PCR-DGGE技術分析混菌發(fā)酵乳中馬克斯克魯維酵母與乳酸菌的相互作用

范 維,李 路,姜鐵民,張 彧,閔偉紅,陳歷俊,*

(1.大連工業(yè)大學,遼寧大連 116034；2.吉林農業(yè)大學,吉林長春 130118；3.北京三元食品股份有限公司,北京 100076)

PCR-DGGE技術分析混菌發(fā)酵乳中馬克斯克魯維酵母與乳酸菌的相互作用

范 維1,3,李 路2,3,+,姜鐵民3,張 彧1,閔偉紅2,陳歷俊3,*

(1.大連工業(yè)大學,遼寧大連 116034；2.吉林農業(yè)大學,吉林長春 130118；3.北京三元食品股份有限公司,北京 100076)

利用變性梯度凝膠電泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,DGGE)技術,對混菌發(fā)酵及貯藏過程中馬克斯克魯維酵母與乳酸菌之間的相互作用進行分析,進而對整個過程中微生物優(yōu)勢菌群及其穩(wěn)定性進行跟蹤監(jiān)測。結果表明:混菌發(fā)酵及貯藏過程中微生物組成比較穩(wěn)定,優(yōu)勢菌為嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus,ST);發(fā)酵過程中,馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)的添加對乳酸菌生長起到促進作用,尤其是對保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus,LB)效果顯著,貯藏期間該作用轉變?yōu)橐种?整個過程乳酸菌的存在對酵母菌的生長具有一定的抑制作用。該研究可為深入探討乳酸菌與酵母菌共同發(fā)酵機理及新型發(fā)酵乳制品的開發(fā)提供理論基礎。

混菌發(fā)酵,變性梯度凝膠電泳,菌群分析,馬克斯克魯維酵母

眾所周知,傳統(tǒng)發(fā)酵劑是由保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌組成的,兩者之間存在共生作用。長久以來,酸奶中的酵母菌被認為是腐敗菌,是引起酸奶變質的主要原因[1]。隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)利用酵母菌特有的產(chǎn)醇、產(chǎn)氣特性與乳酸菌共同發(fā)酵乳,其制品不但具有特殊清香味而且還保留了酸乳獨特的營養(yǎng)價值[2-3]。因此,酵母菌作為一種新型產(chǎn)品將具有廣闊市場前景。目前,關于酵母菌與乳酸菌之間相互影響的研究主要采用分離培養(yǎng)鑒定[4]、經(jīng)典平板計數(shù)[5]等方法,以含有的微生物細胞數(shù)量為指標,對于發(fā)酵乳中含有的微生物組成及其優(yōu)勢菌群變化不能進行全面分析,并且操作過程繁瑣、費時。近年來,分子生物學技術在微生物混合培養(yǎng)體系中的應用極大地提高了分析樣品的靈敏性和準確性[6-9]。

DGGE技術是一種分子生物學研究中常用的分析方法,基于細菌16S rDNA基因中可變區(qū)域堿基組成差異,而將不同細菌進行快速檢測和鑒定,不但能避免耗時的平板劃線菌種分離,更能快速準確地進行復雜微生物區(qū)系菌群結構演替和優(yōu)勢菌群分析[10]。本研究將DGGE技術引入混菌發(fā)酵乳這一簡單生態(tài)系統(tǒng)中,對發(fā)酵乳中微生物菌群組成穩(wěn)定性、優(yōu)勢菌群及菌群間相互作用進行分子研究,并用分離培養(yǎng)方法進行對比驗證,為混合型發(fā)酵產(chǎn)品的品質控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種 保加利亞乳桿菌菌粉(Lactobacillusbulgaricus,LB)、嗜熱鏈球菌菌粉(Streptococcusthermophilus,ST) 丹尼斯克菌種有限公司;馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus) 北京三元食品股份有限公司實驗室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 全脂乳粉 新西蘭西部乳業(yè)有限公司。

