黑曲霉XSY0607以纖維素為原料發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸培養(yǎng)基優(yōu)化研究

孫 科,周鳳俠

(1.徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系,江蘇徐州 221006;2.中央農(nóng)業(yè)廣播學(xué)校徐州分校,江蘇徐州 221000)

黑曲霉XSY0607以纖維素為原料發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸培養(yǎng)基優(yōu)化研究

孫 科1,周鳳俠2

(1.徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系,江蘇徐州 221006;2.中央農(nóng)業(yè)廣播學(xué)校徐州分校,江蘇徐州 221000)

通過(guò)對(duì)黑曲霉(Aspergillusniger)XSY0607液體深層發(fā)酵檸檬酸的培養(yǎng)基優(yōu)化實(shí)驗(yàn),得出如下結(jié)論:通因?qū)嶒?yàn)得出黑曲霉XSY0607發(fā)酵檸檬酸的最佳碳源為水稻秸稈、最佳有機(jī)氮源為蛋白胨、最佳無(wú)機(jī)氮源NH4NO3、最佳生長(zhǎng)因子為牛肉膏。通過(guò)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)得到黑曲霉XSY0607發(fā)酵檸檬素的最佳培養(yǎng)基配方為:水稻秸稈粉6%、蛋白胨4.5%、NH4NO30.5%、牛肉膏0.75%、KH2PO40.15%、MgSO40.045%和FeSO4·7H2O 0.0015%。同時(shí)通過(guò)極差分析還可得出黑曲霉XSY0607發(fā)酵培養(yǎng)基中不同成分對(duì)檸檬酸發(fā)酵的影響順序?yàn)樗窘斩?蛋白胨>NH4NO3>KH2PO4>MgSO4>FeSO4·7H2O>牛肉膏。使用優(yōu)化后的培養(yǎng)基進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵實(shí)驗(yàn),檸檬酸產(chǎn)量為83.6mg/mL,較優(yōu)化前產(chǎn)量提高了31.83%。

黑曲霉XSY0607,水稻秸稈,液體深層發(fā)酵,培養(yǎng)基優(yōu)化

檸檬酸及其衍生物作為添加劑被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療、化工等行業(yè),目前是世界上產(chǎn)銷量最大的有機(jī)酸。近20年來(lái)我國(guó)檸檬酸發(fā)酵工業(yè)迅猛發(fā)展,年生產(chǎn)量約占世界檸檬酸總生產(chǎn)量的70%,是目前世界上最大的生產(chǎn)國(guó)和出口國(guó)[1]。傳統(tǒng)的檸檬酸發(fā)酵都采用玉米、木薯等農(nóng)作物帶渣發(fā)酵。發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸糧食消耗占生產(chǎn)成本的 65%左右,由于世界范圍需求量不斷增加,應(yīng)當(dāng)不斷開發(fā)探尋新的原料,從而實(shí)現(xiàn)我國(guó)檸檬酸發(fā)酵產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[2]。在“不與人爭(zhēng)糧,不與糧爭(zhēng)地”的原則指導(dǎo)下,采用糖蜜、秸稈等農(nóng)副產(chǎn)品發(fā)酵檸檬酸成為近幾年來(lái)的研究熱點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)外的研究主要集中在黑曲霉發(fā)酵秸稈產(chǎn)纖維素的研究:張福元等[3]利用玉米秸稈研究產(chǎn)生纖維素酶,謝宇等[4]用麩皮采用液體發(fā)酵研究發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶,鄔敏辰等[5]用水稻秸稈采用固體發(fā)酵纖維素酶。對(duì)于以秸稈為原料發(fā)酵檸檬酸的培養(yǎng)基研究幾乎沒(méi)有。本文通過(guò)研究實(shí)驗(yàn)室保藏菌種黑曲霉XSY0607利用纖維素發(fā)酵檸檬酸的培養(yǎng)基優(yōu)化,為檸檬酸發(fā)酵工業(yè)探尋新的發(fā)酵原料提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

水稻秸稈 采自徐州市大彭鎮(zhèn)某村,粉碎過(guò)60目篩;麩皮 市售,過(guò)60目篩;黃豆餅粉 市售,過(guò)60目篩;(NH4)2SO4、MgSO4、CaCl2、KH2PO4、ZnCl2實(shí)驗(yàn)室保藏,分析純;蛋白胨、酵母膏、牛肉膏 實(shí)驗(yàn)室保藏,化學(xué)純。

