化香蟲茶總黃酮對(duì)CCl4誘導(dǎo)小鼠肝損傷的預(yù)防效果

王 睿,孫 鵬

(重慶第二師范學(xué)院 生物與化學(xué)工程系,重慶 400067)

化香蟲茶總黃酮對(duì)CCl4誘導(dǎo)小鼠肝損傷的預(yù)防效果

王 睿,孫 鵬*

(重慶第二師范學(xué)院 生物與化學(xué)工程系,重慶 400067)

本文對(duì)蟲茶總黃酮的肝損傷預(yù)防效果進(jìn)行了研究。蟲茶黃酮可以使CCl4誘導(dǎo)的肝損傷小鼠血清中的谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)和甘油三酯(TG)含量下降,升高血清中的還原型谷胱甘肽(GSH)含量。同時(shí),蟲茶黃酮還可以使肝損傷小鼠肝臟中的MDA和TG含量下降,GSH含量上升,且100mg/kg濃度蟲茶黃酮的效果更顯著,能夠接近常用的肝病治療藥物水飛薊。對(duì)小鼠血清中細(xì)胞因子的檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)灌胃蟲茶黃酮小鼠的IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-γ水平低于對(duì)照組小鼠,接近正常組和藥物水飛薊組。組織病理切片證明蟲茶黃酮可以減輕CCl4對(duì)肝組織的破壞,保護(hù)肝臟細(xì)胞。蟲茶黃酮灌胃小鼠相對(duì)于對(duì)照組小鼠肝臟組織中的炎癥相關(guān)基因NF-κB被下調(diào),IκB-α被上調(diào)。結(jié)果表明蟲茶黃酮有較好的肝損傷預(yù)防效果。

類黃酮,蟲茶,肝損傷,細(xì)胞因子,表達(dá)

蟲茶是一種制作方法特殊,利用化香夜蛾和化香樹葉生產(chǎn)的茶飲品,主要產(chǎn)于貴州,湖南和四川等省份[1]。由于蟲茶的生產(chǎn)還采用最原始的方法,且產(chǎn)地多集中在少數(shù)民族地區(qū),所以產(chǎn)量有限,其生產(chǎn)難以工業(yè)化。蟲茶的生產(chǎn)方式特殊,將野生的化香樹葉等植物葉片放入竹簍中,在葉片之間淋上淘米水后將竹簍放置在房梁上待化香夜蛾等昆蟲飛入產(chǎn)卵,幼蟲孵化出后以葉片為食,排出的糞粒去除殘?jiān)蟮玫较x糞顆粒,再通過炒制等工藝便生產(chǎn)出蟲茶[2]。蟲茶中含有多種對(duì)人體有益的成分,包括大量的氨基酸,茶黃酮,茶多酚和茶多糖[3]。

肝臟是重要的生理器官,發(fā)生嚴(yán)重?fù)p傷后會(huì)危及生命,其中由化學(xué)性肝毒性物質(zhì)所造成的化學(xué)性肝損傷在肝損傷中是較為常見的,包括酒精、藥物和化學(xué)毒性物質(zhì)都可能造成化學(xué)性肝損傷?；瘜W(xué)性肝損傷易發(fā)生,潛伏期短,且損傷的程度與刺激物劑量有直接關(guān)系,損傷可致肝細(xì)胞壞死、脂肪變形,嚴(yán)重的情況下會(huì)引起肝硬化和肝癌。在實(shí)驗(yàn)室條件下通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)植物黃酮對(duì)包括酒精性肝損傷和四氯化碳引發(fā)肝損傷有良好的抑制效果[4-5]。針對(duì)蟲茶中含有較多的黃酮類化合物,本研究對(duì)貴州少數(shù)民族地區(qū)產(chǎn)蟲茶中的黃酮提取物進(jìn)行了動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn),通過對(duì)CCl4誘導(dǎo)急性肝損傷小鼠的血液和肝臟指標(biāo)的分析對(duì)蟲茶黃酮的肝損傷預(yù)防效果進(jìn)行了研究,這些研究結(jié)果將推動(dòng)蟲茶的進(jìn)一步研究和為蟲茶的推廣提供支持依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蟲茶 貴州產(chǎn)化香蟲茶;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 購(gòu)于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的清潔級(jí)6周齡雄性昆明小鼠(體重(25±5)g,動(dòng)物許可證:SCXK(渝)2012-0001),飼養(yǎng)條件控制在室溫22±4℃,相對(duì)濕度50%±20%。動(dòng)物購(gòu)入后正常飼養(yǎng)7d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