1.1.3 主要試劑及儀器 丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、去離子甲酰胺、尿素、四甲基乙二胺(TEMED)、過硫酸銨 Sigma公司;DNA提取、PCR擴增等分子操作所用試劑、酶及DNA Marker E 賽百盛生物技術公司;玻璃珠 北京索萊寶生物公司;PCR所用引物 諾賽基因公司;GoldViewTM核酸染料 賽百盛生物技術公司;瓊脂糖 基因科技有限公司。

光學顯微鏡 BX51,奧林巴斯公司;基因擴增儀 S1000TMThermal CyclerBio-Rad公司;變性梯度凝膠電泳儀 DcodeTM,Bio-Rad公司;凝膠成像系統(tǒng) Alphalmager HP,Proteinsimple公司;電泳儀 Kyso4033-DYYⅢ型電泳槽,Bio-Rad公司;冷凍離心機 3K-15型,sigma公司;微量高速離心機 D-37520 Osterode,Thermo公司等。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備及采集 準備三份12%的全脂乳培養(yǎng)基,分別命名A、B、C。A培養(yǎng)基中按106cfu/mL接菌量接種乳酸菌(LB∶ST=1∶1),按乳酸菌∶酵母菌為30∶1的比例接種馬克斯克魯維酵母;B培養(yǎng)基按以上接菌量只接入LB和ST;C培養(yǎng)基按以上比例只接入馬克斯克魯維酵母。將接種好的三份12%全脂乳培養(yǎng)基于35℃條件下進行恒溫發(fā)酵,發(fā)酵期間每間隔1h分別取一次樣,直至凝乳完成(約6h)。后將三份培養(yǎng)基轉至4℃條件下進行貯藏,分別于第1、3、5、7、10、14、21d進行取樣。

1.2.2 形態(tài)觀察 取全脂乳培養(yǎng)基中培養(yǎng)的LB單菌、ST單菌、馬克斯克魯維酵母單菌及混菌發(fā)酵6h的混合菌進行革蘭氏染色,在光學顯微鏡下觀察樣品中微生物個體形態(tài)并顯微照相。

1.2.3 總DNA的提取 分別取1mL無水乙醇、1mL氨水、1mL石油醚加入到5.00g發(fā)酵乳中,混合均勻,10000r/min離心10min,棄上清。沉淀菌體用0.5mL滅菌雙蒸水重懸,將重懸菌體轉移到2mL離心管中,室溫下12000r/min離心1min,棄上清,在漩渦混合器上快速振蕩分散菌體沉淀。菌體用300μL破菌緩沖液重懸,加0.3g玻璃珠及200μL酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1),高速振蕩3min。加入200μL 1×TE緩沖溶液(pH=8),快速振蕩,12000r/min離心5min。室溫下將水相轉移到一個干凈的離心管中,加入1mL無水乙醇,顛倒混勻。室溫12000r/min離心3min,去上清,沉淀用0.4mL TE緩沖溶液重懸。再向其中加入10μL 4mol/L的乙酸銨及1mL無水乙醇,顛倒混勻,12000r/min離心3min,棄上清。干燥沉淀,DNA用50μL TE 重懸,即得總DNA。破菌緩沖液的配制方法:Tritonx-100 20mL,SDS 10g,1mol/L(pH8.0)Tris-HCL 10mL,0.5mol/L EDTA 2mL,NaCl 5.85g,加雙蒸水定容至1L,至于4℃冰箱內備用。

1.2.4 PCR擴增 第一輪PCR擴增:細菌用引物27F,5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和引物1492R,5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′[11]進行16S rDNA全長擴增。真菌用引物NL1,5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′和引物NL4,5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′[12]進行26S rDNA D1/D2區(qū)擴增。50μL反應體系:PCR熒光染料(Dye)5μL,10×PCR buffer 5μL,DNTPs 1μL,上、下游引物各1μL,模版DNA 2μL,Taq酶0.5μL ,ddH2O 34.5μL。擴增反應程序:95℃,5min;95℃,45s;55℃,45s;72℃,1min,30個循環(huán);最終72℃,10min。

