芡實多糖的提取、抗氧化活性及對質(zhì)粒DNA氧化損傷防護作用的研究

張 溢,孫培冬,陳桂冰,曹光群

(江南大學 食品膠體與生物技術教育部重點實驗室 化學與材料工程學院,江蘇無錫 214122)

芡實多糖的提取、抗氧化活性及對質(zhì)粒DNA氧化損傷防護作用的研究

張 溢,孫培冬*,陳桂冰,曹光群

(江南大學 食品膠體與生物技術教育部重點實驗室 化學與材料工程學院,江蘇無錫 214122)

采用纖維素酶超聲輔助法提取芡實多糖,由正交實驗獲得芡實多糖的最佳提取條件,并探究其體外抗氧化活性及對H2O2光解反應誘導質(zhì)粒pBR322 DNA損傷的保護作用。結(jié)果表明芡實多糖的最佳提取條件為:料液比1∶20(g/mL)、pH3、纖維素酶用量為原料質(zhì)量的2.0%、超聲時間5min、提取時間3h、提取溫度40℃,多糖得率為17.04%。芡實多糖清除DPPH·、羥基自由基的能力較好,IC50分別為1.78、6.96mg/mL,清除過氧化氫、超氧陰離子自由基的能力較弱,濃度為10mg/mL時,清除率分別為48.00%、20.32%。芡實多糖對抑制DNA損傷具有顯著作用,在多糖水溶液質(zhì)量濃度為0.08mg/mL時,具有最佳保護作用;在質(zhì)量濃度大于1.0mg/mL時,對質(zhì)粒DNA沒有保護作用,甚至促進了DNA的損傷。綜上所述,芡實多糖具有抗氧化及抑制DNA氧化損傷的能力。

芡實,提取,抗氧化活性,DNA氧化損傷

芡實(Semeneuryales))又名雞頭米、雞頭苞、雞頭蓮等,是睡蓮科植物芡(EuryaleferoxSalisb)種子的成熟種仁[1],它性平、味甘澀,具有有益腎固精、補脾止瀉、祛濕止帶、抗衰老等功效,是一種食療養(yǎng)生的佳品。芡實含有豐富的碳水化合物,如:淀粉、多糖、粗纖維,一般含量達到70%～80%[2]。糖類不僅可以作為能源物質(zhì),其中的活性多糖更是在提高人體免疫力、抗腫瘤活性、防治動脈硬化、抗病毒、抗氧化、抗輻射等方面起著重要作用。

正常情況下,人體內(nèi)的自由基總是處于不斷產(chǎn)生和消除的動態(tài)平衡中,但由于空氣污染、紫外線照射、疾病等原因,會造成體內(nèi)自由基產(chǎn)生過多不能及時清除,進而氧化體內(nèi)的大分子化合物,甚至損傷器官[3],如:自由基引起脂質(zhì)過氧化,可導致動脈粥樣硬化;自由基引起的DNA損傷,易誘發(fā)癌癥;自由基破壞蛋白質(zhì),導致炎癥和衰老[4]。近年來的研究發(fā)現(xiàn),多種活性多糖具有清除自由基和抗氧化作用,如:王紅麗等[5]研究了枸杞多糖的抗脂質(zhì)過氧化作用,陳克克等[6]指出了黨參多糖對質(zhì)粒DNA的氧化損傷保護作用。在已報道的文獻中,對芡實多糖的提取多采用傳統(tǒng)的熱水提取法或是超聲提取法,如劉玉鳳等[2]研究了芡實多糖的水提醇沉工藝,謝燕娟等[7]研究了超聲波法提取芡實多糖,提取率均不超過10%。此外,也有研究證明芡實多糖具有清除羥基自由基和超氧陰離子自由基的能力[8-9],但研究結(jié)果差異較大。本實驗采用纖維素酶超聲輔助法從芡實中提取多糖并提純,然后測定其體外抗氧化活性及對質(zhì)粒DNA氧化損傷的防護作用。