黑曲霉(Aspergillusniger)XSY0607 實(shí)驗(yàn)室保藏菌種;斜面培養(yǎng)基 羥甲基纖維素鈉(CMC)0.5%,酵母膏0.15%,(NH4)2SO40.2%,瓊脂2%,pH自然[6-7];種子培養(yǎng)基 水稻秸稈粉5%,小麥麩皮0.5%,(NH4)2SO40.25%,玉米粉1%,CaCl20.1%,pH自然[8];發(fā)酵培養(yǎng)基 水稻秸稈粉5.5%,(NH4)2SO40.16%,MgSO40.02%,蛋白胨3%,KH2PO40.2%,CaCl20.001%,ZnCl20.0002%,尿素0.02%,pH5.0[9-10]。

CS501-SP恒溫水浴鍋 重慶慧達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;FA1204B電子分析天平 上海精科天美貿(mào)易有限公司;LRH-70生化培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;XSP-SG-63X顯微鏡 上海光學(xué)儀器廠;723N可見分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司;MP512-03精密pH計(jì) 上海精密儀器儀表有限公司;LC-100高效液相色譜 上海伍豐科學(xué)儀器有限公司;7L實(shí)驗(yàn)室不銹鋼發(fā)酵罐 鎮(zhèn)江貝利生物工程有限;SW-CJ-2F超凈工作臺(tái) 上海陽(yáng)光實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;TGL-18C高速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;MLS-3780高壓蒸汽滅菌鍋 杭州亞旭生物科技有限公司;Ba-1旋轉(zhuǎn)式搖床 江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠;FCW系列超微粉碎機(jī) 青島即墨市超微粉碎機(jī)廠 。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)方法 在無(wú)菌條件下,取出保藏的菌種黑曲霉(Aspergillusniger)XSY0607,接種到斜面培養(yǎng)基上,30℃活化培養(yǎng)48h,然后轉(zhuǎn)接如茄形瓶中,30℃恒溫培養(yǎng)24h。再用無(wú)菌水洗下茄形瓶中成熟孢子,接入500mL三角瓶裝有50mL種子培養(yǎng)基,30℃150r/min震蕩培養(yǎng)28h。然后將種子液以10%～15%[11]的接種量轉(zhuǎn)接至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的7L小型不銹鋼發(fā)酵罐中,通風(fēng)攪拌培養(yǎng)[12]。每隔8h取樣測(cè)定檸檬酸的產(chǎn)生情況和底物的消耗情況,等到黑曲霉菌絲開始自溶時(shí)終止培養(yǎng),分離黑曲霉菌體和發(fā)酵液。每批次都按此方法。

1.2.2 產(chǎn)物分析的方法 總酸測(cè)定:取1mL經(jīng)過(guò)普通濾紙過(guò)濾過(guò)的檸檬酸的發(fā)酵濾液用0.1429N的NaOH滴定,所消耗的NaOH毫升數(shù)即為總酸度。檸檬酸含量測(cè)定:采用高效液相色譜法測(cè)定檸檬酸的含量[13-15]?？偺菧y(cè)定:采用6mol/L的硫酸水解后,用菲林試劑法測(cè)定;還原糖測(cè)定:直接采用菲林試劑法測(cè)定。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

1.2.3.1 培養(yǎng)基成分單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 碳源優(yōu)化:分別以過(guò)60目篩的5%水稻秸稈粉、小麥秸稈粉、玉米秸稈粉、木屑和青草粉等作為碳源,進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵,以確定最佳碳源。

有機(jī)氮源優(yōu)化:分別以過(guò)60目篩的5%黃豆餅粉、酵母膏、蛋白胨、玉米漿和尿素等作為有機(jī)氮源,進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵,以確定最佳有機(jī)氮源。

無(wú)機(jī)氮源優(yōu)化:分別以0.5% NaNO3、(NH4)2SO4、KNO3、NH4NO3和NH4Cl作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)氮源,進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵,以確定最佳無(wú)機(jī)氮源。

生長(zhǎng)因子優(yōu)化:以牛肉膏和酵母膏作為生長(zhǎng)因子的來(lái)源,總濃度為0.6%,分別以牛肉膏和蛋白胨之間不同比例(6∶0、5∶1、4∶2、3∶3、2∶4、1∶5、0∶6),進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵,以確定最佳無(wú)機(jī)氮源。