第二輪PCR擴增:細菌用引物gc-338F,5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGG GGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′和引物518R,5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′[13]進行16S rDNA V3區(qū)擴增。真菌用引物gc-NL1,5′-GCGGGCCGCGCGACCGCCGGGACGCGCGAGCCGGCGGCGCGG CGGGCCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′和引物LS2,5′-ATT CCC AAA CAA CTC GAC TC-3′[14]進行26S rDNA D1區(qū)擴增。50μL反應體系:PCR熒光染料(Dye)5μL,10×PCR buffer 5μL,DNTPs 1μL,上、下游引物各1μL,模版DNA 2μL,Taq酶0.5μL ,ddH2O 34.5μL。細菌擴增反應程序:95℃,5min;94℃,30s;56℃,30s;72℃,1min,30個循環(huán);最終72℃,7min。真菌擴增反應程序:95℃,5min;95℃,60s;52℃,45s;72℃,60s,30個循環(huán);最終72℃,7min。

1.2.5 變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析 采用Bio-Rad DcodeTM,DGGE電泳儀對樣品16S rDNA V3區(qū)擴增產(chǎn)物和26S rDNA D1區(qū)擴增產(chǎn)物進行電泳。使用8%聚丙烯酰胺凝膠,細菌和真菌均采用35%～55%[100%變性劑含有7mol/L 尿素和40%(v/v)甲酰胺]的變性梯度,在1×TAE電泳緩沖液中先200V預電泳5min,然后85V恒壓電泳15h。GoldViewTM染色30min后放入凝膠成像儀內照相。

1.2.6 條帶深淺分析 經(jīng)凝膠成像儀照出的照片用Alpha view軟件進行條帶密度分析。該軟件可以根據(jù)條帶亮度、光密度值來判斷表達量的高低,且條帶亮度會以峰值表現(xiàn)出來,峰面積大小與表達量大小呈正比。

2 結果與分析

2.1 形態(tài)觀察

對在12%全脂乳培養(yǎng)基中進行傳代培養(yǎng)的微生物進行革蘭氏染色,其鏡鑒結果如圖1:嗜熱鏈球菌為兼性厭氧或微好氧的革蘭氏陽性菌,以兩個卵圓型為一對的球菌連成約0.7nm到0.9nm的長鏈。保加利亞乳桿菌屬于兼性厭氧性革蘭氏陽性菌,菌體長2～9μm,寬0.5～0.8μm,單個體呈長桿狀或成鏈,兩端鈍圓,不具運動性,也不會產(chǎn)生孢子。馬克斯克魯維酵母是單細胞真核微生物,細胞的形態(tài)為橢圓形,比細菌的單細胞個體大,無鞭毛,不能游動,會產(chǎn)生孢子。

圖1 混菌發(fā)酵乳中微生物光學顯微鏡圖Fig.1 Microscoph of microbiological in fermented milk注:A：ST菌;B：LB菌;C：馬克斯克魯維酵母菌; D：混菌發(fā)酵中各菌形態(tài)。

2.2 PCR擴增結果

圖2 發(fā)酵過程中細菌16S rDNA擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoresis photo of PCR products of 16S rDNA during fermentation注:M代表Marker E;數(shù)字代表發(fā)酵時間(h); +代表含有馬克斯克魯維酵母;—代表不含 馬克斯克魯維酵母;ST代表純嗜熱鏈球菌; LB代表純保加利亞乳桿菌;N代表陰性對照。

2.2.1 第一輪擴增結果 細菌16S rDNA全長擴增結果經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后(圖2～圖3),獲得大小在1500bp左右的全長擴增片段,真菌26S rDNA D1/D2區(qū)擴增(圖4)后獲得大小在600bp左右的片段,均與所需要的片段大小相符合。從圖中可以看出所有樣品都有比較清晰的擴增條帶,適合進行第二輪PCR擴增。

圖3 貯藏過程中細菌16S rDNA擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electrophoresis photo of PCR products of 16S rDNA during storage注:M代表Marker E;數(shù)字代表貯藏時間(d); +代表含有馬克斯克魯維酵母; —代表不含馬克斯克魯維酵母;N代表陰性對照。

