阿拉伯木聚糖的氧化交聯(lián)與啤酒大麥麥芽過濾性能的相關(guān)性研究

周 婷,金 昭,高 飛,蔡國林,陸 健,4，*

(1.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無錫 214122;2.江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室,江蘇無錫 214122;3.江南大學(xué)生物工程學(xué)院,江蘇無錫 214122;4.宿遷市江南大學(xué)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院,江蘇宿遷 223800)

阿拉伯木聚糖的氧化交聯(lián)與啤酒大麥麥芽過濾性能的相關(guān)性研究

周 婷1,2,3,金 昭1,2,3,高 飛1,2,3,蔡國林2,3,陸 健1,2,3,4，*

(1.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無錫 214122;2.江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室,江蘇無錫 214122;3.江南大學(xué)生物工程學(xué)院,江蘇無錫 214122;4.宿遷市江南大學(xué)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院,江蘇宿遷 223800)

本文以18個(gè)大麥麥芽樣品為研究對象,以pearson相關(guān)分析法研究了大麥麥芽中過氧化物酶(Peroxidase,POD)、麥汁中鍵合態(tài)阿魏酸以及多聚阿拉伯木聚糖(PAX)與麥芽過濾性能的相關(guān)性。研究結(jié)果表明:麥芽過濾速度與麥芽POD酶活、麥汁粘度、麥汁中鍵合態(tài)阿魏酸及PAX含量呈顯著負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.632(p<0.01)、0.521(p<0.05)、0.555(p<0.05)和0.664(p<0.01);PAX含量與鍵合態(tài)阿魏酸含量、麥汁粘度呈顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.590(p<0.05)和0.595(p<0.01)。這一結(jié)果表明,阿魏酸介導(dǎo)的AX的氧化交聯(lián)與大麥麥芽過濾性能緊密相關(guān),很可能是AX導(dǎo)致麥芽過濾性能差的重要途徑之一。本文為改善大麥麥芽過濾性能提供了一定的理論依據(jù)。

大麥麥芽,過濾性能,阿拉伯木聚糖,氧化交聯(lián),過氧化物酶,阿魏酸

圖1 AX-FA基本結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Basic structure of AX-FA

圖2 AX氧化交聯(lián)示意圖Fig.2 Prosess of oxidative cross-linking of AX

阿拉伯木聚糖(arabinoxylan,AX)是谷物種子中主要的非淀粉多糖,其基本結(jié)構(gòu)是以(1→4)-β-D-吡喃木糖殘基單元聚合為線型主鏈,通過C(O)-2、C(O)-3或C(O)-2,3糖苷鍵連接α-L-阿拉伯呋喃糖基取代物[1],通常根據(jù)溶解性分為兩大類:水溶性阿拉伯木聚糖(water-extractable arabinoxylans,WEAX)和水不溶性阿拉伯木聚糖(water-unextractable arabinoxylans,WUAX)。大麥麥芽中WEAX的含量一般為0.49%～0.69%[2]。

AX在啤酒釀造過程中會引起一系列問題,比如,降低麥芽浸出率、增加麥汁粘度、降低過濾速度等[3]。AX具有特殊的氧化交聯(lián)性質(zhì),在其木聚糖側(cè)鏈上的阿拉伯糖殘基C(O)-5位上連接有阿魏酸基團(tuán)(Ferulic Acid,FA),形成AX-FA聚合物,如圖1所示[4]。當(dāng)WEAX與過氧化物酶(Peroxidase,POD)/H2O2體系共存時(shí),WEAX結(jié)構(gòu)中的FA發(fā)生聚合,WEAX分子則通過FA分子間的聚合而交聯(lián)在一起,發(fā)生氧化交聯(lián)反應(yīng)[5],如圖2所示,形成大分子網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)而麥芽中大分子物質(zhì)之間相互作用形成的復(fù)雜大分子物質(zhì)是影響麥芽過濾性能的直接原因[6-7],因而,WEAX的交聯(lián)反應(yīng)很可能對麥芽過濾性能具有負(fù)面作用。Stephenson等研究表明,糖化過程中存在通過FA介導(dǎo)的WEAX的氧化交聯(lián)反應(yīng),并推測該氧化反應(yīng)是麥汁過濾的不利因素[8]?？拙S寶等研究認(rèn)為,POD所促進(jìn)的AX的交聯(lián)產(chǎn)物對啤酒的澄清度和過濾特性可能有潛在的影響[9]。但目前,關(guān)于FA介導(dǎo)的AX的氧化交聯(lián)對麥芽過濾性能的影響只是推測,具體的研究還沒有報(bào)道。