1.2.3.2 Plackea-Burman(簡(jiǎn)稱PB)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基 根據(jù)發(fā)酵培養(yǎng)基單因素實(shí)驗(yàn),影響黑曲霉XSY0607發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的培養(yǎng)基因素包括:水稻秸稈粉、蛋白胨、牛肉膏、NH4NO3、KH2PO4、MgSO4和FeSO4·7H2O。實(shí)驗(yàn)選用10因素2水平的PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),對(duì)這7個(gè)因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究,另外3個(gè)因素作為虛擬變量,用于評(píng)估誤差。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的每個(gè)因素取2個(gè)水平,根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)確定的水平,同時(shí)根據(jù)常規(guī)PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求高水平約取低水平的1.5倍。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析采用SAS軟件分析,每組做3個(gè)重復(fù),結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 碳源對(duì)檸檬酸發(fā)酵的影響 由于纖維素酶是誘導(dǎo)酶,所以采用了五種天然的纖維素作為碳源。一可以誘導(dǎo)纖維素酶的產(chǎn)生,二可以解決發(fā)酵成本過(guò)高問(wèn)題,三可以嘗試為檸檬酸發(fā)酵開辟更廣的原料來(lái)源。從圖1可以看出:五種纖維素原料作為碳源,水稻秸稈產(chǎn)酸能力最強(qiáng),其次是玉米秸稈,產(chǎn)酸能力最差的是木屑,可能是木屑中含有大量的木質(zhì)素的原因。通過(guò)方差分析,水稻秸稈對(duì)檸檬酸的發(fā)酵影響極顯著。所以,黑曲霉XSY0607發(fā)酵生產(chǎn)檸檬素最好的碳源是水稻秸稈。

圖1 碳源對(duì)產(chǎn)酸的影響Fig.1 Effect of carbon source on production

2.1.2 有機(jī)氮源對(duì)檸檬酸發(fā)酵的影響 從圖2可以看出:五種氮源對(duì)檸檬酸的產(chǎn)量的影響不同,蛋白胨對(duì)黑曲霉XSY0607菌株產(chǎn)酸能力影響最大,其次是尿素,再次是玉米漿,最后是黃豆餅粉。通過(guò)方差分析,蛋白胨對(duì)檸檬酸的發(fā)酵影響顯著。所以,黑曲霉XSY0607發(fā)酵生產(chǎn)檸檬素最好的有機(jī)氮源是蛋白胨。

圖2 有機(jī)氮源對(duì)產(chǎn)酸的影響Fig.2 Influence of organic nitrogen source on acid-producing

2.1.3 無(wú)機(jī)氮源對(duì)檸檬酸發(fā)酵的影響 從圖3可以看出:以NH4NO3為無(wú)機(jī)氮源時(shí),檸檬酸產(chǎn)量最高。通過(guò)方差分析,NH4NO3對(duì)檸檬酸的發(fā)酵影響極顯著。所以,黑曲霉XSY0607發(fā)酵生產(chǎn)檸檬素最好的無(wú)機(jī)氮源氮源是NH4NO3。

表1 N=12的Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)響應(yīng)值Table 1 Design and test the response value N=12 Plackett-Burman

圖3 無(wú)機(jī)氮源對(duì)產(chǎn)酸的影響Fig.3 Effects of inorganic nitrogen sources on acid-producing

2.1.4 生長(zhǎng)因子對(duì)檸檬酸發(fā)酵的影響 七種生長(zhǎng)因子對(duì)檸檬酸發(fā)酵結(jié)果如圖4所示。

圖4 生長(zhǎng)因子對(duì)產(chǎn)酸的影響Fig.4 Effect of growth factors on the acid production

從圖4可以看出:牛肉膏和蛋白胨的比例不同,黑曲霉XSY0607發(fā)酵產(chǎn)生檸檬酸的產(chǎn)量差別很大,當(dāng)牛肉膏∶蛋白胨為6∶0時(shí),檸檬酸產(chǎn)量最大,而當(dāng)牛肉膏∶蛋白胨為0∶6時(shí),檸檬酸產(chǎn)生量很小。通過(guò)方差分析,0.6%的牛肉膏對(duì)檸檬酸的發(fā)酵影響顯著。所以0.6%的牛肉膏是最佳生長(zhǎng)因子。

2.2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基

應(yīng)用二水平的Plackett-Burman(簡(jiǎn)稱PB)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基各個(gè)組成成分:水稻秸稈粉、蛋白胨、NH4NO3、牛肉膏、MgSO4、KH2PO4和FeSO4·7H2O進(jìn)行優(yōu)化,確定發(fā)酵培養(yǎng)基各組成成分的濃度。本實(shí)驗(yàn)選取N=12的10因素2水平的PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1、表2和圖5,其中X4、X7、X9為空白項(xiàng),用于檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)誤差。根據(jù)常規(guī)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求高水平是低水平的1.5倍。