圖4 發(fā)酵過程中酵母菌26S rDNA D1/D2 區(qū)擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Electrophoresis photo of PCR products of 26S rDNA D1/D2 during fermentation注:M代表Marker E;數(shù)字代表發(fā)酵時間(h); +代表含有乳酸菌;—代表不含乳酸菌; N代表陰性對照。

圖5 發(fā)酵過程中細菌16S rDNA V3區(qū)擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.5 Electrophoresis photo of PCR products of 16S rDNA V3 during fermentation注:M代表Marker E;數(shù)字代表發(fā)酵時間(h); +代表含有馬克斯克魯維酵母;—代表不含 馬克斯克魯維酵母;ST代表純嗜熱鏈球菌; LB代表純保加利亞乳桿菌;N代表陰性對照。

2.2.2 第二輪擴增結果 細菌16S rDNA V3可變區(qū)的PCR擴增結果經(jīng)過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測,圖5、圖6中顯示各個樣品均擴增出約為230bp的條帶,真菌26S rDNA D1區(qū)擴增出的條帶約為250bp,如圖7,均符合預期擴增效果[14],而且條帶亮度也較好,無非特異性條帶出現(xiàn),適用于DGGE分析。

圖6 貯藏過程中細菌16S rDNA V3區(qū)擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.6 Electrophoresis photo of PCR products of 16S rDNA V3 during storage注:M代表Marker E;數(shù)字代表貯藏時間(d); +代表含有馬克斯克魯維酵母;—代表不含 馬克斯克魯維酵母;N代表陰性對照。

圖7 發(fā)酵過程中酵母菌26S rDNA D1區(qū)擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.7 Electrophoresis photo of PCR products of 26S rDNA D1 during fermentation注:M代表Marker E;數(shù)字代表發(fā)酵時間(h); +代表含有乳酸菌;—代表不含 乳酸菌;N代表陰性對照。

2.3 PCR-DGGE結果分析

2.3.1 乳酸菌參考菌株 DGGE 圖譜標準模型的建立 將嗜熱鏈球菌單菌和保加利亞乳桿菌單菌分別提取DNA,經(jīng)過2次PCR后得到的產(chǎn)物以15μL的上樣量進行變性梯度凝膠電泳(DGGE)分離,獲得標準模型如圖8:由此標準模型可知樣品中上方條帶代表LB,下方條帶代表ST。

圖8 參考菌株 DGGE 圖譜標準模型Fig.8 DGGE profiles of PCR products of 16S rDNA V3 from reference strains as ladder注:Y代表樣品。

2.3.2 發(fā)酵過程中馬克斯克魯維酵母對乳酸菌生長影響 將發(fā)酵過程中細菌16S rDNA V3可變區(qū)的PCR擴增產(chǎn)物以15μL的上樣量進行DGGE分離,結果如圖9所示。

圖9 發(fā)酵期間乳酸菌DGGE圖譜Fig.9 DGGE analysis of lactobacillus during fermentation注:數(shù)字代表發(fā)酵時間(h);+代表含有 馬克斯克魯維酵母;—代表不含馬克斯克魯維酵母; 上方條帶代表LB;下方條帶代表ST。

