zone of inhibition effect

2.3 響應(yīng)面圖結(jié)果分析

利用Design-Expert軟件對回歸方程進行計算,做出交互項的三維響應(yīng)面圖及等高線圖,比較各個變量之間的交互作用對響應(yīng)值的影響。由圖1～圖3可知,馬奶酒的抑菌效果隨發(fā)酵時間與發(fā)酵溫度的上升呈先上升后下降的趨勢,發(fā)酵時間與發(fā)酵溫度交互作用顯著[20]。接種量變化對馬奶酒的抑菌效果影響不明顯,其曲線表現(xiàn)較為平滑,隨著發(fā)酵溫度的升高抑菌效果呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,接種量與發(fā)酵溫度的交互作用不顯著。馬奶酒的抑菌效果隨發(fā)酵時間的延長呈先上升后下降的趨勢,接種量與發(fā)酵時間交互作用顯著。

2.4 馬奶酒優(yōu)化條件驗證實驗

對馬奶酒的抑菌效果取最大值,用軟件分析得到酸馬奶的最佳發(fā)酵條件為:發(fā)酵溫度33.16 ℃、發(fā)酵時間89.16 h、接種量(乳酸菌/酵母菌)5.61%∶2.39%,馬奶酒的抑活性達到17.794 mm。為便于實際操作,發(fā)酵溫度取33 ℃、發(fā)酵時間89 h、接種量5.6%∶2.4%。采用上述優(yōu)化條件進行驗證實驗,馬奶酒對腸沙門氏菌腸亞種抑菌效果為17.70 mm,相對誤差為0.53%,說明該數(shù)學(xué)模型建立對酸馬奶酒抑菌效果預(yù)測較為準確。

2.5 理化指標

馬奶酒酒精度1.4%vol,總酸度110 °T,還原糖(以葡萄糖計)47.2 g/L,總酸(以乳酸計)7.0 g/L,符合國標中規(guī)定的標準[12]。

2.6 發(fā)酵菌及其它微生物指標

乳酸菌:3.2×107cfu/mL,酵母菌:4.5×104cfu/mL,大腸菌群:1個/25 mL,沙門氏菌及金黃色葡萄球菌均未檢出。

3 結(jié)論

通過考察發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、接種量(乳酸菌/酵母菌)等3個因素,以馬奶酒對指示菌的抑菌圈直徑為響應(yīng)面值建立方程組和模型,預(yù)測出發(fā)酵溫度33 ℃,發(fā)酵時間89 h,接種量(乳酸菌/酵母菌)5.6%∶2.4%。在此條件下發(fā)酵出的馬奶酒抑菌圈直徑為17.70 mm,馬奶總酒精度為1.2%vol,說明該數(shù)學(xué)模型對馬奶酒抑菌效果的預(yù)測準確可行,對馬奶酒的研究具有一定的意義。

[1]徐少澤. 馬奶、酸馬奶的食療和醫(yī)用價值[J]. 中國民族醫(yī)藥雜志,2012,2(2):20-22.

[2]Szakaky S. Role of fermented milk products in protection of human health[J]. Tejgazdasag,1999,59(2):15-18.

[3]Gladkova E.Source of health drinks,feeding of mares and preparation of koumiss on farm[J].Konevodstvo I Konnyisport,1992,(1):4-5.

[4]Mao XD,Hu JF,liu XM. Estimation on disease burden of foodbome non-typhoid salmonellosis in China using literature review method[J]. Chinese Journal of Disease Control and Prevention,2011,15(7):622-625.

[5]吳敬,芒來,王英麗，等.馬奶酒中產(chǎn)抑菌物質(zhì)乳桿菌的篩選及鑒定[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2011,32(1):17-22.

[6]李平蘭,張箎,江漢湖.乳酸菌細菌素研究進展[J]. 微生物學(xué)通報,1998,25(5):295-298

[7]許楊,孫紅斌.乳酸菌細菌素作用方式及其活性的影響因素[J].微生物學(xué)通報,1998,26(2):104-107.

