復(fù)葉耳蕨渣總黃酮轉(zhuǎn)化提取與DPPH自由基清除活性的研究

張義平,胡月萍,鄔亞華,孫維君,周許峰,曹 俊,王麗麗,殷嫦嫦

(九江學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,江西九江 332000)

復(fù)葉耳蕨渣總黃酮轉(zhuǎn)化提取與DPPH自由基清除活性的研究

張義平,胡月萍,鄔亞華,孫維君,周許峰,曹 俊,王麗麗,殷嫦嫦

(九江學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,江西九江 332000)

研究復(fù)葉耳蕨渣的土壤真菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化提取其總黃酮和清除DPPH自由基活性。復(fù)葉耳蕨渣直篩發(fā)酵用優(yōu)勢菌株;通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)L9(34)優(yōu)化總黃酮提取,DPPH法評價(jià)轉(zhuǎn)化前后總黃酮抗氧化活性。研究得到優(yōu)勢菌株F2發(fā)酵復(fù)葉耳蕨渣后黃酮得率為(0.893%±0.035%),較未發(fā)酵時(shí)總黃酮得率提高了27.0%,差異顯著。F2發(fā)酵復(fù)葉耳蕨渣在最佳提取條件(料液比1∶30(g/mL),乙醇濃度70%,時(shí)間40min)下總黃酮產(chǎn)量較發(fā)酵前提高了30.6%。復(fù)葉耳蕨渣F2發(fā)酵前后總黃酮均表現(xiàn)出優(yōu)于VE的清除DDPH自由基能力,但發(fā)酵前后總黃酮清除DPPH自由基能力無顯著性差異。土壤真菌F2固體發(fā)酵增加了復(fù)葉耳蕨渣總黃酮的提取,復(fù)葉耳蕨渣黃酮提取物表現(xiàn)出比VE更強(qiáng)的清除DPPH自由基能力,作為一種天然抗氧劑具有良好的應(yīng)用前景。

復(fù)葉耳蕨,土壤真菌,固體發(fā)酵,DPPH自由基清除

復(fù)葉耳蕨屬植物資源分布廣泛,具有抗菌消炎、清熱利濕、驅(qū)蟲和鎮(zhèn)靜作用,民間用于急性黃疸型肝炎、關(guān)節(jié)炎、腰腿疼、痢疾和抗癌治療[1-4]。研究表明復(fù)葉耳蕨甲醇提取液有促宮縮、抗早孕及墮胎作用[5]。復(fù)葉耳蕨乙醇提取物具有抗氧化和肝保護(hù)作用和誘導(dǎo)肝癌HepGⅡ凋亡作用[6-7]。李輝敏等證明復(fù)葉耳蕨不同提取部位還具有抑制HIV-1蛋白酶和逆轉(zhuǎn)錄酶活性,能夠阻止艾滋病毒復(fù)制[8]。梁廣勝等證明復(fù)葉耳蕨提取物具有促進(jìn)大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和促成骨分化的雌激素樣作用[9]。復(fù)葉耳蕨化學(xué)成分復(fù)雜,主要含有黃酮、三萜皂苷、酚類等成分。目前對它的成分研究主要集中在黃酮類化合物及酚類化合物[10]。周道年等從刺頭復(fù)葉耳蕨(Arachniodesexilis(Hance)Ching)地上部分的化學(xué)成分中分離得到酚類和黃酮類化合物[11]。方偉等從斜方復(fù)葉耳蕨(Arachniodesrhomboidea)地上部分也分離得到黃酮類化合物[12]。黃酮類物質(zhì)在抗氧化抗衰老、抗炎鎮(zhèn)痛、抗癌防癌等方面有著重要顯著的作用,可以廣泛用于食品添加劑及保健食品中[13-14]。機(jī)體代謝過程中會產(chǎn)生活性氧自由基,超過體內(nèi)抗氧化酶和抗氧化物質(zhì)的生理抗氧化能力,將氧化損傷細(xì)胞膜脂質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)DNA和蛋白質(zhì),導(dǎo)致酶、細(xì)胞膜和遺傳物質(zhì)的損傷和功能失調(diào)?；钚匝踝杂苫鶎⒓铀偎ダ虾徒M織損傷,引起炎癥、神經(jīng)組織功能退化、心血管疾病和癌癥[15-16]。目前研究黃酮類化合物的雌激素樣作用、抗毛細(xì)血管脆性、抗動脈硬化、抗突變和抗癌等功能主要源于它們的抗氧化活性[17-18]。