從圖中可以看出,整個發(fā)酵過程樣品始終含有兩條帶,與混菌發(fā)酵初始只添加兩種乳酸菌的事實相符合,說明該產(chǎn)品質量比較穩(wěn)定。從表1中可以看出,隨著發(fā)酵時間的延長兩條帶峰面積逐漸變大,說明發(fā)酵過程中兩種菌都在分裂生長。整個發(fā)酵過程,兩種發(fā)酵乳中,ST菌作為絕對優(yōu)勢菌其條帶均較LB菌條帶深,尤其在最初發(fā)酵2h內,該結果與Pette[15]等人研究結果相似,產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因是混菌發(fā)酵過程中乳酸菌生長分成兩階段:培養(yǎng)初期,由于在LB菌作用下游離出來的氨基酸的刺激作用,ST菌首先快速生長,ST菌的快速生長使乳中大量氧氣被除去的同時積累了較多的乳酸,致使ST菌的生長變慢,而后耐酸性的LB菌受ST菌產(chǎn)生的各種成分的刺激,而大量增殖起來[15]。從表1、圖9中均可看出,含有酵母菌條帶的峰面積普遍較不含酵母菌條帶的峰面積大且顏色深,說明馬克斯克魯維酵母對乳酸菌的生長起到促進作用。這種現(xiàn)象在LB菌上尤其明顯,含酵母菌發(fā)酵乳中LB從2h開始條帶變深,而不含酵母菌發(fā)酵乳從3h開始條帶變深,說明酵母菌使LB提前進入對數(shù)生長期,即馬克斯克魯維酵母菌主要對乳酸菌中的LB起到促進作用。

表1 發(fā)酵期間乳酸菌DGGE圖譜條帶峰面積Table 1 DGGE Band peak area of lactobacillus during fermentation

表2 發(fā)酵期間酵母菌DGGE圖譜條帶峰面積Table 2 DGGE Band peak area of Kluyveromyces marxianus during fermentation

表3 貯藏期間乳酸菌DGGE圖譜條帶峰面積Table 3 DGGE Band peak area of lactobacillus during storage

2.3.3 發(fā)酵過程中乳酸菌對酵母菌生長的影響 將發(fā)酵過程中真菌26S rDNA D1區(qū)的PCR擴增產(chǎn)物以15μL的上樣量進行DGGE分離,結果如圖10所示。

圖10 發(fā)酵期間馬克斯克魯維酵母菌DGGE圖譜Fig.10 DGGE analysis of Kluyveromyces marxianus during fermentation注:數(shù)字代表發(fā)酵時間(h);+代表含有乳酸菌; —代表不含乳酸菌;條帶為馬克斯克魯維酵母。

從圖10中可以看出,發(fā)酵過程中對于真菌只分離出一條帶,這與混菌發(fā)酵乳中只加入一種酵母菌的事實相符。隨著發(fā)酵時間的延長,同一組條帶(+組各條帶相比較或-組各條帶比較)之間顏色深淺變化不顯著,與表2結果相符,說明整個發(fā)酵過程中馬克斯克魯維酵母活菌數(shù)變化不大,該結果與田裕春[16]的研究結果相似。而含有乳酸菌的條帶峰面積小于不含有乳酸菌的條帶,說明乳酸菌在一定程度上會影響馬克斯克魯維酵母的生長。該現(xiàn)象可能是由于乳酸菌產(chǎn)生的化合物如苯乳酸、4-羥基-苯乳酸、環(huán)肽對酵母菌有抑制作用[17]。

2.3.4 貯藏期間馬克斯克魯維酵母對乳酸菌生長影響 將貯藏過程中細菌16S rDNA V3可變區(qū)的PCR擴增產(chǎn)物以15μL的上樣量進行DGGE分離,結果如圖11所示。

圖11 貯藏期間乳酸菌DGGE圖譜Fig.11 DGGE analysis of lactobacillus during storge注:數(shù)字代表貯藏時間(d);+代表含有馬克斯克魯維酵母; —代表不含馬克斯克魯維酵母; 上方條帶代表LB;下方條帶代表ST。