本文基于統(tǒng)計(jì)學(xué)原理,檢測18個(gè)國內(nèi)外啤酒大麥麥芽樣品中POD酶活、麥汁中AX-FA與PAX含量,并與麥芽的過濾性能之間進(jìn)行相關(guān)性分析,為進(jìn)一步揭示AX對麥芽過濾性能造成負(fù)面影響的原因提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)商品麥芽見表1。阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品 購自Sigma公司;辣根過氧化物酶 為生化試劑,購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;甲醇 色譜純;乙酸乙酯、冰醋酸、鹽酸、氫氧化鈉、無水乙醇、間苯三酚等 均為國產(chǎn)分析純。

Agilent 1260高效液相色譜儀 安捷倫公司;Haake落球式粘度計(jì) Thermo公司;UV-2100型紫外可見分光光度計(jì) 尤尼柯儀器有限公司;自動(dòng)糖化器 輕工部西安輕機(jī)所光電公司;麥芽標(biāo)準(zhǔn)粉碎機(jī) 北京德之杰啤酒技術(shù)有限責(zé)任公司;WGZ-2-PJ濁度計(jì) 上海昕瑞儀器儀表有限公司;H1850R臺式高速冷凍離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;SHB-Ⅲ 循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

表1 18個(gè)大麥麥芽樣品基本信息Table 1 Information of 18 barley malts

注:(1)、(2)、(3)、(4)代表來自于不同產(chǎn)地或年份的同一品種的大麥麥芽。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 協(xié)定糖化麥汁指標(biāo)的測定 協(xié)定糖化麥汁指標(biāo)測定方法參考自歐洲啤酒協(xié)會標(biāo)準(zhǔn)[10]。協(xié)定糖化麥汁測定的指標(biāo)主要包括:麥汁過濾速度(T30 min,即協(xié)定麥汁在100mL回流后,30min內(nèi)麥汁濾液的體積)、濁度、粘度,AX和PAX含量等。

1.2.2 麥汁中鍵合態(tài)阿魏酸含量的測定 麥汁中游離阿魏酸的提取:30mL麥汁用2mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至2.0,添加0.5g KCl,樣品用10mL乙酸乙酯提取三次,有機(jī)組分蒸發(fā)干燥(40℃,0.9bar真空),溶于10mL甲醇中,樣品經(jīng)微孔過濾(0.45μm),用于HPLC-UV檢測[11]。

麥汁總阿魏酸的提取:30mL麥汁與含有EDTA(10mmol/L)和1%(w/v)抗壞血酸的15mL NaOH(2mol/L)混合,萃取30min,用2mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至2.0,添加0.5g KCl,樣品用10mL乙酸乙酯提取三次,有機(jī)組分蒸發(fā)干燥(40℃,0.9bar真空),溶于10mL甲醇中,樣品經(jīng)微孔過濾(0.45μm),用于HPLC-UV檢測[11]。

麥汁中鍵合態(tài)阿魏酸(AX-FA)含量(μg/mL)=總阿魏酸含量(μg/mL)-游離阿魏酸含量(μg/mL)。

1.2.3 HPLC法分析檢測阿魏酸 色譜條件:Zorbax EcIipse XDB-C18(250mm× 4.6mm i.d.,5μm)色譜柱(安捷倫公司);流動(dòng)相為 含0.1%乙酸的水溶液(A相)和0.1%乙酸的甲醇溶液(B相);梯度洗脫條件如下:0min,5% B;15min,20% B;45min,60% B;50min,80% B;52min,5% B;60min,5% B。紫外檢測波長為320nm,柱溫25℃,流速 lmL/min,進(jìn)樣量20μL[12]。

1.2.4 大麥麥芽過氧化物酶(POD)的提取 稱取細(xì)粉大麥麥芽樣品5g,置于100mL預(yù)冷燒杯中,加50mL 0.05mol/L pH6.0的磷酸緩沖液,0.5g PVPP,4℃,磁力攪拌器攪拌提取1h;提取液以10000×g 4℃離心20min,取上清液定容至50mL,保存于4℃冰箱中待測POD[13]。