民間復(fù)葉耳蕨往往經(jīng)水三次煎取利用,它的水煎剩余渣被證明含有未有效利用的黃酮成分。復(fù)葉耳蕨渣富含的黃酮類物質(zhì)直接遺棄致使復(fù)葉耳蕨利用價(jià)值下降。另外,殘?jiān)诃h(huán)境中的利用效率不高,若經(jīng)甲醇等有機(jī)溶劑再次直接提取,由于研究表明許多天然植物內(nèi)的黃酮原始含量低,其直接提取效率低。復(fù)葉耳蕨渣自身組織尚含有豐富木質(zhì)纖維素和微量元素,可以成為真菌發(fā)酵的有效養(yǎng)分[19],本實(shí)驗(yàn)以復(fù)葉耳蕨渣為原料,利用土壤真菌多酶催化功能,轉(zhuǎn)化復(fù)葉耳蕨渣物質(zhì)成分,使得黃酮提取率也有提高,探索出了一條新的提取復(fù)葉耳蕨黃酮的工藝路線,同時(shí)檢測復(fù)葉耳蕨黃酮的DPPH自由基清除活性,以獲得轉(zhuǎn)化后黃酮的抗氧化能力評價(jià),為進(jìn)一步開發(fā)復(fù)葉耳蕨提取功能性食品提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮土壤 采集于九江學(xué)院潯東校區(qū)草坪土壤5～10cm處;復(fù)葉耳蕨采自江西廬山 經(jīng)九江森林植物標(biāo)本館館長譚策銘鑒定;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、NaNO2(分析純)、Al(NO3)3(分析純)、NaOH(分析純)和95%乙醇(分析純) 均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

UV7504C紫外分光光度計(jì) 上海精科實(shí)業(yè)有限公司;GHP-9080恒溫培養(yǎng)箱 蘇州江東精密有限公司;101A烘箱蘇州臺華烘箱設(shè)備有限公司;SW-CJ-2F超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司;培養(yǎng)皿 上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司;BSA224S-CW電子天平 德國賽多利斯;JD-1000GA超聲儀 寧波海曙金達(dá)超聲波清洗機(jī)廠;KQ-8020BP真空泵 鄭州博科儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 土壤真菌分離和純化培養(yǎng) 篩選培養(yǎng)基:稱取50g復(fù)葉耳蕨渣(復(fù)葉耳蕨水煎三次提取后殘?jiān)銣馗稍?100℃過夜恒重)、5g瓊脂糖,加水加熱攪拌至沸5min,稍冷,定容至500mL。趁熱分裝培養(yǎng)皿中,冷卻凝固,待用。

土壤真菌分離純化:采集我校潯東校區(qū)草坪5～10cm處土壤,裝入無菌保鮮袋帶回實(shí)驗(yàn)室。配制土壤10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7的梯度稀釋液,三倍重復(fù)平板劃線接種。經(jīng)二輪挑取獨(dú)立菌落,分別制備10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7的梯度菌懸液,三倍重復(fù)初步純化倒置培養(yǎng)。最后,挑取單克隆真菌擴(kuò)大培養(yǎng)[20-21]。

1.2.2 單克隆真菌發(fā)酵復(fù)葉耳蕨渣 稱取干燥后殘?jiān)?加適量水濕潤,滅菌待用。選擇單菌落,采用三區(qū)法接種于上述培養(yǎng)基中,每個(gè)菌落按3倍重復(fù)接種,25℃放置培養(yǎng)一周。將培養(yǎng)后基質(zhì)置于烘箱100℃過夜高溫殺滅真菌,稱重記錄,置于干燥箱中密閉保存,待用。

