應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化葉黃素降解發(fā)酵培養(yǎng)基

楊雪鵬,趙 越,胡仙妹,馬 科,毛多斌

(鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州 450001)

應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化葉黃素降解發(fā)酵培養(yǎng)基

楊雪鵬,趙 越,胡仙妹,馬 科,毛多斌

(鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州 450001)

利用響應(yīng)面分析法對Pantoeadispersa(Y08)菌降解葉黃素產(chǎn)香的培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化。采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計,選定KH2PO4、蔗糖和混合氮源(酵母膏∶天門冬酰胺=2∶1)3個關(guān)鍵因子為響應(yīng)因子,以葉黃素降解率為響應(yīng)值建立多元二次回歸方程,在分析各個因素的顯著性和交互作用后,確定了Pantoeadispersa菌降解葉黃素的最優(yōu)培養(yǎng)基為:蔗糖0.97%,混合氮源(酵母膏∶天門冬酰胺=2∶1)1.38%,KH2PO40.15%,葉黃素降解率為80.03%,與理論預(yù)測值基本吻合,比優(yōu)化前提高140.67%。

培養(yǎng)基優(yōu)化,葉黃素降解,Box-Behnken設(shè)計,響應(yīng)面法

葉黃素也稱黃體素,是一種含氧類胡蘿卜素,廣泛存在于果蔬、鮮花、煙草等植物中,使其具有鮮艷的顏色和極強(qiáng)的抗自由基能力[1-4]。在有些植物中,葉黃素是香味物質(zhì)的前體物,葉黃素的降解既有重要的生物學(xué)意義又有重要的應(yīng)用價值。例如,葉黃素的降解可產(chǎn)生β-紫羅蘭酮等芳香物質(zhì),這些芳香物質(zhì)是植物花香和果香的來源[5]。在食品與果蔬加工中,葉黃素的降解對產(chǎn)品感官品質(zhì)、色澤等的影響很大。比如,在烤煙成熟和燃燒過程中,葉黃素可降解轉(zhuǎn)化為β-大馬酮、巨豆三烯酮等,這些化合物呈現(xiàn)出煙草特有的香味[6-10]。葉黃素亦可通過酶的降解產(chǎn)生β-紫羅蘭酮、β-大馬酮等香味物質(zhì)[11],它們具有濃郁的花香和果香,且香氣閾值很低,在制備香精香料方面具有重要價值[12]。

目前關(guān)于葉黃素降解的報道主要集中于物理降解和化學(xué)降解,而生物降解法尤其是利用酶和微生物來降解葉黃素產(chǎn)生香味物質(zhì)的研究還很少[13-17]。生物法降解葉黃素與物理降解和化學(xué)降解相比較具有以下兩個方面的顯著優(yōu)點(diǎn):首先生物法降解利用了酶催化的專一性,得到成分相對單一的香味物質(zhì)。其次,生物法降解得到的香味物質(zhì)被認(rèn)定為“天然成分”[18]。生物降解葉黃素將越來越受到大家的關(guān)注。

為了進(jìn)一步提高葉黃素降解率,促進(jìn)香味物質(zhì)的生成,本研究以葉黃素降解菌PantoeadispersaY08為實(shí)驗(yàn)菌株,應(yīng)用響應(yīng)面分析法對發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化,以葉黃素降解率為響應(yīng)值,探討了發(fā)酵培養(yǎng)基中影響葉黃素降解率的各種關(guān)鍵因素及其相互作用,最終得到培養(yǎng)基的最佳濃度配比。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株 由前期實(shí)驗(yàn),通過在萬壽菊中篩選得到一株高效降解葉黃素的菌株,經(jīng)鑒定為Pantoeadispersa(簡稱Y08),后于-20℃冰箱甘油管保存?zhèn)溆?斜面培養(yǎng)基 蛋白胨10.0g、酵母膏5.0g、NaCl 1.0g、瓊脂20.0g、蒸餾水1L、pH=6.0;基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖10.0g、酵母膏5.0g、MgSO40.1g、葉黃素0.01g、Tween-80 1.0mL、蒸餾水1L、pH=6.0。