1.2.5 過氧化物酶(POD)的酶活測定 取50mL pH6.0磷酸緩沖液和28μL愈創(chuàng)木酚于磁力攪拌器上加熱攪拌,直至愈創(chuàng)木酚完全溶解,待溶液冷卻后,加入30%的H2O219μL,混合均勻后4℃保存。取該混合液3mL,加入20μL粗酶液,以加20μL磷酸緩沖液的反應(yīng)混合液為對照,470nm波長下測其吸光度,每隔1min記錄一次吸光度值,一共記錄5次[14]。

酶活定義:每分鐘內(nèi)A470變化0.01為一個(gè)酶活單位(U),酶活表示為U/g干物質(zhì)。

1.2.6 糖化階段添加H2O2實(shí)驗(yàn) 在Metcalfe麥芽糖化起始階段添加不同濃度的H2O2,糖化結(jié)束后,測定麥芽的過濾性能及相關(guān)指標(biāo)。

1.2.7 POD酶活、AX-FA及PAX含量與過濾速度的關(guān)系分析 將18種麥芽按過濾速度分為三類:慢速(<150mL/30min)、中速(150～240mL/30min)和快速(>240mL/30min)。以過濾速度作為因變量,POD酶活、AX-FA及PAX含量三個(gè)影響因素為自變量做散點(diǎn)圖,分析三者對過濾速度的影響程度。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)分析 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)測定3次,取其平均值。運(yùn)用SPSS18.0軟件進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 18種大麥麥芽POD酶活、麥汁AX-FA及PAX含量和麥芽過濾性能的檢測與統(tǒng)計(jì)分析

為了研究大麥麥芽中POD酶活、麥汁中AX-FA及PAX含量與麥芽過濾性能(過濾速度、粘度和濁度)之間的關(guān)系,收集18個(gè)大麥麥芽樣品進(jìn)行檢測,結(jié)果見表2。由表2可知,18個(gè)大麥麥芽樣品囊括了10種大麥品種,對以上數(shù)據(jù)進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)見表3,可以看出,18個(gè)大麥麥芽樣品過濾速度的變化范圍為60～320mL/30min,濁度為0.92～14.44EBC,粘度為1.44～1.65mPa·s;POD酶活為5.9×103～36.6×103U/g干麥芽,平均值為21.1×103U/g干麥芽;麥汁中AX-FA含量為6.39～10.95μg/mL,平均值為9.12μg/mL;麥汁中PAX含量為654.7～997.2mg/L,平均值為818.2mg/L。

表2 18個(gè)大麥麥芽樣品POD酶活、麥汁AX-FA及PAX含量與麥芽過濾性能Table 2 POD activity,content of AX-FA and PAX in wort,malt filtering performance of 18 barley malts

注:(1)、(2)、(3)、(4)代表來自于不同產(chǎn)地的同一品種的大麥麥芽。

表3 18個(gè)大麥麥芽樣品POD酶活、麥汁AX-FA及PAX含量與麥芽過濾性能統(tǒng)計(jì)分析表Table 3 Statistical analysis of POD activity,content of AX-FA and PAX in wort,malt filtering performance of 18 barley malts

表4 18個(gè)大麥麥芽樣品POD酶活、麥汁AX-FA及PAX含量與麥芽過濾性能的相關(guān)性分析表Table 4 Person correlation analysis among POD activity,content of AX-FA and PAX in wort and malt filtering performance of 18 barley malts

注:*表示在p<0.05顯著,**表示在p<0.01顯著。

2.2 大麥麥芽中POD酶活、麥汁中AX-FA及PAX含量與麥芽過濾性能之間相關(guān)性分析

為了確定FA介導(dǎo)的AX的氧化交聯(lián)反應(yīng)是否是大麥麥芽過濾性能的不利因素,采用SPSS 18.0軟件對參與AX氧化交聯(lián)反應(yīng)的POD、AX-FA及主要產(chǎn)物PAX與麥汁過濾速度、粘度、濁度之間進(jìn)行相關(guān)性分析,分析結(jié)果如表4所示。從表4 可以看出,麥汁過濾速度與POD、PAX、AX-FA、粘度均呈一定的負(fù)相關(guān)性,說明通過FA介導(dǎo)的AX的氧化交聯(lián)反應(yīng)與過濾速度之間有著明顯的內(nèi)在聯(lián)系,減弱糖化過程AX的交聯(lián)反應(yīng),可以提高麥汁的過濾速度。其中麥汁過濾速度與POD及PAX在0.01范圍內(nèi)高度負(fù)顯著,相關(guān)系數(shù)為分別為0.632和0.664,而金昭[15]通過比較江蘇單二大麥麥芽與加拿大Metcalfe大麥麥芽的代謝蛋白質(zhì)組,發(fā)現(xiàn)在制麥過程中,POD在單二中的表達(dá)量高于Metcalfe,推測POD可能是麥芽過濾性能的不利因素。而過濾速度與粘度及AX-FA在0.05范圍內(nèi)顯著負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.521和0.555?？拙S寶[13]通過在糖化過程中外加H2O2發(fā)現(xiàn)麥汁過濾速度顯著降低、濁度升高,分析認(rèn)為導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因可能是外加的H2O2為POD的酶促氧化酚類物質(zhì)提供了充分條件,導(dǎo)致多酚的氧化并使其氧化產(chǎn)物與戊聚糖發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)生成高分子聚合物。

