富含GABA的納豆咀嚼片生產(chǎn)技術(shù)研究

田 璐,楊潤強,沈 昌,顧振新

(南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院,江蘇南京 210095)

富含GABA的納豆咀嚼片生產(chǎn)技術(shù)研究

田 璐,楊潤強,沈 昌,顧振新*

(南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院,江蘇南京 210095)

本研究在大豆發(fā)芽富集γ-氨基丁酸(GABA)的基礎(chǔ)上,接種納豆芽孢桿菌,37 ℃下發(fā)酵24 h,經(jīng)干燥、粉碎后,制作富含GABA和納豆激酶(NK)的納豆咀嚼片。結(jié)果表明:采用檸檬酸低氧發(fā)芽后再經(jīng)低溫冷凍與回溫處理,發(fā)芽大豆中GABA含量高達1.24 mg/g DW;經(jīng)納豆芽孢桿菌發(fā)酵后大豆中GABA含量升至3.87 mg/g DW,同時NK活力升至每克鮮納豆0.06個TAME單位;以45%的納豆粉為原料制作的咀嚼片中GABA含量達到2.07 mg/片,納豆激酶(NK)活力為0.063 TAME單位/片。通過該生產(chǎn)技術(shù),可生產(chǎn)富含GABA和NK活力的功能性納豆咀嚼片。

納豆,納豆激酶,γ-氨基丁酸,咀嚼片

近年來,隨著人們生活方式的改變、人口老齡化、環(huán)境不斷變化等,高血壓、心腦血管疾病等成為危害人類健康的嚴重疾病之一[1]。血壓水平與心血管病之間存在密切的關(guān)系,國外Framingham心臟研究發(fā)現(xiàn),高血壓會增加冠心病、心血管病的危險[2]。

γ-氨基丁酸(GABA)和納豆激酶(Nattokinase,NK)對人體心血管疾病的預防作用已被越來越多的消費者所認識。GABA是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),具有降低血壓、改善腦機能、抗驚厥、預防和治療癲癇、活化腎肝等作用[3]。隨著年齡的增大,人體自身合成的GABA不足,需要從食物中攝取。正常條件下,植物體內(nèi)GABA含量較低,在0.03～2.00 μmol/g FW之間[4],但受到逆境脅迫時GABA含量迅速增加[5],熱激、缺氧、低溫、鹽脅迫等逆境均可使GABA在植物中積累[6-7]。納豆是一種歷史悠久的傳統(tǒng)大豆發(fā)酵產(chǎn)品,含有蛋白酶、多種維生素、γ-谷氨?；D(zhuǎn)肽酶、α-多聚谷氨酸等多種物質(zhì),具有降血壓、抗腫瘤、抗氧化等功效[8]。NK是納豆芽孢桿菌在納豆中發(fā)酵而產(chǎn)生的,是納豆最主要的功能性物質(zhì),NK能激活血液中的血纖溶酶原,從而溶解血栓,預防和治療心腦血管疾病,具有高效安全、價格低廉、無任何副作用等特點。

富含GABA的產(chǎn)品開發(fā)[9]始于日本,目前已趨于成熟。1987年津志田藤二郎等[10]首次用低氧處理茶葉得到γ-氨基丁酸茶,片桐充昭和清水純夫[11]用CO2處理大豆芽,早川潔等[12]用乳酸菌發(fā)酵飲料,大坪貞視[13]浸泡處理含米胚芽的米糠,這些方法都使得原料中富集了GABA。

表1 納豆咀嚼片評分標準

納豆起源于中國發(fā)展于日本,目前其生產(chǎn)也逐漸工業(yè)化,但是同時富含GABA和NK的產(chǎn)品未見報道,且在納豆口味的改良上具有極大的研究意義。

本研究以富含GABA的大豆為原料[14],接種納豆枯草桿菌(Bacillussubtilis),生產(chǎn)富含GABA的納豆,并制作咀嚼片,旨在為開發(fā)富含GABA的納豆制品提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆(品種:云鶴YH-NJ)產(chǎn)自東北吉林省;納豆芽孢桿菌(Bacillussubtilis)本實驗室保存。

GABA標準品(≥99%)、對二甲氨基苯磺酰氯(≥99%) 均購自Sigma公司;甲基苯磺酰-L-精氨酸甲酯(98%)、變色酸 購自阿拉丁公司;牛血清白蛋白、考馬斯亮藍G-250 均購自索萊寶公司,三氯醋酸、高錳酸鉀、硫酸、亞硫酸鈉、大豆蛋白胨 均購自國藥集團上?；瘜W試劑公司。