LC-MS聯(lián)用儀 美國賽默飛世爾公司;HF Mega BE-C18柱 美國安捷倫科技公司;高速冷凍離心機(jī) 德國Herolab公司;單人雙面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司;精密電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;溶劑微孔過濾膜有機(jī)系 天津津騰;50L立式圓形壓力蒸汽滅菌鍋 上海醫(yī)用核子儀器廠;pH酸度計 上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 種子培養(yǎng):將篩選得到的降解葉黃素Y08菌株接種于斜面培養(yǎng)基活化24h,接種于裝液50mL/250mL 三角瓶中,28℃,150r/min 避光培養(yǎng)24h即為種子液;發(fā)酵培養(yǎng):按2%的接種量將種子液接種于裝液量為100mL/250mL的三角瓶中,28℃,150r/min避光培養(yǎng)96h。

1.2.2 生物量的測定 取10mL發(fā)酵液3000r/min離心,洗滌2次,用蒸餾水轉(zhuǎn)移菌體至稱量瓶中烘干至恒重M。

生物量(g/L)=M×100

1.2.3 葉黃素測定方法

1.2.3.1 發(fā)酵液預(yù)處理方法 發(fā)酵液在避光條件下,12000r/min離心10min,取上清液,加入等體積二氯甲烷反復(fù)萃取3次,得葉黃素的提取物,加無水Na2SO4干燥過夜,過0.45μm的有機(jī)系膜,待LC-MS分析,并有等體積不接菌培養(yǎng)基作為對照[19]。

1.2.3.2 LC-MS分析的條件 液相條件:選擇Thermo C18柱,常溫,進(jìn)樣壓力化學(xué)電離源(APCI)作為離子源;毛細(xì)管加熱溫度:350℃;電噴霧電壓,5kV;離子源鞘氣(N2):30Arb;離子源輔助氣(N2):10Arb;碰撞氣體為高純氦氣(>99.999%);掃描范圍:m/z 200～2000全掃描;掃描速率:1scan/s。

1.2.3.3 內(nèi)標(biāo)的配制 用蘇丹紅I號作為內(nèi)標(biāo)。準(zhǔn)確稱取0.02096g的蘇丹紅I號,用二氯甲烷定容至500mL作為內(nèi)標(biāo)液備用。

1.2.3.4 葉黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 配制的6個梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液根據(jù)建立的色譜條件進(jìn)行LC-MS分析后,以標(biāo)樣峰面積(Ai)/內(nèi)標(biāo)峰面積(As)為縱坐標(biāo)(Y),質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.5 葉黃素降解率計算公式

1.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.1 培養(yǎng)基中碳源的優(yōu)化 在每100mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,接種2%的種子培養(yǎng)基,分別以濃度1%的葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、糊精、殼聚糖作為碳源,在28℃、150r/min發(fā)酵培養(yǎng)96h,通過LC-MS法測定葉黃素含量,計算得到葉黃素降解率。再對其添加量進(jìn)行優(yōu)化,碳源添加量分別為:0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%、5%,發(fā)酵條件及測定方法同上。

1.3.2 培養(yǎng)基中氮源的優(yōu)化 以濃度為1%的蛋白胨、酵母膏、KNO3、(NH4)2SO4、天門冬酰胺、混合碳源(酵母膏∶天門冬酰胺=2∶1、1∶1、1∶2)作為氮源,發(fā)酵條件及測定方法同上。再對其添加量進(jìn)行優(yōu)化,選取濃度為 0.5%、1%、2%、3%、4%、5%的混合氮源(酵母膏∶天門冬酰胺=2∶1),發(fā)酵條件及測定方法同上。

1.3.3 培養(yǎng)基無機(jī)鹽的優(yōu)化 在以上條件確定的情況下,分別以 0.1%的 CaCl2、KCl、MgSO4、KH2PO4、FeSO4、Na2SO4的金屬離子為無機(jī)鹽離子,其余條件同上。再對其添加量進(jìn)行優(yōu)化,添加量分別設(shè)為 0.01%、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%,發(fā)酵條件及測定方法同上。

1.3.4 響應(yīng)面法確定最佳培養(yǎng)降解條件 參考文獻(xiàn)[20],實(shí)驗(yàn)采用Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計,通過單因素實(shí)驗(yàn),確定Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)的各因素水平。本實(shí)驗(yàn)設(shè)蔗糖、混合氮源,KH2PO4三個因素,每個因素設(shè)三個水平,進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn),尋找最佳發(fā)酵培養(yǎng)基成分。本實(shí)驗(yàn)用應(yīng)用Design-Expert軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式擬合回歸后,得到回歸方程,進(jìn)而繪制三維響應(yīng)面圖。響應(yīng)面因素水平設(shè)計見表1。

表1 Box-Benhnken設(shè)計各因素及水平Table 1 Factors and levels of Box-behnken design for response surface methodology(RSM)