AST、ALT、LDH、MDA和TG試劑盒 南京建成生物工程研究所;IL-6、IL-12,TNF-α和IFN-γ酶聯(lián)免疫試劑盒 美國(guó)Biolegend公司;CycleTESTTM PLUS DNA染色試劑盒 德國(guó)Becton Dickinson公司;Trizol試劑、oligodT18、RNase、dNTP 和MLV 美國(guó)Invitrogen公司;RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))引物iNOS和COX-2 德國(guó)Eppendorf公司;水飛薊素 美國(guó)Sigma公司;CCl4誘導(dǎo)劑(CCl4和橄欖油按1∶1比例混合);其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

R1002VN旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;FD-1E-50冷凍干燥機(jī) 重慶邁克科技公司;UV-2550型紫外分光光度計(jì) 日本島津公司;TG1650-WS高速離心機(jī) 重慶春鑫科技有限公司;BX41顯微鏡 日本奧林巴斯公司;Bio-Rad 680酶標(biāo)儀、Bio-Rad小型水平電泳槽 美國(guó)Bio-Rad公司;ABI 2720 PCR儀 美國(guó)Applied Biosystems公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蟲茶黃酮的提取 蟲茶冷凍干燥后粉碎。采用文獻(xiàn)方法[6],取1kg冷凍干燥的蟲茶粉末,加入10L的70%乙醇溶液,再在70℃水浴下浸提4h,濾液過硅藻土除去脂溶性雜質(zhì),收集提取液再通過ADS-17樹脂使黃酮類物質(zhì)被樹脂吸附,再用90%的乙醇溶液洗脫下樹脂吸附的黃酮物質(zhì),最后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸干溶劑得到黃酮提取物。再取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品,溶入90%的乙醇溶液,制成濃度為10、20、30、40和50μg/mL濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。再將苦丁蟲茶黃酮提取物也溶于90%的乙醇溶液,用分光光度儀在500nm處測(cè)定吸光度,根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對(duì)比,計(jì)算得蟲茶黃酮提取物中黃酮物質(zhì)(蘆丁計(jì))的純度。

1.2.2 將實(shí)驗(yàn)用小鼠分為5組:正常組、對(duì)照組、50mg/kg蟲茶黃酮組、100mg/kg蟲茶黃酮組和水飛薊藥物組,每組10只。在前14d中,正常組和對(duì)照組小鼠每天灌一次胃蒸餾水(0.2mL);50mg/kg蟲茶黃酮組小鼠按濃度50mg/kg(灌胃濃度:小鼠體重每1kg灌胃樣品50mg)灌胃0.2mL的蟲茶黃酮一次;100mg/kg蟲茶黃酮組小鼠按濃度100mg/kg灌胃0.2mL的蟲茶黃酮一次;水飛薊藥物組小鼠按濃度100mg/kg灌胃0.2mL的水飛薊一次。第14d對(duì)所有小鼠實(shí)施灌胃后按0.2mL/kg對(duì)除正常組小鼠外其他小鼠腹腔注射CCl4肝損傷誘導(dǎo)劑,同時(shí)對(duì)所有小鼠禁食,但允許自由飲水,24h后斷頸處死小鼠,取心臟血離心分離10min(4000r/min),取上層血清待用,同時(shí)解剖取肝臟待用[7]。

1.2.3 血清指標(biāo)測(cè)定 各組小鼠血清中AST、ALT、LDH、MDA、GSH和TG含量按試劑盒操作說明書操作測(cè)定。

1.2.4 組織指標(biāo)測(cè)定 將各組小鼠肝臟用生理鹽水洗凈加入9倍量生理鹽水后用超聲粉碎機(jī)粉碎后制成組織勻漿,組織中MDA、GSH和TG水平和IL-6、IL-1β,TNF-α和IFN-γ細(xì)胞因子水平按試劑盒操作說明書操作測(cè)定。

1.2.5 肝臟組織病理學(xué)觀察 將小鼠肝組織固定在10%的福爾馬林溶液中24h,然后用乙醇脫水,再將肝組織包埋在石蠟中。將石蠟組織切為4μm厚度,用蘇木精和伊紅染色后在顯微鏡下進(jìn)行組織病理觀察。