表2 市售產(chǎn)品與咀嚼片中GABA含量

表3 市售產(chǎn)品與咀嚼片中NK活力

安捷倫液相色譜儀 Agilent 1200 美國安捷倫公司;UV-2802型紫外可見分光光度計 上海尤尼科儀器有限公司;Orion818型pH測試儀 Orion Research有限公司;PYX-9030A型隔水電熱恒溫發(fā)芽箱 上海躍進醫(yī)療器械廠;多功能活氧機BG-LJ30OA 北理國科臭氧應用技術(shù)有限公司;LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 富含GABA的納豆制作流程 大豆→消毒→30 ℃浸泡6 h→低氧發(fā)芽18 h,通氣量1.0 L/min→-20 ℃低溫脅迫12 h→25 ℃回溫6 h→去皮→121 ℃蒸煮15 min→冷卻→接種納豆芽孢桿菌→37 ℃發(fā)酵24 h→后熟[15]。

1.2.2 不同處理方式對大豆GABA富集的影響 方式一:30 ℃下清水浸泡6 h;方式二:以清水為培養(yǎng)液低氧發(fā)芽18 h,通氣量1.0 L/min;方式三:采用10 mmol/L的檸檬酸緩沖液(pH5)低氧培養(yǎng)18 h,低氧通氣量為1.0 L/min;方式四:-20 ℃下冷凍12 h,25 ℃下回溫6 h。

1.2.3 咀嚼片制作流程 富含GABA的納豆→凍干→打粉→配料(綜合咀嚼片的功能效果和壓片效果,添加45% 納豆凍干粉),輔料(山梨糖醇、木糖醇、乳糖等)、粘合劑(60%乙醇)、香精(草莓、香橙、牛奶香精)→制軟材→制?！！鷫浩善?成品規(guī)格是1.5 g/片)。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 GABA含量 采用HPLC法[16]測定,樣品經(jīng)過前期處理得到用碳酸鈉緩沖液溶解的提取液,用4-二甲氨基偶氮苯磺酰氯丙酮溶液對其衍生,樣品直接用來測定色譜下的吸收峰。

1.3.2 NK活性測定 采用TAME法[17]測定,取成熟納豆0.5 g,粉碎后加滅菌水5 mL,攪拌,靜置過夜,在4000 r/min 離心30 min,收集上清液冷凍保存。取0.1 mL樣品液,用變色酸法測定574 nm的吸光值。NK活力以TAME單位來表示,即每分鐘每克納豆中NK水解1 μmol TAME的量為一個活力單位。

樣品量是指納豆樣品的質(zhì)量(g DW);VT為磨樣體積(mL);VS為測定時的取樣量(mL),每次取樣品浸提液0.1 mL反應;時間是指 NK與TAME底物反應的時間(min);甲醇的量單位為μmol。

1.3.3 感官評價 根據(jù)GB/T 15682-2008方法評定。選定10人進行感官評價的專業(yè)培訓,并采用10人品嘗法對納豆咀嚼片制粒效果(ZL)、壓片效果(YP)、風味(FW)和口感(KG)等方面進行感官評定,評分標準見表1,每項滿分為10分,每一項得分的均值乘以權(quán)重得到綜合評分。評定的咀嚼片有原味、奶香味、香橙味和草莓味四種。

總分=ZL×20%+YP×20%+FW×30%+KG×30%

式1

1.3.4 統(tǒng)計分析 實驗設(shè)3次生物學重復,各指標測定設(shè)3次技術(shù)重復,結(jié)果以平均值±標準偏差表示。實驗數(shù)據(jù)采用SAS9.0軟件(SASInstituteInc.,NC,USA)進行方差分析,在0.05水平上進行顯著檢驗(p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理階段對發(fā)芽大豆中GABA含量的影響

不同的上標字母表示在0.05的水平下有顯著性差異,圖2～圖4、表2、表3同。

由圖1可知,采用檸檬酸低氧發(fā)芽后低溫保存并回溫處理時,發(fā)芽大豆中GABA含量最高,為1.24 mg/g DW,而浸泡處理僅為0.21 mg/g DW。由此可見,檸檬酸低氧發(fā)芽后低溫保存并回溫的處理方式能使大豆中GABA含量提高約6倍。