表1 提取多糖的因素水平表Table 1 The factors level of polysaccharide extraction

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芡實 產(chǎn)于江蘇蘇州,干燥,粉碎,過40目篩;DPPH Sigma Wolsen;七水合硫酸亞鐵 AR,宜興市展望化工試劑廠;纖維素酶、抗壞血酸、焦性沒食子酸、苯酚、無水乙醇、NaOH、H2O2(30%)、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、1,10-菲啰啉、三氯乙酸(TCA)、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、硫酸 AR,國藥集團化學試劑有限公司;瓊脂糖、質(zhì)粒pBR322 DNA、Goldview、DL5000 DNA Marker 寶生物工程有限公司。

KH-100B超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司;RE-5203旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申順生物科技有限公司;TU-1900雙光束紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠;TG1650-WS離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司;LyoQuest-85型冷凍機 西班牙泰事達公司;DYY-8C型電泳儀 北京市六一器廠;凝膠成像分析系統(tǒng) 美國伯樂公司Bio Rad。

1.2 實驗方法

1.2.1 芡實粗多糖的提取條件優(yōu)化 參照文獻[10-11],并結(jié)合芡實特性,選擇料液比(A)、pH(B)、酶用量(C)、超聲時間(D)、提取時間(E)、溫度(F)6個因素,每個因素選取3個水平設計正交實驗,因素水平表見表1。精確稱取2.00g芡實粉末,以水為提取溶劑,按表1的因素水平進行正交實驗。將不同提取條件下所得的提取液,經(jīng)8000r/min離心15min,上清液定量轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中,加水定容。

1.2.2 芡實多糖的定量測定

1.2.2.1 葡萄糖標準曲線的制作 參照文獻[12],以葡萄糖為標準品,采用苯酚-硫酸法繪制葡萄糖標準曲線Y=12.721X-0.1561(R2=0.9995)。

1.2.2.2 芡實多糖的定量測定 精密移取100mL容量瓶中提取液2mL,定量轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中、定容,采用苯酚-硫酸法進行顯色,并測量其吸光度值,代入1.2.2.1中葡萄糖標準曲線計算多糖的濃度,進而得到多糖提取率。

1.2.3 TCA-正丁醇法脫蛋白 準確稱取芡實粉末100g,在最佳提取條件下進行提取,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮體積至100mL左右,加入4倍體積無水乙醇沉淀,靜置過夜,冷凍干燥得芡實粗多糖。芡實粗多糖以50mL蒸餾水溶解,加入50mL 5% TCA和50mL正丁醇,振蕩,靜置30min,棄上層正丁醇及中間蛋白層,反復多次,直至中間無蛋白層,用0.5mol/L NaOH溶液中和水層至中性,旋蒸除去正丁醇,并濃縮體積至100mL左右,加入4倍體積無水乙醇,靜置過夜,離心收集沉淀,冷凍干燥,得芡實多糖。

1.2.4 芡實多糖的體外抗氧化活性

1.2.4.1 羥基自由基清除活性的測定 參照文獻[13],在試管中分別加入1mL鄰二氮菲乙醇溶液(0.75mmol/L),2mL磷酸緩沖溶液(0.2mol/L,pH7.4),1mL多糖水溶液,1mL硫酸亞鐵溶液(0.75mmol/L),搖勻,最后加入1mL 0.01%過氧化氫,37℃水浴1h,在510nm處測定其吸光度值A。清除率計算公式如下:

式中:A1:1mL鄰二氮菲+2mLPBS+1mLFeSO4+1mL多糖水溶液+1mLH2O2;A2:1mL鄰二氮菲+2mLPBS+1mLFeSO4+1mLH2O+1mLH2O2;A3:1mL鄰二氮菲+2mLPBS+1mLFeSO4+2mLH2O。