1.2.3 不同土壤真菌復(fù)葉耳蕨渣發(fā)酵前后總黃酮的提取 稱取相同條件恒重干燥的發(fā)酵前后樣品2g,加入40mL 70%的乙醇攪拌浸泡20min,再放入超聲儀(工作頻率25kHZ/功率50W/溫度55℃)超聲提取40min。提取后抽濾,收集濾液。由于提取后的溶劑(70%)受熱揮發(fā),提取液少于40mL,加70%乙醇定容至40mL。

1.2.4 總黃酮的得率測定 精密稱取干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品在509nm測定吸光度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定總黃酮吸光度,計(jì)算總黃酮得率(%,即g/100g):X(%)=[(C×25×10-6×V/A×W]×100,式中:C為總黃酮的濃度μg/mL,25為反應(yīng)體系mL,10-6為換算系數(shù),V為提取液體積mL,A為移取液體積mL,W發(fā)酵前為黃酮提取樣品恒重質(zhì)量和發(fā)酵后黃酮提取樣品恒重質(zhì)量除以(1-平均失重率)g。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn) 設(shè)定稱取樣品1.0000g,20mL 70%的乙醇攪拌浸泡20min,再放入超聲儀(工作頻率25kHZ/功率50W,通過溫度計(jì)監(jiān)測冷水控制溫度55℃)超聲提取40min為基本條件。分別考察發(fā)酵時(shí)間(3、5、7、9、11d)、提取pH(4、5、6、7、8)、料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g/mL))、乙醇濃度(50%、60%、70%、80%和95%)與超聲提取時(shí)間(20、30、40、50、60min)單因素的變化,單因素實(shí)驗(yàn)比較以上條件對發(fā)酵前后復(fù)葉耳蕨渣總黃酮提取率的影響。

1.2.6 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 通過分析單因素實(shí)驗(yàn),選取對黃酮提取量影響大的工藝條件:料液比、乙醇濃度和提取時(shí)間。以總黃酮提取率為綜合評分指標(biāo),進(jìn)行3因素3水平正交實(shí)驗(yàn)。按L9(34)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

表1 發(fā)酵基質(zhì)總黃酮提取因素水平表Table 1 Factors and levels of extraction of total flavonoids in fermented base

表2 復(fù)葉耳蕨藥渣發(fā)酵前后的總黃酮得率比較Table 2 The yield of the flavonoids extracted from Arachniodes dregs with and without fermentation

注:a:僅列出藥渣與F1、F2和F3菌株之間的顯著性分析p值。1.2.7 DPPH自由基清除測定 試管中加入樣品溶液0.5mL,6.25×10-5mol/L DPPH甲醇溶液2.5mL,30℃保溫30min 后,于517nm處測定DPPH的吸光度。甲醇調(diào)零,DPPH新鮮配制,每次用前置4℃冰箱暗中保存。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。清除率E(%)=(A空白-A樣品)/A空白×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)葉耳蕨渣篩選土壤真菌生長形態(tài)

土壤真菌梯度稀釋實(shí)驗(yàn)表明,復(fù)葉耳蕨渣培養(yǎng)基上,F1、F2和F3菌株生長狀況最好,少部分菌株生長緩慢,培養(yǎng)2周菌苔未能鋪滿平板,其余菌株生長速度相當(dāng),說明復(fù)葉耳蕨渣營養(yǎng)條件可以提供土壤菌株萌發(fā)與生長條件,能夠篩選出部分土壤真菌。選用在PDA平板上萌發(fā)早和生長狀況好的F1、F2和F3菌株轉(zhuǎn)接進(jìn)行單克隆純化篩選。見圖1經(jīng)菌落懸液梯度純化,觀察到培養(yǎng)皿中F1、F2和F3各自近似為單菌落,白色絨毛狀,多成圓形向四周匍匐生長;且二次菌落懸液梯度多點(diǎn)接種,相應(yīng)菌落生長一致,經(jīng)鑒定單克隆真菌純化成功。接種相應(yīng)真菌F1、F2和F3復(fù)葉耳蕨渣發(fā)酵,培養(yǎng)皿中菌落絨毛狀呈圓形向四周生長,同一單菌同一濃度得到的菌落顏色、形態(tài)與生長狀況一致,也進(jìn)一步驗(yàn)證了純菌篩選的成功。