2.2 納豆生產(chǎn)不同階段大豆中GABA含量變化

蒸煮對GABA含量的影響不顯著,由此可知GABA具有較好的熱穩(wěn)定性,且對高溫有一定的耐受能力。發(fā)酵后GABA的含量是3.87 mg/g DW,為發(fā)芽后的3.9倍,蒸煮后的6.4倍,凍干和打粉對納豆中GABA的含量無顯著影響。咀嚼片中含有45%的納豆粉,納豆咀嚼片中GABA的含量為1.38 mg/g,即咀嚼片中GABA含量為2.07 mg/片,本方法生產(chǎn)的咀嚼片中的GABA含量是市售納豆及NK咀嚼片中GABA含量的4～8倍。

圖1 不同處理階段對發(fā)芽大豆中GABA含量的影響Fig.1 Influence of different treatment period on the GABA content in sprout soybean注:1-方式一;2-方式一和二;3-方式一和三;4-方式一、二和四;5-方式一、三和四。

圖2 納豆咀嚼片不同生產(chǎn)階段GABA含量Fig.2 GABA content in different natto chewable tablet production stages

2.3 發(fā)酵及后熟對納豆中可溶性蛋白含量和NK活力的影響

發(fā)酵后大豆中可溶性蛋白的含量顯著降低,而NK的活力升至每克鮮納豆0.06個TAME單位。由此可知,發(fā)酵過程中納豆菌利用大豆中的蛋白質(zhì)作為氮源,產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物-NK,在此過程中蛋白質(zhì)被水解,形成更利于人體吸收的氨基酸,使納豆的營養(yǎng)價值得到提高。結(jié)果亦顯示,發(fā)酵顯著降低納豆中蛋白質(zhì)含量,但是顯著提高NK活力(圖3),后熟使蛋白質(zhì)含量有所下降,但NK活力無顯著變化。

圖3 發(fā)酵及后熟對納豆中可溶性蛋白含量和NK活力的影響Fig.3 Influence of fermentation and postripeness on soluble protein content and NK activity in natto

2.4 納豆咀嚼片不同生產(chǎn)階段NK活力

圖4 產(chǎn)品不同階段NK活力Fig.4 The NK activity in different production stages of natto chewable tablet

納豆發(fā)酵完成后保存在-20 ℃下,低溫條件下NK比較穩(wěn)定,即使經(jīng)過冷凍干燥和高速粉碎,NK的活力仍無顯著下降。但咀嚼片中NK活力有所降低,原因是在長期保存和制作過程中納豆粉中的NK活性有所降低,導致生產(chǎn)出的咀嚼片NK活力相對減少,但該咀嚼片中NK活力仍有0.042 TAME單位/gDW,每片咀嚼片1.5 g,即每片咀嚼片中酶活為0.063 TAME單位,雖略低于上述市購納豆激酶咀嚼片中NK活力,但仍具有較高的酶活性,具有較強的溶血栓能力。

2.5 不同風味的納豆咀嚼片產(chǎn)品中GABA含量及NK活力

表4 產(chǎn)品感官評定值

注:英文字母a、b表示在0.05水平上有顯著性差異。

四種不同口味的納豆咀嚼片,在GABA含量以及NK活力上都沒有顯著性差異,表明GABA含量和NK活力都只與咀嚼片中納豆粉的含量有關(guān),而與輔料、調(diào)味劑、粘合劑、香精等添加劑的含量無關(guān)(圖5)。

圖5 不同口味的納豆咀嚼片中的GABA含量及NK活力Fig.5 GABA content and the NK activity in different natto chewable tablets

2.6 不同風味的納豆咀嚼片感官評定結(jié)果及分析

納豆凍干粉的含量會直接影響咀嚼片的制粒效果,咀嚼片中凍干粉的含量過多會導致制片松散甚至不能成形。而從納豆咀嚼片的功能來分析,其中含有納豆凍干粉的原料越多效果就越好。綜合兩方面,納豆咀嚼片中以添加45%的納豆凍干粉為宜,其余添加輔料[18],包括山梨糖醇、乳糖、甘露醇、檸檬酸、蔗糖、粉末香精以及每種口味所特有的香味成分。

由實驗結(jié)果可知,四種不同口味的納豆制顆粒效果和壓片效果均無顯著差異,在口感和風味上,奶香味、香橙味、草莓味無顯著差異,但顯著優(yōu)于原味。說明添加奶粉、香橙、草莓添加劑均能有效改善納豆的口味,掩蓋納豆不易被人接受的特殊氣味。