1.2.4.2 過氧化氫清除活性的測定 參照文獻[14],取40mmol/L過氧化氫磷酸緩沖溶液(0.2mol/L,pH7.4)0.5mL,多糖水溶液0.5mL于試管中,用磷酸緩沖溶液(0.2mol/L,pH7.4)稀釋至8mL,搖勻,靜置反應10min,在210nm處測其吸光度A。清除率計算公式如下:

式中:A1:0.5mL H2O2+0.5mL多糖水溶液+7mL磷酸緩沖溶液;A2:0.5mL多糖水溶液+7.5mL磷酸緩沖溶液;A0:0.5mL H2O2+7.5mL磷酸緩沖溶液。

1.2.4.3 超氧陰離子自由基清除活性的測定 參照文獻[15],在具塞試管中分別加入0.3mL多糖水溶液,5mL Tris-HCl緩沖溶液(0.05mol/L,pH8.2),混勻,37℃水浴20min。再加入7.5mmol/L的鄰苯三酚溶液0.3mL,迅速搖勻,在37℃條件下,320nm處80s內(nèi)每5s測量一次,繪制鄰苯三酚自氧化曲線,求出斜率F。清除率計算公式如下:

式中:F1:5mL Tris-HCl+0.3mL多糖水溶液+0.3mL鄰苯三酚;F0:5mL Tris-HCl+0.3mL H2O+0.3mL鄰苯三酚。

1.2.4.4 DPPH·清除活性的測定 參照文獻[16],取0.1mmol/L的DPPH·乙醇溶液4mL與不同濃度多糖水溶液1mL混勻,室溫下避光靜置50min,在516nm處測其吸光度值A。清除率計算公式如下:

式中:A1:4mL DPPH·+1mL多糖水溶液;A2:4mL 乙醇+1mL多糖水溶液;A0:4mL DPPH·+1mL H2O。

1.2.5 芡實多糖對質(zhì)粒DNA氧化損傷的防護作用 采用瓊脂糖凝膠電泳法研究芡實多糖對質(zhì)粒DNA氧化損傷的防護作用。精密量取1μL pBR322 DNA(100ng/μL),2μL多糖水溶液加入微量離心管中,混勻。再加入30%過氧化氫1μL,用蒸餾水補足反應體積至5μL,37℃水浴25min后,紫外光照射15min。結(jié)束后,加入6×Loading buffer 2.5μL,混勻后點樣于1%瓊脂糖凝膠,80V電壓下電泳50min,使溴酚藍移動到距膠板正極端約l cm處時停止電泳。以DL5000 DNA Marker作為定量分析標準,在凝膠成像系統(tǒng)下觀察電泳結(jié)果,并定量分析超螺旋結(jié)構(gòu)剩余含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 芡實多糖提取條件優(yōu)化

由正交實驗結(jié)果得知:芡實多糖提取因素的顯著性為pH>提取溫度>料液比>酶用量>超聲時間>提取時間。由表2可得,最佳提取條件為:料液比為1∶20,pH3,纖維素酶用量為原料質(zhì)量的2.0%,超聲時間為5min,提取時間為3h,提取溫度為40℃,最佳得率為17.04%。純化后芡實多糖純度為84.32%,蛋白脫除率為67.45%。

2.2 芡實多糖的體外抗氧化活性

2.2.1 羥基自由基清除活性 羥基自由基(OH·)是一種重要的活性氧,在人體內(nèi)主要由代謝產(chǎn)生,由于具有極強的氧化能力,其在人體內(nèi)可能引起一系列病變。如圖1所示,當多糖質(zhì)量濃度從1mg/mL增大至10mg/mL時,OH·的清除率逐漸升高,其IC50值為6.96mg/mL。

圖1 芡實多糖的羥基自由基清除活性Fig.1 The hydroxyl radical scavenging activity of Semen Euryl polysaccharide