從表2可以看出:通過(guò)極差分析RX1>RX2>RX3>RX6>RX8>RX10>RX5,因此黑曲霉XSY0607發(fā)酵培養(yǎng)基中不同成分對(duì)檸檬酸發(fā)酵的影響順序?yàn)樗窘斩?蛋白胨>NH4NO3>KH2PO4>MgSO4>FeSO4·7H2O>牛肉膏。

表2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及顯著性Table 2 Experimental design factors and their Plackett-Burman significance

從表2和圖5可以看出:發(fā)酵培養(yǎng)基的組分中水稻秸稈粉、蛋白胨、牛肉膏、MgSO4和FeSO4·7H2O表現(xiàn)為正效應(yīng),而NH4NO3和KH2PO4表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)。把每個(gè)成分的高點(diǎn)組合在一起就組成了黑曲霉XSY0607發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳配方(%):水稻秸稈粉 6%、蛋白胨 4.5%、NH4NO30.5%、牛肉膏 0.75%、KH2PO40.15%、MgSO40.045%和FeSO4·7H2O 0.0015%。

圖5 培養(yǎng)基各組分不同水平對(duì)發(fā)酵的影響Fig.5 Influence of components of different levels on the fermentation medium

對(duì)優(yōu)化后的檸檬酸發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行檸檬酸生產(chǎn)實(shí)驗(yàn),做三個(gè)平行,所得的檸檬酸產(chǎn)量為83.6mg/mL,比初始的發(fā)酵培養(yǎng)基檸檬酸產(chǎn)量提高了31.83%。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)得出黑曲霉XSY0607發(fā)酵檸檬酸的最佳碳源為水稻秸稈、最佳有機(jī)氮源為蛋白胨、最佳無(wú)機(jī)氮源為NH4NO3、最佳生長(zhǎng)因子為牛肉膏。通過(guò)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)得到黑曲霉XSY0607發(fā)酵檸檬素的最佳培養(yǎng)基配方為:水稻秸稈粉 6%、蛋白胨 4.5%、NH4NO30.5%、牛肉膏 0.75%、KH2PO40.15%、MgSO40.045%和FeSO4·7H2O 0.0015%。同時(shí)還可得出黑曲霉XSY0607發(fā)酵培養(yǎng)基中不同成分對(duì)檸檬酸發(fā)酵的影響順序?yàn)樗窘斩?蛋白胨>NH4NO3>KH2PO4>MgSO4>FeSO4·7H2O>牛肉膏。使用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵實(shí)驗(yàn),檸檬酸產(chǎn)量達(dá)到83.6mg/mL,比用初始發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵檸檬酸產(chǎn)量提高了31.83%。

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Study on the fermentation medium optimization based on cellulose as raw material to produce citric acid byAspergillusnigerSY0607

SUN Ke1,ZHOU Feng-Xia2

(1.Department of Bioengineering,Xuzhou Engineering Vocational and Technical College,Xuzhou 221006,China;2.Xuzhou at the Central Agricultural Broadcasting School,Xuzhou 221000,China)

An optimal process about citric acid deep submerged fermentation withAspergillusnigerXSY0607 was gained as follows:the optimal culture medium was consisted with rice straw,peptone,NH4NO3and beef extract as carbon source,organic,inorganic nitrogen source and growth factor,respectively. Plackett-Burman design was applied for final culture medium of citric acid deep submerged fermentation,and the ratio of the recipe,which was consisted by rice straw,peptone,NH4NO3,beef extract,KH2PO4,KH2PO4and FeSO4·7H2O,was 6%,4.5%,0.5%,0.75%,0.15%,0.045% and 0.0015%,respectively. Range analysis showed the influence of the components to the citric acid fermentation. As a result,the effect for the fermentation,from strong to weak was rice straw,peptone,NH4NO3,KH2PO4,MgSO4,FeSO4·7H2O and beef extract. Medium was optimized using citric acid fermentation tests conducted,citric acid production was 83.6mg/mL,increasing 31.83% compared with level before optimization.

Aspergillusniger;rice straw;submerged fermentation;medium optimization

2014-07-23

孫科(1977-)，男，本科，講師，主要從事生物發(fā)酵研究。

徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院2013年立項(xiàng)課題(2013B07)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)11-0172-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.026