3 討論

NK的酶學性質(zhì)比較穩(wěn)定,反復融凍對其活力影響較小,且NK在40 ℃下保溫30 min活力無變化[19],這就保證了納豆咀嚼片在制片過程中凍干以及在35～45 ℃烘干不會使NK失活。據(jù)報道[20],當NK與煮沸過的小麥或大米提取液混合后,NK的穩(wěn)定性顯著增加,明膠、海藻酸鈉、糊精、甘露醇等在高溫環(huán)境下能起到穩(wěn)定NK的作用[21-22]。本研究中NK附著在蒸煮過的大豆上,添加了糊精和甘露醇作為輔料,確保了NK的活性。

與發(fā)芽富集GABA的大豆相比,納豆中GABA的含量顯著升高,表明GABA在大豆發(fā)酵過程中得到進一步富集,該結(jié)果與渠巖等[23]的報道一致。GABA是由谷氨酸經(jīng)谷氨酸脫羧酶(GAD)催化轉(zhuǎn)化而來的[24],微生物發(fā)酵過程中GAD大量表達,以合成GABA[25]。

蔣立文等[26]測定了幾種不同發(fā)酵制品中GABA的含量,其中陽豆豉中的含量為3.45 mg/g(干基),臘八豆為0.2 mg/g(干基),永川豆豉為0.15 mg/g(干基),都顯著少于本技術(shù)生產(chǎn)的納豆中GABA的含量。日本政府已明確規(guī)定天然原料發(fā)酵產(chǎn)制的GABA產(chǎn)品可作為營養(yǎng)輔助食品,規(guī)定GABA的攝入量通常為每日20～30 mg,分2次食用,最高日攝食量應低于100 mg,是極安全的物質(zhì)[27]。本研究中市購的NK咀嚼片經(jīng)過行業(yè)認證的NK活力為1750 FU,推薦每日服用量為3000～7000 FU,用本研究中的方法測定該市購NK咀嚼片的NK活力,用TAME單位表示,其活力為0.077 TAME單位。而本研究生產(chǎn)的納豆咀嚼片中NK酶活為0.063TAME單位。因此,每日服用本納豆咀嚼片5片即可達到效果。

4 結(jié)論

以富集GABA的大豆為原料,生產(chǎn)納豆并制作咀嚼片完全可行。以45%納豆粉為原料,添加矯味劑、輔料和粘合劑,生產(chǎn)的納豆咀嚼片中GABA含量為2.07 mg/片,納豆激酶(NK)活力為0.063 TAME單位/片,具有很高的營養(yǎng)價值和保健功能。

[1]姚震,陳林. 我國心血管疾病現(xiàn)狀與展望[J]. 海南醫(yī)學,2013,24(13):1873-1876.

[2]Moran A,Gu D,Zhao D,et al. Future cardiovascular disease in China markov model and risk factor scenario projections from the coronary heart disease policy Model-China[J]. Circulation:Cardiovascular Quality and Outcomes,2010,3(3):243-252.

[3]楊勝遠,陸兆新,呂風霞,等.γ-氨基丁酸的生理功能和研究開發(fā)進展[J]. 食品科學,2005,26(9):546-551.

[4]Rhodes D,Handa S,Bressan R A. Metabolic changes associated with adaptation of plant cells to water stress[J]. Plant Physiol,1986,82(4):890-903.

[5]田小磊,吳曉嵐.γ-氨基丁酸在高等植物逆境反應中的作用[J]. 生命科學,2002,14(4):215-219.

[6]Kinnersley A M,Turano F J. Gamma aminobutyric acid(GABA)and plant responses to stress[J]. Critical Reviews in Plant Sciences,2000,19(6):479-509.

[7]Van Der Luit A H,Olivari C,Haley A,et al. Distinct calcium signaling pathways regulate calmodulin gene expression in tobacco[J]. Plant Physiol,1999,121(3):705-714.

[8]江曉,董明盛. 納豆,納豆激酶與人體保健[J]. 中國釀造,2001,(4):1-3.

[9]顧振新,蔣振暉. 食品原料中γ-氨基丁酸(GABA)形成機理及富集技術(shù)[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2002,28(10):65-69.

[10]津志田藤二郎,村井敏信,大森正司,等.[J]. 日本農(nóng)蕓化學會志,1987,61(7):817-822.

[11]片桐充昭,清水純夫.[J]. 日本食品工業(yè)學會志,1989,36(11):916-919.