2.2.2 過氧化氫清除活性 過氧化氫是一種很強的抗氧化劑,可致人體遺傳物質(zhì)DNA損傷及基因突變,加快衰老進程,與老年帕金森氏病、腦中風、動脈硬化及糖尿病性腎病和糖尿病性神經(jīng)性病變的發(fā)展密切相關[17]。如圖2所示,在質(zhì)量濃度為1～7mg/mL范圍內(nèi),過氧化氫清除率隨著濃度的升高而增大,當質(zhì)量濃度為7mg/mL時,過氧化氫清除率為48.00%,但當質(zhì)量濃度大于7mg/mL時,其清除率趨于平緩。

表2 多糖提取的正交實驗Table 2 Orthogonal experiment of polysaccharide extraction

圖2 芡實多糖的過氧化氫清除活性Fig.2 The hydrogen peroxide scavenging activity of Semen Euryl polysaccharide

2.2.3 超氧陰離子自由基清除活性 人體內(nèi)有一定數(shù)量的超氧陰離子自由基存在,不發(fā)生化學變化對人體無害,但與羥基結(jié)合后的產(chǎn)物會導致細胞DNA損壞,破壞人類機體功能。圖3顯示出芡實多糖對超氧陰離子自由基的清除效果較弱,隨著多糖質(zhì)量濃度的升高,其清除率呈平緩上升趨勢,當多糖質(zhì)量濃度為10mg/mL時,對超氧陰離子自由基的清除率僅為20.32%。

圖3 芡實多糖的超氧陰離子清除活性Fig.3 The superoxide radical scavenging activity of Semen Euryl polysaccharide

2.2.4 DPPH自由基清除活性 芡實多糖對DPPH·的清除效果如圖4所示,DPPH·的清除率與芡實多糖的質(zhì)量濃度呈正相關,當多糖質(zhì)量濃度為5mg/mL時,DPPH·的清除率達到94.63%,其IC50值為1.78mg/mL,說明芡實多糖對DPPH·有較好的清除效果。

圖4 芡實多糖的DPPH·自由基清除活性Fig.4 The DPPH· scavenging acticity of Semen Euryl polysaccharide

2.3 芡實多糖對質(zhì)粒DNA氧化損傷的防護作用

通常情況下,人體內(nèi)H2O2的活性并不足以直接損傷DNA,然而在紫外光(UV)的照射下,過氧化氫可被光解產(chǎn)生羥基自由基[18],羥基自由基被認為是最活潑的活性氧,也是引起DNA氧化損傷的主要因素之一。圖5顯示了芡實多糖對H2O2在光解作用下誘導質(zhì)粒DNA損傷的保護作用。質(zhì)粒DNA在自然狀態(tài)下為超螺旋結(jié)構(gòu)(sc)(泳道1),在電泳狀態(tài)下條帶移動較快,當被損傷后,DNA可能變?yōu)殚_環(huán)(oc)或線性結(jié)構(gòu)(lin),條帶移動較慢。泳道2顯示,在H2O2和UV的作用下,部分DNA由sc變?yōu)閛c,因此呈現(xiàn)出兩條譜帶,超螺旋結(jié)構(gòu)剩余含量為57.51%。泳道3到泳道11分別為不同濃度多糖水溶液對H2O2和UV共同作用下誘導質(zhì)粒DNA損傷的影響情況。

圖5 不同濃度多糖水溶液對H2O2光解反應 誘導質(zhì)粒DNA損傷保護作用的電泳圖Fig.5 Electrophoretic pattern of pBR322 DNA after UV-photolysis and H2O2 treatment in the presence or absence of polysaccharides注:泳道1:DNA;泳道2～11:DNA+UV+H2O2+多糖溶液 (0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0mg/mL)。

圖6 不同濃度多糖水溶液及VC對H2O2光解反應 誘導質(zhì)粒DNA損傷保護作用超螺旋結(jié)構(gòu)含量的影響Fig.6 Remaining SC form of pBR322 DNA after UV-photolysis and H2O2 treatment in the presence or absence of polysaccharides and VC