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

應(yīng)用Design-Expert軟件中的RSREG(Response Surface Regression)程序進(jìn)行回歸計算,并對回歸方程進(jìn)行方差分析和系數(shù)顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按照1.2.3.4方法進(jìn)行檢測,結(jié)果如圖1所示。

圖1 葉黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Lutein standard curve

如圖1所示,得出線性回歸方程Y=0.0602+11.275X,相關(guān)系數(shù)R2=0.9997,結(jié)果表明葉黃素濃度在3.383～338.3μg/mL之間,與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 碳源對降解葉黃素的影響 考察葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、糊精、殼聚糖對Y08菌株降解葉黃素能力的影響。采用基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基,分別添加1%不同種類的碳源,28℃、150r/min培養(yǎng)96h后測定生物量和葉黃素降解率,結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出,以蔗糖為碳源時葉黃素降解率相對較高,故選用蔗糖作碳源。

圖2 不同碳源對生物量和葉黃素降解率的影響Fig.2 Effect of different carbon sources on biomass and degradation of lutein

2.2.2 碳源濃度對降解葉黃素的影響 不同蔗糖濃度對Y08菌株降解葉黃素的影響,結(jié)果如圖3所示,當(dāng)蔗糖濃度為1%時,葉黃素降解率最高。隨著蔗糖添加量的繼續(xù)增加,反而不利于葉黃素降解,其原因可能是蔗糖添加量較大時,產(chǎn)生底物抑制現(xiàn)象,從而導(dǎo)致葉黃素降解率下降。

圖3 蔗糖濃度對生物量和葉黃素降解率的影響Fig.3 Effect of sucrose concentration on biomass and degradation of lutein

2.2.3 氮源對降解葉黃素的影響 不同氮源對葉黃素的降解均有一定程度的促進(jìn)作用,其中有機(jī)氮源酵母膏、天門冬酰胺對葉黃素降解具有明顯的促進(jìn)作用。無機(jī)氮源中的KNO3、(NH4)2SO4對菌體的生長也有一定的作用,但效果不如有機(jī)氮源明顯。當(dāng)以混合氮源為唯一氮源時,不同比例的混合碳源比單一碳源對葉黃素降解均有更明顯的促進(jìn)作用。以YE∶LA=2∶1為最佳混合氮源,可能是該比例混合氮源中含有更豐富的氨基酸種類,從而促進(jìn)葉黃素的降解。

圖4 不同氮源對生物量和葉黃素降解率的影響Fig.4 Effect of different nitrogen sources on biomass and degradation of lutein

2.2.4 氮源濃度對降解葉黃素的影響 菌株在不同濃度氮源的培養(yǎng)基中發(fā)酵后生物量和葉黃素降解率的測定結(jié)果(圖5)表明,氮源濃度過高或不足都會影響到菌體的生長和葉黃素的降解,當(dāng)濃度過低時,很可能是由于營養(yǎng)物質(zhì)不充分而未能給菌體提供有利的降解條件,而過高則又會抑制葉黃素降解酶的產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)?shù)礉舛葹?.5%時葉黃素降解率最高。

圖5 氮源濃度對生物量和葉黃素降解率的影響Fig.5 Effect of nitrogen concentration on biomass and degradation of lutein

2.2.5 無機(jī)鹽對降解葉黃素的影響 從圖6可知,選用KH2PO4葉黃素降解率最高,而選用FeSO4時,葉黃素降解率最低。原因可能是KH2PO4能有效減小H+梯度對細(xì)胞的毒害作用,能夠使菌體更好的生長。

圖6 不同無機(jī)鹽對生物量和葉黃素降解率的影響Fig.6 Effect of different inorganic salts on biomass and degradation of lutein

2.2.6 磷酸二氫鉀濃度對降解葉黃素的影響 圖7可知KH2PO4添加量在0.01%～0.15%時,葉黃素降解率隨KH2PO4量增加逐漸升高,0.15%濃度時葉黃素降解率最高。隨著KH2PO4濃度繼續(xù)增加,葉黃素降解率反而逐漸下降。其原因可能是高濃度的KH2PO4對菌體生長有一定抑制作用,從而影響葉黃素的降解率。

表3 回歸模型方差分析Table 3 ANOVA for regression model

圖7 無機(jī)鹽濃度對生物量和葉黃素降解率的影響Fig.7 Effect of inorganic salt concentration on biomass and degradation of lutein