表5 不同濃度H2O2對麥汁過濾性能及其指標(biāo)的影響Table 5 Effect of H2O2 content on filterability and other specifications of wort

為了證明H2O2促進(jìn)了FA介導(dǎo)的AX的氧化交聯(lián)反應(yīng),本實(shí)驗(yàn)在糖化過程中添加H2O2,并檢測麥汁中總FA含量,結(jié)果如表5所示,發(fā)現(xiàn)隨著H2O2添加量的增加,FA含量與麥芽過濾速度均大幅度降低,據(jù)馬福敏等報(bào)道,WEAX中添加POD及H2O2會促進(jìn)氧化交聯(lián)的發(fā)生,FA含量降低,AX分子量增大[1],Dervilly等添加POD/H2O2后檢測到了三種阿魏酸二聚體[16],而Faulds等在啤酒糟中也發(fā)現(xiàn)了阿魏酸二聚體[17],因此本研究結(jié)果表明,外加的H2O2促進(jìn)了FA的氧化,使其形成阿魏酸二聚體甚至三聚體與多聚體,從而加大了AX的交聯(lián)反應(yīng),產(chǎn)生高分子聚合物,而PAX含量的降低,表明交聯(lián)形成的大分子PAX,由于分子量過大而滯留在麥糟中,堵塞麥糟,因而使得過濾速度顯著降低。以上研究結(jié)果可證明,FA是麥芽過濾速度的不利因素。通過抑制FA的氧化,進(jìn)而牽制AX的氧化交聯(lián)反應(yīng),可以提高麥芽的過濾速度。

李胤等研究表明,麥汁中WEAX與麥汁粘度相關(guān)系數(shù)為0.790(p<0.01),并認(rèn)為PAX可能成為一個(gè)優(yōu)于AX的指示阿拉伯木聚糖影響麥汁(啤酒)粘度和過濾的指標(biāo)[3],此外,Debyser等人認(rèn)為小麥芽中AX的分子量高于大麥芽中的分子量是導(dǎo)致麥汁粘度升高,過濾速度減慢的原因之一[18]。而本文研究結(jié)果表明麥汁粘度與PAX之間呈高度正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.595(p<0.01),說明PAX是影響麥汁粘度的重要因素之一。

2.3 麥汁中PAX和AX-FA含量的內(nèi)在聯(lián)系

圖3 PAX與AX-FA之間的相關(guān)性Fig.3 Correlation analysis of PAX and AX-FA

由表4可知,麥汁中AX-FA含量與PAX含量呈顯著正相關(guān)(r=0.590,p<0.05),說明其用于AX氧化交聯(lián)的有效性和一致性。PAX含量與AX-FA含量之間的相關(guān)性擬合曲線如圖3所示,相關(guān)方程為y=37.777x+477.7111(R2=0.666)。表明,麥汁中PAX含量受AX-FA含量的影響,AX-FA含量越高,AX氧化交聯(lián)反應(yīng)越強(qiáng)烈,進(jìn)而PAX含量越高,對麥汁過濾速度的負(fù)面作用越大。

2.4 不同過濾性能麥芽中POD酶活、AX-FA及PAX含量與麥芽過濾速度的關(guān)系

圖4 麥芽中POD酶活(A)、麥汁AX-FA含量(B) 及麥汁PAX含量(C)對麥芽過濾速度的影響Fig.4 Effect of POD activity(A),content of AX-FA(B) and PAX(C)on filtration rate of wort