1.2.6 RT-PCR法檢測(cè)肝組織中炎癥相關(guān)基因表達(dá) 將小鼠肝臟用超聲粉碎機(jī)粉碎后用RNAzol試劑提取肝組織中的RNA。將提取的肝組織RNA濃度稀釋到1μg/μL。在2μL的肝組織RNA提取液中分別加入oligodT18,RNase,dNTP和MLV酶各1μL,5×buffer 10μL,在37℃、120min,99℃、4min,4℃、3min的條件下合成cDNA。然后以反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法擴(kuò)增NF-κB和IκB-α表達(dá),同時(shí)以持家基因作為對(duì)照內(nèi)參照。最后將溴化乙錠加入瓊脂中制成含有1%溴化乙錠的瓊脂膠板,采用電泳檢查PCR擴(kuò)增產(chǎn)物[1]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示后使用SAS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)采用one-way ANOVA法分析數(shù)據(jù)結(jié)果在p<0.05水平上是否具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟲茶黃酮提取物的純度

以蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定植物樣品提取物中總黃酮的含量是檢測(cè)提取物總黃酮純度的常用方法。通過測(cè)定10～50μg/mL濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度,得到總黃酮濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.001x-0.0054(x為黃酮濃度,y為吸光值,圖1)。通過對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線可以檢測(cè)出蟲茶黃酮提取物中黃酮類物質(zhì)的含量達(dá)到37.2%。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin standard liquid

2.2 蟲茶黃酮對(duì)CCl4誘發(fā)肝損傷小鼠血清中AST、ALT和LDH水平的影響

小鼠灌胃蟲茶黃酮14d后,采用CCl4誘導(dǎo)肝損傷,通過檢測(cè)小鼠血清中的特定指標(biāo)可以判斷肝損傷程度。AST、ALT和LDH均是臨床上檢測(cè)肝病和肝損傷的重要指標(biāo),肝損傷對(duì)照組的AST、ALT、AST/ALT和LDH指標(biāo)均比正常組顯著提高(p<0.05),蟲茶黃酮可以減緩這些指標(biāo)的升高,而且在100mg/kg濃度蟲茶黃酮灌胃下,減緩得更多,接近水飛薊藥物組(表1)。ALT與AST主要分布在肝臟細(xì)胞內(nèi),肝細(xì)胞出現(xiàn)損傷和壞死時(shí),肝臟中的ALT和AST含量就會(huì)升高。同時(shí),因?yàn)锳LT和AST含量升高的程度與肝細(xì)胞受損的程度呈正相關(guān),所以ALT和AST含量是最常用的肝功能檢測(cè)指標(biāo)。ALT和AST可以準(zhǔn)確的檢測(cè)嚴(yán)重的肝疾病(肝硬化、肝纖維化、肝癌),嚴(yán)重肝損傷時(shí)AST/ALT會(huì)大于1,通過AST和ALT的比值可以更好的評(píng)價(jià)肝損傷[8]。LDH作為糖酵解酶,也可以體現(xiàn)肝臟受損的程度,肝臟出現(xiàn)損傷時(shí),LDH在血清中的含量也明顯升高[7]。本研究發(fā)現(xiàn)蟲茶黃酮可以降低肝損傷小鼠血清中的AST、ALT、AST/ALT和LDH水平,100mg/kg的蟲茶黃酮效果略優(yōu)于藥物水飛薊。通過結(jié)果可以看到蟲茶黃酮可以減輕小鼠的肝細(xì)胞損傷程度,證明蟲茶黃酮有較好的肝損傷預(yù)防效果。

表1 CCl4誘導(dǎo)肝損傷小鼠的血清AST、ALT和LDH水平Table 1 Serum levels of AST,ALT and LDH in mice following CCl4 induced liver injury

注:a-e不同字母表示各組間差異顯著(p<0.05),相同字母表示各組間差異不顯著(p>0.05),表2～表3同。

表2 CCl4誘導(dǎo)肝損傷小鼠的血清和肝組織MDA、GSH和TG水平Table 2 Serum levels and hepatic tissues of MDA,GSH and TG in mice following CCl4 induced liver injury