從圖11中可以看出,隨著貯藏時間的延長代表LB和ST菌的條帶逐漸變淺變細,說明隨著貯藏時間的延長微生物數(shù)量在不斷減少。表3反映出,貯藏期間ST依然作為優(yōu)勢菌,含有酵母菌的發(fā)酵乳中ST的峰面積在前5d增加之后減小,較不含有酵母菌的發(fā)酵乳中ST峰面積下降延遲2d,說明馬克斯克魯維酵母的加入延緩ST的凋亡,而LB的峰面積從第1d起均開始減小,第7d之后顯著下降。通過LB條帶可知,含有馬克斯克魯維酵母菌的發(fā)酵乳條帶淺且峰面積小,說明酵母菌對LB的作用由發(fā)酵期間的促進作用轉變?yōu)橐种谱饔?可能的原因是馬克斯克魯維酵母是高產(chǎn)脂肪酶的酵母,會產(chǎn)生較多脂肪酸,貯藏期間過多脂肪酸堆積對乳酸菌產(chǎn)生了抑制作用[18]。整個貯藏過程中,DGGE條帶依然只含有2條帶,說明4℃條件下貯藏可以較好的抑制雜菌生長,有助于產(chǎn)品品質穩(wěn)定。

3 結論

在歐洲、亞洲和非洲一些國家含酵母菌在內的天然微生物菌叢制作的發(fā)酵乳已廣泛存在,如開菲爾乳、非洲自然發(fā)酵乳、馬奶酒等[19]。隨著微生物菌株生理生化特性研究的深入,利用菌株的優(yōu)勢互補和協(xié)同作用,由酵母菌參與的混菌發(fā)酵乳逐漸由家庭作坊式生產(chǎn)向工業(yè)化生產(chǎn)轉變。而通過研究乳酸菌與酵母菌之間相互影響,可為深入探討乳酸菌與酵母菌共同發(fā)酵機理及新型發(fā)酵乳制品的開發(fā)提供理論基礎。

本文利用分子生物學手段PCR-DGGE技術檢測混菌發(fā)酵及貯藏過程中菌群組成及優(yōu)勢菌群變化,結果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵及貯藏過程中混菌發(fā)酵乳中的菌群組成十分穩(wěn)定,嗜熱鏈球菌始終為絕對優(yōu)勢菌;在發(fā)酵期間,馬克斯克魯維酵母菌的添加對乳酸菌的生長具有一定的促進作用,尤其是對保加利亞乳桿菌促進效果顯著,使其提前進入對數(shù)生長期,而乳酸菌的存在會抑制馬克斯克魯維酵母的生長;貯藏期間馬克斯克魯維酵母對保加利亞乳桿菌的促進作用轉變?yōu)橐种?但酵母菌的存在可以延遲嗜熱鏈球菌的衰亡。

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《食品工業(yè)科技》雜志社

Application of PCR-DGGE to analyze the interaction betweenKluyveromycesmarxianusand the lactic acid bacteria during fermentation and storage process

FAN Wei1,3,LI Lu2,3,+,JIANG Tie-min3,ZHANG Yu1,MIN Wei-hong2,CHEN Li-jun3,*

(1. College of Food Science ,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China;2.College of Food Science and Engineering,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China;3. Beijing Sanyuan Foods Co. Ltd.,Beijing 100076,China)

Denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE)technique were applied to analyze the interaction betweenKluyveromycesmarxianusand the lactic acid bacteria during fermentation and storage process for tracking and monitoring advantages microbial flora and microbial stability. The results showed that during mixed fermentation and storage process,microbial composition was relatively stable,Streptococcusthermophiluswas regarded as dominant flora. Mixed fermentation process,the growth of lactic acid bacteria were promoted by addingKluyveromycesmarxianus,especiallyLactobacillusbulgaricus, while the growth of lactic acid bacteria was inhibited in storage. The whole process,yeast growth was inhibited by lactic acid bacteria. This study provided a theoretical basis for further research on the mechanism of lactic acid bacteria and yeast fermentation and development of new fermented dairy products.

mixed fermentation;DGGE;flora analysis;KluyveromycesMarx

2014-08-19 +并列第一作者。

范維(1989-)，女，在讀碩士，研究方向：食品科學與工程。 李路(1987-)，女，在讀碩士，研究方向：發(fā)酵微生物的選育與代謝調控。

*通訊作者:陳歷俊(1967-)，男，博士，教授級高工，研究方向：乳品科學。

“十二五”科技支撐計劃項目(2013BAD18B04)；國家星火計劃(2012GA600001)。

TS252.1

A

1002-0306(2015)11-0147-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.021