利用魚白-豆粕混合發(fā)酵制備水溶性蛋白粉

劉燕妮,王建磊,劉 潔,程 雯,牟海津

(中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003)

利用魚白-豆粕混合發(fā)酵制備水溶性蛋白粉

劉燕妮,王建磊,劉 潔,程 雯,牟海津*

(中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003)

實驗研究了以魚白和豆粕為原料,利用枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)N-2固態(tài)發(fā)酵制備水溶性蛋白粉的發(fā)酵工藝。通過單因素實驗研究了發(fā)酵時間,接菌量,料水比,發(fā)酵溫度和初始pH對魚白-豆粕發(fā)酵制備的蛋白粉水溶性物質溶出率、水溶蛋白提取率、酸溶蛋白提取率、游離氨基酸含量和核酸含量的影響;在單因素實驗的基礎上,應用響應面法設計,進一步優(yōu)化發(fā)酵工藝對蛋白粉中水溶蛋白提取率的影響。結果表明,最佳發(fā)酵工藝為發(fā)酵時間60h,料水比1∶1.4,發(fā)酵初始pH7.2,發(fā)酵溫度36℃,接菌量8%。在此發(fā)酵工藝下,得到水溶性物質溶出率為80.25%,水溶蛋白提取率為91.86%,酸溶蛋白提取率為57.25%,游離氨基酸含量為25.9%,核酸含量為11.2%。最佳工藝條件下制備的蛋白粉中人體必需氨基酸在氨基酸總量中占的比例明顯增多。

魚白,豆粕,混合發(fā)酵,水溶性蛋白粉,響應面分析

魚類的精巢又稱為魚白,資源量豐富,約占魚體重的7%,由于它有獨特的臭味,常常按廢棄物處理,其它用途很少,利用價值非常低,不僅造成資源的浪費而且對環(huán)境造成較大污染。魚成熟期的精巢組織含核蛋白、酶類以及多種微量元素(其中較多的微量元素有錳、鋅、銅、鉬等)[1-2]。魚白中以蛋白質為主的氮素化合物為16%～18%[3],如果能將魚白變廢為寶,對提高資源有效利用價值具有重要意義。

豆粕中蛋白質含量高達43%～48%[4-5],是畜禽飼養(yǎng)中最常用的植物性蛋白質飼料。但其中含有10余種抗營養(yǎng)因子,對營養(yǎng)成分的消化、吸收、代謝會產生不良影響。

由于魚白中蛋白質含量高,且富含人體所必需的氨基酸,是制備蛋白粉的優(yōu)質原料。目前,水產原料的蛋白粉的制備主要采取酶解的方法,但酶解成本高、產物苦味重,成為限制酶解水產蛋白粉開發(fā)的瓶頸問題。通過微生物發(fā)酵,不僅可以將魚白轉化為一種優(yōu)質的蛋白資源,而且可以消除豆粕中部分抗營養(yǎng)因子[6],有效降解其中的大分子營養(yǎng)物質,使營養(yǎng)成分含量增加、適口性得到改善、消化吸收率提高。

在前期研究中發(fā)現,枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)N-2對豆粕原料的蛋白質溶出和降解能力優(yōu)良,但對魚白單獨發(fā)酵的能力較弱?；谶@一問題,為有效開發(fā)魚白原料的水溶性蛋白粉,本研究采取將魚白和豆粕混合進行固態(tài)發(fā)酵的工藝,以期有效提高原料中水溶性蛋白質和酸溶蛋白等成分的提取率,從而建立一種具有良好市場前景和能夠滿足工業(yè)化生產需求的高值化發(fā)酵工藝,開發(fā)出具有良好營養(yǎng)價值的水溶性蛋白粉,進而為魚類副產物的綜合利用和高值化開發(fā)打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮭魚魚白 青島龍和有限公司提供;豆粕 青島渤海實業(yè)有限公司提供;枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)N-2 由中國海洋大學應用微生物實驗室保藏并提供;液體種子培養(yǎng)基配方:蛋白胨10g/L,牛肉膏3g/L,氯化鈉5g/L,pH7.2;氯化鈉、蛋白胨、牛肉膏、碳酸鈉、酒石酸鉀鈉、磷酸二氫鉀、抗壞血酸、鉬酸銨、硫酸、甲醛、三氯乙酸、過氧化氫 均為分析純。