2.3 蟲茶黃酮對(duì)CCl4誘發(fā)肝損傷小鼠血清和組織中MDA、GSH和TG含量的影響

由表2可以看出蟲茶黃酮灌胃小鼠血清和組織中的MDA和TG含量較肝損傷對(duì)照組顯著降低(p<0.05),且100mg/kg濃度灌胃小鼠的水平低于50mg/kg濃度灌胃小鼠,略高于正常組小鼠。蟲茶黃酮的處理肝組織中的GSH含量較對(duì)照組顯著上升(p<0.05)。CCl4作用于肝臟后產(chǎn)生的·CCl3可引起肝細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化,導(dǎo)致肝損傷。MDA在血清和組織中的含量可以表示脂質(zhì)過氧化的程度,用以判斷肝臟受CCl4損害的程度[9]。GSH是重要的抗氧化劑,能過通過與體內(nèi)有害的毒物的結(jié)合將它們排出體外,GSH通過與肝臟中CCl4產(chǎn)生的有害物質(zhì)結(jié)合,將有害物質(zhì)帶出體外,減輕肝損傷。TG升高代表脂肪酸含量高,脂肪酸含量高與肝病有一定的聯(lián)系[10]。有研究表明CCl4引發(fā)的肝損傷可引發(fā)體內(nèi)MDA和TG含量升高,GSH含量下降[9]。蟲茶黃酮可以降低小鼠體內(nèi)MDA、TG含量和增高GSH含量,通過對(duì)這些指標(biāo)的條件作用,蟲茶黃酮可能具有抑制肝臟受CCl4損害造成的肝臟脂質(zhì)過氧化和加速排除體內(nèi)由于肝損傷產(chǎn)生毒素的效果,從而起到了肝保護(hù)效果。

2.4 蟲茶黃酮對(duì)CCl4誘發(fā)肝損傷小鼠血清中炎癥細(xì)胞因子水平的影響

由表3可知,蟲茶黃酮可以顯著降低肝損傷小鼠血清中的IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-γ水平,100mg/kg濃度灌胃下小鼠的炎癥細(xì)胞因子水平比50mg/kg濃度蟲茶黃酮的作用更為強(qiáng)烈,可以更明顯的降低這些炎癥細(xì)胞因子水平。肝臟被損傷后經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)炎癥,通過檢測(cè)炎癥細(xì)胞因子的水平可以衡量肝損傷的程度。這些細(xì)胞因子在內(nèi)臟發(fā)生損傷的過程中有十分重要的作用,IL-6和TNF-α等細(xì)胞因子作為重要的炎癥介質(zhì)參與機(jī)體的炎癥反應(yīng),正常生理狀態(tài)下,血液中的TNF-α和IL-6水平較低,但在病理狀態(tài)下,TNF-α和IL-6含量升高以及引起的其他炎癥因子大量釋放可導(dǎo)致炎癥加劇,這些反應(yīng)都可以引起肝細(xì)胞損傷[7]。IL-6還能使INF-γ增加,INF-γ具有激活非特異性效應(yīng)細(xì)胞的能力,能夠介導(dǎo)細(xì)胞免疫的效應(yīng)過程[11]。有研究表明CCl4誘導(dǎo)小鼠肝損傷會(huì)造成小鼠血清中的IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-γ水平顯著高于正常小鼠[7]?？梢娤x茶黃酮可以通過顯著(p<0.05)降低肝損傷小鼠體內(nèi)IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-γ炎癥因子水平,達(dá)到緩解炎癥的效果。由于蟲茶黃酮對(duì)肝損傷誘發(fā)的炎癥的抑制作用,肝損傷的程度則明顯緩解。由此可以判斷蟲茶黃酮是具有很好抗炎和預(yù)防肝損傷的功效物質(zhì)。

表3 CCl4誘導(dǎo)肝損傷小鼠的細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-γ水平Table 3 Cytokine levels of IL-6,IL-1β,TNF-α and IFN-γ in mice following CCl4 induced liver injury

2.5 蟲茶黃酮對(duì)CCl4誘發(fā)肝損傷小鼠肝組織病理狀態(tài)的影響

由圖2可知,正常組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)清晰,肝小葉邊界完整,無(wú)中央靜脈擴(kuò)張;對(duì)照組小鼠的肝臟組織出現(xiàn)大部分肝細(xì)胞壞死,肝小葉網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞,細(xì)胞間結(jié)構(gòu)不完整;50mg/kg蟲茶黃酮灌胃小鼠肝臟的肝小葉也出現(xiàn)部分破壞,有一定面積的肝壞死;100mg/kg蟲茶黃酮?jiǎng)t很大程度上緩解了CCl4對(duì)肝臟組織造成的損害,肝臟受損面積很小,肝小葉結(jié)構(gòu)也比較完整,肝小葉中央無(wú)壞死;水飛薊組小鼠由于藥物的作用,肝組織同100mg/kg蟲茶黃酮組小鼠一樣沒有出現(xiàn)大面積的壞死,組織結(jié)構(gòu)較完整。組織病理切片作為臨床上重要的判斷病癥的方法可以對(duì)肝損傷進(jìn)行準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)[7],本研究中通過病理切片也確定蟲茶黃酮可以大大減輕CCl4誘發(fā)肝損傷對(duì)肝細(xì)胞造成的損害,起到很好的肝損傷預(yù)防作用。

圖2 CCl4誘導(dǎo)小鼠肝損傷肝組織病理圖像(×200)Fig.2 Histological images of the liver tissue of mice with CCl4 induced liver injury(×200)