2.3 響應(yīng)面法(RSM)優(yōu)化過程

響應(yīng)面分析法是一種尋找多因素系統(tǒng)中最優(yōu)條件的數(shù)理統(tǒng)計方法,其中最常見的是采用Box-Behnken設(shè)計原理,根據(jù)此原理,以葉黃素降解率為響應(yīng)值,設(shè)計了3因素3水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn) 其具體實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

應(yīng)用Design-Expert軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式擬合回歸后,得到以下回歸方程:

Y=+79.74+0.25A-3.65B+0.005C+2.88AB+0.73AC+0.070BC-3.97A2-7.73B2-4.12C2

回歸方程的方差分析結(jié)果見表3,該方程表達(dá)了葉黃素降解率與所選的3個因素之間的關(guān)系。當(dāng)“Prob>F”值<0.01時,表示該項(xiàng)指標(biāo)極顯著,當(dāng)“Prob>F”值<0.05時,表示該項(xiàng)指標(biāo)顯著?；貧w方程的決定系數(shù)(R2)為0.9720,信噪比(Adequate. Precision)為23.954。這表明方程的擬合度與可信度均很高,實(shí)驗(yàn)誤差較小,能夠?qū)θ~黃素降解過程進(jìn)行預(yù)測與分析。整體模型的“Prob>F”值<0.01,表明該二次方程模型極顯著?；旌系磳杲到馊~黃素的影響極顯著,蔗糖和KH2PO4影響不顯著,蔗糖與混合氮源交互作用影響極顯著。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果Table 2 Results of Box-Behnken design

采用Design-Expert軟件繪制三維響應(yīng)曲面圖(見圖8)。圖8直觀地反映了各因素交互作用對響應(yīng)值的影響,其中蔗糖和混合氮源交互作用顯著,混合氮源與KH2PO4交互作用不顯著,蔗糖與KH2PO4交互作用不顯著。

圖8 各因素交互影響葉黃素降解率的響應(yīng)曲面圖Fig.8 Response surface plot and contour diagram for interaction of various factors on degradation of lutein

通過圖8中的響應(yīng)面立體圖可以看出,響應(yīng)值存在最大值,應(yīng)用Design-Expert軟件求解方程,得到葉黃素降解最優(yōu)培養(yǎng)基組成為蔗糖0.97%,混合氮源(酵母膏∶天門冬酰胺=2∶1)1.38%,KH2PO40.15%,葉黃素降解率的預(yù)測值為80.18%。

按優(yōu)化后的條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),平行實(shí)驗(yàn)3次,其葉黃素降解率平均為80.03%,與理論預(yù)測值基本吻合,比優(yōu)化前提高140.67%,這說明響應(yīng)面法可以有效地優(yōu)化葉黃素降解培養(yǎng)基,從而提高葉黃素降解率。

3 結(jié)論

應(yīng)用Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計方法,優(yōu)化了Pantoea dispersa Y08菌降解葉黃素的培養(yǎng)基。結(jié)果表明,最優(yōu)培養(yǎng)基為:蔗糖0.97%,混合氮源(酵母膏∶天門冬酰胺=2∶1)1.38%,KH2PO40.15%,培養(yǎng)基經(jīng)優(yōu)化后,葉黃素降解率增加到80.03%,較優(yōu)化前有顯著提高。

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Optimization of fermentation medium for lutein degradation applying response surface methodology

YANG Xue-peng,ZHAO Yue,HU Xian-mei,MA Ke,MAO Duo-bin

(Food and Bioengineering College,Zhengzhou University of Light Industry,Zhengzhou 450001,China)

Optimization of fermentation medium using for lutein degradation to form important aroma compounds withPantoeadispersaY08 strain was performed employing the response surface analysis(RSA)method. Based on single factor experiment,three critical factors(the content of sucrose,mixed nitrogen sources and KH2PO4)were selected as response factors. The quadric regression equation was established according to the lutein degradation yield. As a result,the optimum fermentation medium was composed of sucrose 0.97%,mixed nitrogen sources(yeast extract∶asparagine=2∶1)1.38% and KH2PO40.15%. Under the situation,the highest yield of degradation of lutein was predicted to be 80.03%. After optimization,the lutein degradation yield was increased by 140.67%. The experimental values were in according with the predicted values.

fermentation medium optimization;degradation of lutein;Box-Behnken design;response surface methodology

2014-07-11

楊雪鵬(1973-)，男，博士，副教授，研究方向：煙草工程與酶工程。

國家自然科學(xué)基金(21276084);煙草工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室課題。

TS201.3

A

1002-0306(2015)11-0167-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.025