DNP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏設備有限公司;無菌操作臺 北京東聯哈爾儀器制造有限公司;LDZX-40B型立式蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;電子精密天平 奧賽斯國際貿易(上海)有限公司;攪拌機 九陽股份有限公司;722S可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;TDL-5-A離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 魚白和豆粕預處理 除盡附著在精巢上面的其它腺體、脂肪、結締組織、血塊和污物,然后將魚白于105℃條件下烘干至恒重,粉碎(80～100目),置于干燥的環(huán)境下密封備用。豆粕于105℃烘干至恒重,顆粒大小為0.9～2.5mm。

1.2.2 液體種子培養(yǎng) 每100mL三角瓶裝量40mL液體種子培養(yǎng)基,在121℃條件下滅菌20min。待冷卻后從活化的枯草芽孢桿菌斜面接一環(huán)菌種至液體種子培養(yǎng)基,置于32℃控溫搖床,170r/min下培養(yǎng)24h,待用。

1.2.3 蛋白粉制備單因素實驗 將豆粕和魚白按照1.5∶1(干重)的比例混合,裝入250mL的三角瓶中,向其中添加2%的蔗糖和0.1%的KH2PO4,在115℃的條件下滅菌30min。以發(fā)酵時間、接菌量、料水比、發(fā)酵溫度和發(fā)酵初始pH作為優(yōu)化條件,以水溶性物質溶出率、水溶蛋白提取率、酸溶蛋白提取率、游離氨基酸含量和核酸含量為測定指標,對混合發(fā)酵后制備的水溶性蛋白粉的各培養(yǎng)參數進行測定和優(yōu)化。

1.2.3.1 發(fā)酵時間的選擇 在料水比1∶1.5,初始pH6.0,接菌量6%,發(fā)酵溫度32℃的條件下,考察0、24、48、72、96、120h的發(fā)酵時間對各項指標的影響。

1.2.3.2 接菌量的選擇 在料水比1∶1.5,初始pH6.0,培養(yǎng)溫度32℃,發(fā)酵時間48h的條件下,考察2%、4%、6%、8%、10%的接菌量對各項指標的影響。

1.2.3.3 料水比的選擇 在初始pH6.0,接菌量8%,培養(yǎng)溫度32℃,發(fā)酵時間48h的條件下,考察1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5的料水比對各項指標的影響。

1.2.3.4 發(fā)酵溫度的選擇 在料水比1∶1.5,初始pH6.0,接菌量8%,發(fā)酵時間48h的條件下,考察24、28、32、36、40℃發(fā)酵溫度對各項指標的影響。

1.2.3.5 初始pH的選擇 在料水比1∶1.5,接菌量8%,發(fā)酵溫度36℃,發(fā)酵時間48h的條件下,考察發(fā)酵初始pH5.0、6.0、7.0、8.0、9.0對各項指標的影響。

1.2.4 蛋白粉的制備 稱取一定質量的發(fā)酵產物,向其中加入20倍體積的水,充分攪拌1h,4000r/min離心15min,反復提取三次,棄去沉淀。將三次離心后的上清液合并濃縮后冷凍干燥制備水溶性蛋白粉,稱重。

1.2.5 響應面分析法優(yōu)化工藝條件 根據單因素的實驗結果,以蛋白粉中水溶蛋白提取率為評價指標,選擇發(fā)酵時間、料水比和發(fā)酵初始pH三個因素為響應變量,在固定發(fā)酵溫度36℃,接菌量8%的條件下,進行Box-Behnken實驗設計,優(yōu)化魚白-豆粕發(fā)酵制備水溶性蛋白粉的工藝,因素水平設計見表1。

表1 響應面分析實驗設計因素與水平表Table 1 Variables and levels in response surface design

1.2.6 蛋白粉的各項指標的測定方法

1.2.6.1 水溶性物質溶出率 稱取重量為A1的發(fā)酵產物(以干物質計),按照1.2.4的方法制備蛋白粉,稱重A2。

將制備的蛋白粉溶于20倍水中,充分攪拌1h,測定以下指標。

1.2.6.2 水溶性蛋白的測定 采用Folin-酚試劑法[7]測定蛋白粉中水溶性蛋白質的含量,蛋白粉中水溶性蛋白質總量為B1。制備蛋白粉的原料中蛋白質總量為A3, 通過豆粕中蛋白質含量(凱氏定氮法)和魚白中氨基酸組分含量相加得到(魚白中含有核酸,不宜用凱氏定氮法測定蛋白質含量)。