2.6 蟲茶黃酮對(duì)CCl4誘發(fā)肝損傷小鼠肝組織中NF-κB和IκB-α的mRNA水平的影響

由圖3可以看出,對(duì)于對(duì)照組小鼠的肝組織蟲茶黃酮可以下調(diào)小鼠肝組織中NF-κB的mRNA表達(dá),并且100mg/kg濃度蟲茶黃酮比50mg/kg蟲茶黃酮下調(diào)得更多;同時(shí),蟲茶黃酮也可以上調(diào)IκB-α表達(dá)。100mg/kg濃度蟲茶黃酮處理后,小鼠肝組織中NF-κB和IκB-α表達(dá)與水飛薊處理小鼠相似,接近正常組小鼠。肝損傷發(fā)生后會(huì)引發(fā)肝組織發(fā)炎,NF-κB的活化可引起肝臟炎癥,IκB-α是NF-κB的抑制因子,IκB-α釋放減少會(huì)引起NF-κB水平上升,兩者在組織中的水平呈負(fù)相關(guān)[7]。蟲茶黃酮對(duì)肝組織中的NF-κB和IκB-α的mRNA表達(dá)水平也呈現(xiàn)出這樣的結(jié)果,可見蟲茶黃酮可以減輕由于肝損傷造成的炎癥基因表達(dá)的增強(qiáng),從而起到肝損傷預(yù)防作用。

圖3 小鼠肝組織NF-κB和IκB-α的mRNA表達(dá)水平Fig.3 mRNA expression levels of NF-κB and IκB-α in liver injury of mice

3 結(jié)論

本研究采用CCl4建立動(dòng)物肝損傷模型對(duì)蟲茶黃酮進(jìn)行肝損傷預(yù)防作用的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示蟲茶黃酮可以降低肝損傷小鼠血液中AST、ALT、LDH、MDA和TG含量,增加GSH的含量。同時(shí),蟲茶黃酮也可以降低肝損傷小鼠肝組織中的MDA和TG含量,增加GSH的含量。蟲茶黃酮對(duì)血清中炎癥細(xì)胞因子的含量也起到了調(diào)節(jié)作用,相對(duì)于對(duì)照小鼠,蟲茶黃酮可以降低小鼠的IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-γ水平。通過肝臟組織的病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)蟲茶黃酮可以減輕CCl4對(duì)肝臟細(xì)胞的損害,效果略優(yōu)于臨床常用肝病治療藥物水飛薊。對(duì)肝組織的RT-PCR實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)蟲茶黃酮能下調(diào)肝組織中NF-κB的mRNA表達(dá)水平,并上調(diào)IκB-α表達(dá)。由這些結(jié)果可以看出蟲茶黃酮作為蟲茶中有效的功能性提取物具有很好的肝保護(hù)作用。但是,蟲茶以及蟲茶黃酮對(duì)肝臟的保護(hù)作用機(jī)理還有待進(jìn)一步的研究。

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Preventive effect of total flavonoids of Platycarya strobilacea insect tea on CCl4induce liver injury in mice

WANG Rui,SUN Peng*

(Department of Biological and Chemical Engineering,Chongqing University of Education,Chongqing 400067,China)

In this study,the liver injury preventive effect of total crude flavonoids of Insect tea(FIT)were determined. FIT could reduce the serum levels of AST,ALT,LDH,MDA,and FIT also could raise GSH level in mice by CCl4induced hepatic injury. After FIT treatment,the MDA,TG levels of liver tissues were decreased,and the GSH level was increased in mice. In addition,the 100mg/kg of FIT showed the stronger effect,and the effect was close to the hepatic drug of silymarin treatment. In serum cytokine level tests,the IL-6,IL-1β,TNF-α and IFN-γ levels of FIT treated mice were lower than liver injury control mice,these levels were close to the normal and silymarin treated mice. It was found that FIT could decrease the injury levels of CCl4induced hepatic tissues and protect the liver cells through the histopathology test. FIT down regulated the expression of NF-κB;and up regulated IκB-α expression in liver tissues of live injury mice compare to the control mice. These results proved that FIT had good preventive effect of liver injury.

flavonoid;insect tea;liver injury;cytokine;expression

2014-08-11

王睿(1982-),男,碩士,講師,研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)和功能性食品。

*通訊作者:孫鵬(1983-),男,碩士,講師,研究方向：天然產(chǎn)物和藥學(xué)。

重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(KJ1401402)。

TS201.1

A

1002-0306(2015)11-0361-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.065