[12]早川潔,上野義英,河村真也,等.[J]. 生物工學會志:seibutsu-kogaku kaishi,1997,75(4):239-244.

[13]大坪貞視.[J]. 北陸農(nóng)業(yè)的新技術(shù),2000,(13):66-68.

[14]張暉,姚惠源. 富含γ-氨基丁酸保健食品的研究與開發(fā)[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2002,28(9):69-72.

[15]余南靜. 大豆籽粒中γ-氨基丁酸富集技術(shù)及其胚芽豆乳開發(fā)研究[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學,2012.

[16]Nyitrai G.,Kekesi K A,Juhász G. Extracellular level of GABA and Glu:invivomicrodialysis-HPLC measurements[J]. Current topics in medicinal Chemistry,2006,6(10):935-940.

[17]熊迎新,尹宗寧,楊超,等. 納豆激酶活性測定方法的研究[J]. 藥物生物技術(shù),2006,13(2):140-143.

[18]蔣志勤,鄒金華,熊為艷. 納豆咀嚼片的工藝研究[J]. 食品研究與開發(fā),2007,28(4):128-130.

[19]Sumi H,Hamada H,Tsushima H,et al. A novel fibrinolytic enzyme(nattokinase)in the vegetable cheese Natto;a typical and popular soybean food in the Japanese diet[J]. Experientia,1987,43(10):1110-1111.

[20]董明盛,江曉,劉誠,等. 納豆激酶穩(wěn)定性的研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2001,4 004.

[21]Hsieh C W,Lu W C,Hsieh W C,et al. Improvement of the stability of nattokinase usingγ-polyglutamic acid as a coating material for microencapsulation[J]. LWT-Food Science and Technology,2009,42(1):144-149.

[22]Forgaty W,Kelly C. Topics in enzyme and fermentation[J]. Biotechnology Chichester:G Howood-J Wiley & Sons,1979,

[23]渠巖,王夫杰,李平蘭,等.γ-氨基丁酸及其在大豆發(fā)酵食品中的研究進展[J]. 中國釀造,2010,29(3):1-4.

[24]蔣振暉,顧振新. 高等植物體內(nèi)γ-氨基丁酸合成,代謝及其生理作用[J]. 植物生理學通訊,2003,39(3):249-254.

[25]金紅星,田楠,成文玉,等. 微生物發(fā)酵合成γ-氨基丁酸的研究進展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學,2012,40(11):6385-6386.

[26]蔣立文,周傳云,夏菠,等. 幾種發(fā)酵豆制品中γ-氨基丁酸含量的初步測定[J]. 中國釀造,2007,26(4):62-64.

[27]蕭鳳岐. 積極開發(fā) GABA 食品[J]. 中國釀造,2004,23(12):22-24.

Research of production technology of GABA-riched Natto chewable tablet

TIAN Lu,YANG Run-qiang,SHEN Chang,GU Zhen-xin*

(College of Food Science and Technology,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China)

Bacillusnattowas vaccinated to soybean which was rich inγ-aminobutyric acid(GABA)after germination and germinated soybean was fermented at 37 ℃ for 24 h. Natto chewable tablets rich in GABA and nattokinase(NK)activity was produced after being dried and crushed. Results showed that GABA content in germinated soybean reached 1.24 mg/g DW after being soaked in citric acid,along with hypoxia,freezing and thawing treatments. The content of GABA was up to 3.87 mg/g DW and NK activity was up to 0.06 TAME units in per gram fresh natto after being fermented byBacillusnatto. Each pill of natto chewable tablet had 2.07 mg GABA and 0.063 TAME units NK when 45% of natto powder was added. Based on this conditions above in this paper,the Natto chewable tablet which was rich inγ-aminobutyric acid(GABA)and also had high nattokinase(NK)activity could be prepared.

Natto;Nattokinase;γ-aminobutyric acid;chewable tablets

2015-01-28

田璐(1992-)，女，碩士研究生，研究方向為食品功能性物質(zhì)的富集，E-mail：2014108022@njau.edu.cn。

*通訊作者:顧振新(1956-)，男，博士，教授，研究方向：生物技術(shù)與功能食品，E-mail：guzx@njau.edu.cn。

國家自然科學基金青年項目(31071581)；江蘇高校優(yōu)勢學科建設(shè)工程資助項目( PAPD)。

TS218

A

1002-0306(2015)23-0162-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.025