1.2.6.3 酸溶蛋白的測定 利用三氯乙酸(TCA)沉淀的方法除去不溶性的蛋白質和長鏈肽,然后采用Folin-酚試劑法測定蛋白粉中的酸溶蛋白含量,計算蛋白粉中酸溶蛋白總量為B2。

1.2.6.4 游離氨基酸的測定 采用甲醛滴定法[8]測定游離氨基酸的含量。計算蛋白粉中游離氨基酸總量為B3。

1.2.6.5 核酸的測定 采用定磷法[8]測定核酸的含量。計算蛋白粉中的核酸總量為B4。

1.2.6.6 氨基酸組成的測定 將魚白、豆粕和最佳發(fā)酵工藝制備的蛋白粉,用氨基酸自動分析儀法測定氨基酸組分[9]。

1.3 數據處理

所有數據均為3次重復實驗的平均值,運用Excel數據處理軟件和Design expert V8.0.6統(tǒng)計軟件進行數據分析,同時采用SPSS 13軟件對數據進行統(tǒng)計分析,通過ANOVA對單因素各水平值進行顯著性分析,顯著水平設置為p<0.05。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 發(fā)酵時間對蛋白粉制備的單因素實驗結果 發(fā)酵時間是影響魚白-豆粕發(fā)酵制備蛋白粉的一個非常重要的因素。由圖1可知,隨著發(fā)酵時間的延長,蛋白粉水溶性物質的溶出率不斷增加,在0h時為13.28%,在48h時達到77.15%,但在發(fā)酵48h之后變化不大。發(fā)酵48h時,水溶蛋白提取率、酸溶蛋白提取率、游離氨基酸含量和核酸含量,均達到最大值,再延長發(fā)酵時間,各指標含量將會下降。其中發(fā)酵0h時水溶蛋白提取率和酸溶蛋白提取率分別為15.67%和8.76%,發(fā)酵48h時分別達到90.16%和53.90%。故發(fā)酵時間以48h左右為宜。

圖1 發(fā)酵時間對蛋白粉中各種成分的影響Fig.1 Effects of fermentation time on the components of protein powder注:圖表上方相同字母表示差異性不顯著, 不同字母表示差異性顯著,圖2～圖5同。

2.1.2 接菌量對蛋白粉制備的單因素實驗結果 接菌量對固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中菌株的生長情況會產生一定的影響。在接菌量較小情況下,菌種需要較長時間才能繁殖[10]。隨著接菌量的增加,各項指標呈現逐漸增大的趨勢,當接菌量為8%時,各項指標均達到最大值,其中水溶蛋白提取率為91.23%。然而隨著接菌量的增加,水溶蛋白提取率變化趨勢不大,因而不作為響應面實驗設計的因素選擇。

圖2 接菌量對蛋白粉中各種成分的影響Fig.2 Effects of inoculum on the components of protein powder

2.1.3 料水比對蛋白粉制備的單因素實驗結果 實驗發(fā)現,適宜的含水量有提高魚白-豆粕發(fā)酵制備的蛋白粉各項指標的趨勢。由圖3可知,當料水比為1∶0.5時,水溶物質溶出率、水溶蛋白提取率和酸溶蛋白提取率分別為48.58%,39.36%和20.5%,隨著物料含水量的增加,各項指標逐漸增加,當料水比為1∶1.5,各項指標均達到最大值,其中水溶物質溶出率、水溶蛋白提取率和酸溶蛋白提取率分別為82.3%,89.5%和55.63%。說明此含水量的培養(yǎng)基質最適宜微生物生長繁殖,然而隨著料水比的進一步加大,導致發(fā)酵基質中的溶氧量減少,不利于菌種的大量繁殖與增長[10],從而導致溶出率不但沒有增加反而略有下降。因此選擇最佳料水比為1∶1.5。

圖3 料水比對蛋白粉中各種成分的影響Fig.3 Effects of solid-water ratio on the components of protein powder