[8]武運,楊博文,李靜,等.新疆精河枸杞果酒發(fā)酵工藝的研究[J].中國釀造,2012,31(7):177-182.

[9]馬榮山,黃晶. 營養(yǎng)性牛乳酒發(fā)酵工藝的研究[J].中國釀造,2008,27(19):96-99.

[10]王璐,李小溪,古麗娜孜,等. 響應(yīng)面法優(yōu)化馬奶酒發(fā)酵條件的研究[J].中國釀造,2014,33(2):66-70.

[11]霍丹群,王洪彬,宋興興,等.響應(yīng)面法優(yōu)化獼猴桃原酒發(fā)酵工藝[J].食品工業(yè)科技,2013,34(9):219-223.

[12]內(nèi)蒙古河套酒業(yè)集團股份有限公司,中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院,內(nèi)蒙古自治區(qū)酒業(yè)協(xié)會,等.GB/T 23456-2009 奶酒[S].北京:中國標準出版社,2009.

[13]FABIO C,SIMONE C,Emanuele Armaforte,et al.Antifungal activity of lactobacilli isolated fromsalami[J].FEMS Microbiol Lett,2007,271:245-250.

[14]卓志國. 乳清奶酒發(fā)酵最佳工藝條件的研究[J].食品研究與開發(fā),2012(1):12-14.

[15]閆彬,賀銀鳳.乳酸菌與酵母菌的共生機理綜述[J].食品科學(xué),2012,33(3):277-281.

[16]Presser K A,Datkowsky T Ross. Modlling the growth rate of Escherichia coil as a funct ion of pH and lactic acid concentration[J]. AppL Envir on. Micr obiol,1997,63:2355-2360.

[17]閆彬,賀銀鳳.酸馬奶中乳酸菌與酵母菌的共生發(fā)酵特性[J].食品科學(xué),2012,33(7):131-137.

[18]李靜,徐建華.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取沙棘果渣總黃酮的工藝研究[J].中國釀造,2013,32(7):32-37.

[19]周賓,陳立業(yè),王甜,等. 響應(yīng)面法優(yōu)化乳酸鏈球菌素發(fā)酵培養(yǎng)基成分[J].中國釀造,2012,31(10):103-106.

[20]夏海濤,劉玉芬,苗文軍. 響應(yīng)面法優(yōu)化山麻楂粗多糖提取工藝[J].食品工業(yè)科技,2012,33(20):128-131.

Optimization of fermentation process for Koumiss inhibitory effect on Salmonella by response surface methodology

HAN Lei,YIN Wen-zheng*,YUE Zhi-hui

(College of Food Science and Engineering,Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010018,China)

In this experiment,fresh mare's milk as raw material,the fermentation temperature and time,lactic acid bacteria and yeast inoculation and vaccination proportion were investigated to develop the influence of three factors on Koumiss inhibitory effect by single factor test. The fermentation conditions of Koumiss inhibitory effect were further optimized by the response surface. The results showed that optimal conditions for Koumiss fermentation were as follows;fermentation temperature 33 ℃,fermentation time 89 h,inoculums 5.6%∶2.4%,the predicted zone of inhibition effect was 17.794 mm,and experimental verification was 17.70 mm,the deviation was 0.53%.The optimized of the inhibition effect of Koumiss by response surface analysis methods was accurate and reliable.

Koumiss;inhibitory effect;response surface analysis;fermentation condition

2015-02-23

韓磊(1990-)，男，碩士研究生，研究方向:食品科學(xué),E-mail：hanlei1990714@163.com。

*通訊作者:殷文政(1959-)，男，碩士，教授，研究方向：微生物與食品安全,E-mail：yinwenzheng1959@126.com。

內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金項目(2014MS0359)。

TS201.2

B

1002-0306(2015)23-0214-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.036