圖1 復(fù)葉耳蕨藥渣發(fā)酵菌落形態(tài)Fig.1 Morphology of soil fungi screened by Arachniodes exilis dregs注:F1、F2和F3,菌落懸浮梯度稀釋純化二次 和擴(kuò)大培養(yǎng)獲得的典型土壤真菌。

2.2 不同土壤真菌復(fù)葉耳蕨渣發(fā)酵前后總黃酮得率

篩選獲得土壤真菌F1、F2和F3菌株發(fā)酵處理復(fù)葉耳蕨渣,表2結(jié)果說明總黃酮平均得率大小為F2>F1>F3>藥渣。其中,F2發(fā)酵黃酮得率最高,F1、F2和F3菌株發(fā)酵比復(fù)葉耳蕨渣直接獲得的黃酮分別提高了20.6%,27.0%和4.6%。經(jīng)SPSS 13.0 Levene方差齊性檢驗(yàn)滿足方差齊性,適用多重比較檢驗(yàn)。多重比較分析表明除復(fù)葉耳蕨渣與F3發(fā)酵黃酮得率無顯著差異,其他兩兩之間呈現(xiàn)顯著性差異。顯著性分析F2發(fā)酵后渣的p=0.000,F1發(fā)酵后渣的p=0.005,說明經(jīng)F2發(fā)酵后渣與未發(fā)酵渣的總黃酮得率有顯著性差異。因此,土壤真菌不同菌株在復(fù)葉耳蕨渣上具有不同的轉(zhuǎn)化和降解特性,提高復(fù)葉耳蕨渣黃酮得率的菌株與菌株種屬緊密相關(guān),不同種屬之間存在較大差別,使得針對復(fù)葉耳蕨渣的菌種篩選非常重要。結(jié)果分析表明F2菌株是適于處理復(fù)葉耳蕨渣提高其黃酮得率的一株土壤真菌。李艷賓等選用黃孢原毛平革菌和青霉菌發(fā)酵,研究對甘草渣中黃酮類化合物提取的影響。經(jīng)發(fā)酵后黃酮得率分別為0.89%、0.87%,比未發(fā)酵處理的黃酮得率提高了34.85%、31.82%[22-23]。這說明,對于預(yù)處理菌株的篩選與評價(jià)能夠找到顯著提高黃酮得率的優(yōu)勢菌株。借助復(fù)葉耳蕨渣自身含有的一些營養(yǎng)物質(zhì)和微量無機(jī)元素,如粗蛋白、粗纖維、粗脂肪以及氮、磷、鉀等,它們可以提供土壤真菌生長的基本條件[19]。利用土壤真菌自身產(chǎn)酶破環(huán)細(xì)胞纖維結(jié)構(gòu)和促進(jìn)有效成分溶出的特點(diǎn),具有一定轉(zhuǎn)化和富集復(fù)葉耳蕨渣有效成分的作用。

2.3 發(fā)酵時(shí)間對總黃酮得率的影響

由圖2可知當(dāng)F2發(fā)酵復(fù)葉耳蕨渣在3～7d之間時(shí),隨著發(fā)酵天數(shù)的延長總黃酮提取得率增大,當(dāng)F2發(fā)酵復(fù)葉耳蕨藥渣7d時(shí),總黃酮提取絕對得率最大為0.8673%;比未發(fā)酵處理的黃酮得率提高了25.5%,但時(shí)間超過7d時(shí),隨著時(shí)間的延長總黃酮得率不再增加。同時(shí),圖2也可看出隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,復(fù)葉耳蕨渣重量下降,這說明發(fā)酵3～7d時(shí)間,F2菌株以改變復(fù)葉耳蕨渣木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)為主,促進(jìn)黃酮的溶出和轉(zhuǎn)化,而時(shí)間延長F2菌株分泌的胞外酶系影響了黃酮的轉(zhuǎn)化和同時(shí)導(dǎo)致提取的雜質(zhì)增多,所以F2發(fā)酵復(fù)葉耳蕨渣適宜的時(shí)間選擇7d較好。

圖2 F2發(fā)酵時(shí)間對復(fù)葉耳蕨藥渣和總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of F2fermentation time on extraction rate of total flavonoids and Arachniodes exilis dregs