2.1.4 發(fā)酵溫度對蛋白粉制備的單因素實驗結果 由圖4可知,隨著發(fā)酵溫度的增高,水溶性物質的溶出率等指標都有一定的上升趨勢,且在36℃各項值達到最大。溫度對微生物的代謝有一定的作用,隨著溫度上升,N-2的代謝分解能力增強,致使大量物質被分解溶出,但變化趨勢不是很明顯,初步確定36℃為N-2發(fā)酵的最適溫度,但溫度不作為響應面實驗設計的因素選擇。

圖4 發(fā)酵溫度對蛋白粉中各種成分的影響Fig.4 Effects of fermentation temperature on the components of protein powder

2.1.5 初始pH對蛋白粉制備的單因素實驗結果 由圖5可知,發(fā)酵pH對魚白-豆粕混合發(fā)酵制備蛋白粉有一定影響,當初始pH調整為7.0時,蛋白粉中各項指標均達到最大值,其中水溶性物質溶出率和水溶蛋白提取率分別達到82.66%和91.23%,當pH調整為6.0或8.0時,水溶性物質溶出率和水溶蛋白提取率有所減少。所以確定魚白-豆粕混合發(fā)酵的最佳初始pH為7.0。

圖5 初始pH對蛋白粉中各種成分的影響Fig.5 Effects of the initial pH on the components of protein powder

2.2 響應面分析法優(yōu)化工藝條件

2.2.1 響應面設計方案 根據單因素實驗結果,選取發(fā)酵時間(h)、料水比、發(fā)酵初始pH對水溶蛋白提取率影響比較顯著的三個因素,作為Box-Benhnken中心組合設計的因素來考察這三個因素對蛋白粉中水溶蛋白提取率的影響,實驗設計及實驗結果見表2。

表3 回歸模型的方差分析結果Table 3 Analysis of variance for quadric regression model

注:** 代表極顯著,p<0.01;*代表顯著,p<0.05;N代表不顯著。

利用Design expert V8.0.6統(tǒng)計軟件對表2中實驗數據進行回歸擬合,得到水溶蛋白提取率對所選3個因素的二次多項回歸模型為:

Y=+90.46+4.53A+0.76B+0.96C-5.17AB-0.38AC+0.86BC-5.26A2-4.63B2-2.19C2

表2 Box-Behnken實驗設計及結果Table 2 Box-Behnken design matrix and experimental results

對該模型進行顯著性檢驗,得方差分析表(表3)。

從表中可以看出該模型的影響因子A、C、AB、A2、B2、C2對蛋白粉中水溶蛋白提取率的影響極顯著(p<0.01),影響因子B以及交互項BC對水溶蛋白提取率的影響顯著(0.01

以上數據都說明該模型的擬合程度教好,因此可以用此模型來分析和預測發(fā)酵時間、料水比、初始pH對蛋白粉的水溶蛋白提取率的影響。

圖6 發(fā)酵時間(A),料水比(B)和初始pH(C) 對魚白-豆粕混合發(fā)酵制備蛋白粉水溶蛋白提取率的影響Fig.6 Effects of fermentation time(A),solid-water ratio(B) and initial pH(C)on protein extraction rate of protein powder by mixed fermentation with milt and soybean meal

選定的因素對蛋白粉中水溶蛋白提取率的影響大小依次為發(fā)酵時間>初始pH>料水比,即發(fā)酵時間對水溶蛋白提取率的影響最大。

2.2.2 響應曲面圖分析與優(yōu)化 響應面圖是響應值對各實驗因素所構成的三維空間曲面圖,可直觀的反映各實驗因素的交互作用[13-14]。圖6直觀地展現出各因子交互作用的響應曲面3D分析圖,從響應面分析圖上可以找到它們之間的相互作用,等高線圖表示在同一橢圓型的曲線上,水溶蛋白提取率是相同的,而中心的提取率最高。等高線的形狀可反映出交互效應的強弱,橢圓形表示兩因素交互作用顯著,若趨向于圓形則表示交互作用較弱[15]。此外,如果一個響應面的坡度趨于陡峭(即等高線排列緊密),表明響應值受操作條件的變化而影響較大,反之,操作條件的改變對響應值影響較小[16]。