圖6中對比了芡實多糖和VC對DNA氧化損傷的影響,結(jié)果表明,芡實多糖在質(zhì)量濃度為0.02～0.5mg/mL范圍內(nèi),對質(zhì)粒DNA的保護作用先增大后減小,在質(zhì)量濃度為0.08mg/mL時,對質(zhì)粒DNA的保護作用最好,超螺旋結(jié)構(gòu)剩余含量為68.39%,質(zhì)量濃度大于1.0mg/mL時,促進了DNA的損傷;VC在質(zhì)量濃度為0.02mg/mL時保護作用最佳,超螺旋結(jié)構(gòu)剩余含量為85.66%,當VC質(zhì)量濃度大于0.08mg/mL時,對DNA存在一定的損傷作用,這與周殿風等[19]測定VC對質(zhì)粒DNA氧化損傷的防護作用的結(jié)果相同。芡實多糖及VC在低濃度時均呈現(xiàn)出對DNA損傷的保護作用,而在高濃度時增大了損傷作用,其原因有待進一步探究,但由此可以說明,藥物濃度過高可能對機體有副作用。對比芡實多糖水溶液體外抗氧化性能及對DNA氧化損傷的保護作用可得,后者的作用濃度遠小于前者,推測其原因是DNA本身對一定濃度H2O2的損傷具有抑制作用[20],多糖水溶液只需清除部分自由基即可達到保護效果,且多糖對DNA的保護作用不僅僅是簡單清除自由基,更有可能通過與DNA的絡合、嵌入等方式形成加合物從而起到保護作用[21]。

3 結(jié)論

本文采用纖維素酶超聲輔助法提取芡實多糖,最佳提取條件為:料液比為1∶20(g/mL),pH3,纖維素酶用量為原料質(zhì)量的2.0%,超聲時間為5min,提取時間為3h,提取溫度40℃,最佳得率為17.04%。脫除蛋白后,多糖純度為84.32%。比較芡實多糖水溶液對不同自由基的清除效果可得,芡實多糖對DPPH·有較好的清除效果,在質(zhì)量濃度為5mg/mL時,清除率為94.63%;對羥基自由基、過氧化氫的清除效果較為明顯,質(zhì)量濃度為10mg/mL時,對羥基自由基清除率為60.67%,質(zhì)量濃度為7mg/mL時,對過氧化氫清除率為48.00%;對超氧陰離子自由基的清除效果較弱,質(zhì)量濃度為10mg/mL,清除率僅為20.32%。

探討不同濃度芡實多糖水溶液對H2O2光解反應誘導質(zhì)粒DNA氧化損傷的保護作用,發(fā)現(xiàn)在0.02～0.5mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi),芡實多糖水溶液對質(zhì)粒DNA有較好的保護作用,當質(zhì)量濃度為0.08mg/mL時最佳,DNA超螺旋結(jié)構(gòu)剩余含量為68.39%,但當質(zhì)量濃度大于0.08mg/mL時,VC對DNA呈現(xiàn)損傷作用,而芡實多糖水溶液在1.0mg/mL以下對DNA均呈現(xiàn)出保護作用,其對DNA保護作用的濃度范圍比VC更寬。綜上所述,芡實多糖具有較好的抗氧化活性,對DNA氧化損傷具有較為顯著的保護作用,是一種天然有效的抗氧化劑,可以廣泛用于食品添加劑及保健食品中。

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Antioxidant activity and protective effect on oxidative plasmid DNA damage of polysaccharides fromSemenEuryales

ZHANG Yi,SUN Pei-dong*,CHEN Gui-bing,CAO Guang-qun

(The Key Laboratory of Food Colloids and Biotechnology,Ministry of Education,School of Chemical and Material Engineering,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

SemenEuryales;extracts;antioxidant potential;oxidative DNA damage

2014-08-08

張溢(1988-),女,碩士研究生,研究方向:化學工程。

*通訊作者:孫培冬(1967-),女,碩士,副教授,研究方向:天然活性成分提取及有機合成。

TS201.1

A

1002-0306(2015)11-0122-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.016