由相關(guān)性分析結(jié)果可以看出,FA介導(dǎo)的AX的氧化交聯(lián)反應(yīng)對麥汁的過濾速度影響較大,對麥汁粘度和濁度的影響相對較小。因此,為了更好的了解麥芽中POD酶活、麥汁AX-FA及PAX含量與麥芽過濾速度之間的關(guān)系,進(jìn)一步將麥芽根據(jù)過濾速度分為慢速(<150mL/30min)、中速(150～240mL/30min)和快速(>240mL/30min)進(jìn)行分析。從圖4可以清晰看出麥芽中POD酶活、麥汁AX-FA以及PAX含量對麥芽過濾速度的影響程度。在慢速麥芽中,POD酶活、AX-FA和PAX含量都較高,其平均值分別為26.4×103U/g、10.05μg/g干麥芽和895.4mg/L。隨著麥芽過濾速度的增加,中速麥芽中POD酶活、AX-FA和PAX含量都明顯低于慢速麥芽,其平均值分別為23.0×103U/g、9.04μg/g干麥芽、809.7mg/L;快速麥芽中POD酶活、AX-FA和PAX含量要遠(yuǎn)低于慢速麥芽,其平均值分別為14.0×103U/g、8.27μg/g干麥芽和758.7mg/L;而與中速麥芽相比,差距也很明顯。因而,通過降低麥芽POD酶活,減少麥汁中AX-FA含量,進(jìn)而使得麥汁中PAX含量降低,能夠提高麥芽過濾速度,改善麥芽過濾性能。

3 結(jié)論

本文基于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析法對18個(gè)麥芽樣品中POD酶活、麥汁中AX-FA及PAX含量與麥芽過濾性能之間進(jìn)行相關(guān)性分析,分析顯示麥芽過濾速度與參與AX氧化交聯(lián)反應(yīng)的物質(zhì)(POD、AX-FA)以及主要產(chǎn)物(PAX)均呈顯著的負(fù)相關(guān)性,其中與POD、PAX在0.01范圍內(nèi)高度負(fù)顯著,相關(guān)系數(shù)分別為0.632和0.664。此結(jié)果表明,AX的氧化交聯(lián)與麥芽過濾速度關(guān)系緊密,因而,AX在POD的促進(jìn)作用下,通過FA的聚合發(fā)生氧化交聯(lián),進(jìn)而產(chǎn)生大分子物質(zhì)的反應(yīng)很可能對麥芽過濾速度具有負(fù)面影響,是AX影響麥芽過濾性能的重要原因之一。

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Correlation analysis of arabinoxylan oxidative cross-linking and barley malt filtration performance

ZHOU Ting1,2,3,JIN Zhao1,2,3,GAO Fei1,2,3,CAI Guo-lin2,3,LU Jian1,2,3,4，*

(1. Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2. National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;3. School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;4.Industrial Technology Research Institute of Jiangnan University in Suqian,888 Renmin Road,Suqian 223800,China)

In this study,peroxidase(POD)activity,bound ferulic acid and polyarabinoxylan(PAX)contents,and filterability of 18 barley malts were analysed. And the correlations between them were studied by pearson correlation analysis. The results showed that there were significantly negative correlation between the filtration rate and the POD activities,wort viscosity,bound ferulic acid and PAX content in wort,the correlation coefficient were 0.632(p<0.01),0.521(p<0.05),0.555(p<0.05)and 0.664(p<0.01)respectively. While as there were positive correlation between the content of PAX and the content of bound ferulic acid,wort viscosity,the correlation coefficient were 0.590(p<0.05)and 0.595(p<0.01)respectively. The result showed that the oxidative cross-linking of AX through ferulic acid polymerization could be associated with barley malt filtration performance. Further more,it was likely to result in poor malt filtration. This study provided a new theory for improving the filterability of barley malt.

barley malt;filterability;arabinoxylan;oxidative cross-linking;peroxidase;ferulic acid

2014-07-24

周婷(1989-)，女，碩士研究生，研究方向：釀酒科學(xué)與工程。

*通訊作者:陸健(1968-)，男，博士，教授，主要從事釀造酒微生物與酶技術(shù)研究。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31171736)；國家863計(jì)劃(2013AA102109)；江蘇省普通高等學(xué)校科研成果產(chǎn)業(yè)化推進(jìn)項(xiàng)目(JHB2012-26)；江蘇省科技支撐計(jì)劃(BE2012397)；江蘇省高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目；高等學(xué)校學(xué)科創(chuàng)新引智計(jì)劃(111計(jì)劃)資助項(xiàng)目(111-2-06)；安全食品精深加工科技創(chuàng)新平臺建設(shè)(2012B091400030)。

TS201.1

A

1002-0306(2015)11-0110-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.014