2.2.3 最優(yōu)工藝條件求取與模型驗證 通過單因素實驗優(yōu)化條件,根據Box-Behnken設計,通過Design-Expert 8.0.6 軟件求得預測的蛋白粉中水溶蛋白提取率的最優(yōu)工藝條件為:發(fā)酵時間為60.53h,料水比為1∶1.4,發(fā)酵初始pH為7.14,蛋白質的提取率最高,可達到91.64%。但為了驗證模型的有效性,并考慮到實驗室實際情況和實驗儀器的局限性,發(fā)酵時間為60h,料水比為1∶1.4,發(fā)酵初始pH為7.2。按照此修正條件,進行三次平行驗證實驗,得到水溶蛋白提取率為91.86%,與理論預測值基本吻合,同時在此條件下酸溶蛋白提取率為57.25%,游離氨基酸含量為25.9%,核酸含量為11.2%。因此利用響應面分析法優(yōu)化得到的工藝條件真實可靠,具有實用價值。

2.3 氨基酸組成分析

豆粕和魚白這兩種原料中的蛋白質含量均較高,且氨基酸種類豐富,必需氨基酸含量占總氨基酸含量的比值分別為35.75g/100g和35.16g/100g(表4)。混合發(fā)酵后制備的蛋白粉,人體必需氨基酸在氨基酸總量中占的比例明顯增多,為37.06g/100g,尤其是賴氨酸增加比較明顯。賴氨酸是人體必需氨基酸之一,其對促進人體發(fā)育、增強免疫功能,提高中樞神經組織功能有重要作用。蛋白粉中氨基酸含量為49.22g/100g,可以作為一種高品質的蛋白產品。

表4 豆粕、魚白及蛋白粉的氨基酸組成Table 4 Amino acid composition of soybean meal,milt and protein powder

注:*為人體所必需的氨基酸。

3 結論

本文研究了以魚白和豆粕混合進行固態(tài)發(fā)酵制備蛋白粉的工藝研究,不僅為水溶性蛋白粉的制備提供了新的思路,而且為魚類副產物的綜合利用和高值化開發(fā)打下基礎。通過此方法制備的蛋白粉,為色澤均一的淡黃色粉末,無結塊和雜質,且無魚腥味和異味,具有很好的利用價值。

制備的蛋白粉中水溶性蛋白質和酸溶蛋白含量均較高,其中水溶蛋白提取率可以達到91.86%,酸溶蛋白提取率可以達到57.25%。蛋白粉中氨基酸含量為49.22g/100g,人體必需氨基酸尤其是賴氨酸含量有所增加,可見所制備的水溶性蛋白粉是一種高品質蛋白豐富的產品,可以作為一種蛋白肽用于水產養(yǎng)殖飼料添加劑,并在工藝成熟的條件下開發(fā)人體營養(yǎng)補充劑,使市場現有的蛋白粉種類更加豐富。

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Production of water-soluble protein powder by mixed fermentation with milt and soybean meal

LIU Yan-ni,WANG Jian-lei,LIU Jie,CHENG Wen,MOU Hai-jin*

(College of Food Science and Engineering,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

The production of water-soluble protein powder was studied by mixed fermentation ofBacillussubtilisN-2 with milt and soybean meal as culture medium. Five factors,including fermentation time,inoculum volume,solid-water ratio,fermentation temperature and initial pH were studied by single-factor experiments,in order to analyze the effect on water-soluble substance dissolution rate,water-soluble protein extraction rate,acid-soluble protein extraction rate,free amino acids content and nucleic acid content of protein powder. Fermentation conditions were optimized by response surface methodology based on the single-factor experiments. The optimum fermentation condition was as follows:fermentation time of 60h;solid-water ratio of 1∶1.4;initial pH of 7.2,fermentation temperature of 36℃,inoculum volume of 8%. In this fermentation process,water-soluble substance dissolution rate was 80.25%,water-soluble protein extraction rate was 91.86%,acid-soluble protein extraction rate was 57.25%,free amino acids content was 25.9%,and nucleic acid content was 11.2%. The proportion of essential amino acids in total amino acids increased significantly in the protein powder which was prepared under the optimum conditions.

milt;soybean meal;mixed fermentation;water-soluble protein powder;response surface analysis

2014-09-03

劉燕妮(1988-)，女，碩士研究生，研究方向：生物工程

TS254.9

A

1002-0306(2015)11-0197-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.031

*通訊作者:牟海津(1973-)，博士，教授，研究方向：食品微生物、微生物天然產物及海洋微生物工程。