2.4 pH對F2發(fā)酵前后藥渣總黃酮得率的影響

由圖3可知當(dāng)F2發(fā)酵前后渣提取pH在4～7之間時(shí),隨著pH的升高總黃酮得率隨之增大,當(dāng)pH為7時(shí),總黃酮的得率最大為0.8372%,比未發(fā)酵處理的黃酮得率提高了23.2%,pH超過7后,總黃酮得率反而有些下降。因?yàn)辄S酮類化合物酸堿性是影響其溶解度的重要因素,黃酮類化合物的酸性強(qiáng)弱與酚羥基數(shù)目的多少和位置有關(guān),原料不同,總黃酮的特性和結(jié)構(gòu)等有所不同。黃酮若以7,4′-二-OH等結(jié)構(gòu)形式,其酸性較強(qiáng),在p-π共軛效應(yīng)的影響下,使酸性增強(qiáng)可溶于碳酸氫鈉水溶液,而5-OH,因可與4-羰基形成分子內(nèi)氫鍵,酸性最弱,需要?dú)溲趸c等堿性較強(qiáng)的溶液來提取。所以圖3表明復(fù)葉耳蕨渣總黃酮提取pH選擇7較合適。

圖3 pH對發(fā)酵和未發(fā)酵復(fù)葉耳蕨藥渣總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of pH on extraction rate of total flavonoids fromfermented and un-fermented Arachniodes exilis dregs

2.5 料液比對F2發(fā)酵前后復(fù)葉耳蕨渣總黃酮得率的影響

由圖4可知當(dāng)復(fù)葉耳蕨渣(g)和乙醇溶液體積(mL)比例在1∶10～1∶30時(shí),隨增加乙醇溶液體積總黃酮得率隨之增大,當(dāng)料液比為1∶30(g/mL)時(shí),總黃酮的提取得率最大為0.8312%,比未發(fā)酵處理的黃酮得率提高了23.7%,但乙醇溶液體積超過30mL時(shí),總黃酮的得率反而下降,同時(shí)增加了提取溶劑體積的消耗，因此正交實(shí)驗(yàn)選擇1∶10～1∶30(g/mL)。

圖4 料液比對發(fā)酵和未發(fā)酵 復(fù)葉耳蕨藥渣總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of solid-to-solvent on extraction rate of total flavonoids from fermented and un-fermented Arachniodes exilis dregs

2.6 乙醇濃度對F2發(fā)酵前后渣總黃酮得率的影響

由圖5可知當(dāng)乙醇濃度在50%～70%之間時(shí),隨著乙醇濃度的增大復(fù)葉耳蕨渣總黃酮得率隨之增大,當(dāng)乙醇濃度為70%時(shí),渣總黃酮的提取得率最高為0.8379%,比未發(fā)酵處理的黃酮得率提高了24.7%,因此正交實(shí)驗(yàn)選擇乙醇濃度60%～80%。

圖5 乙醇濃度對發(fā)酵和未發(fā)酵 復(fù)葉耳蕨藥渣總黃酮得率的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on extraction rate of total flavonoids from fermented and un-fermented Arachniodes exilis dregs

2.7 超聲時(shí)間對F2發(fā)酵前后渣總黃酮得率的影響

從圖6實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,超聲提取時(shí)間為40min時(shí),復(fù)葉耳蕨渣總黃酮提取得率最高為0.8422%,比未發(fā)酵處理的黃酮得率提高了25.4%,隨著超聲提取時(shí)間的繼續(xù)增加,總黃酮得率反而有些下降,說明復(fù)葉耳蕨渣總黃酮隨著超聲提取時(shí)間延長性質(zhì)不穩(wěn)定容易分解，因此正交實(shí)驗(yàn)選擇30～50min。

圖6 超聲提取時(shí)間對發(fā)酵和未發(fā)酵 復(fù)葉耳蕨藥渣總黃酮得率的影響Fig.6 Effect of extraction time on extraction rate of total flavonoids from fermented and un-fermented Arachniodes exilis dregs

2.8 復(fù)葉耳蕨渣F2發(fā)酵前后總黃酮提取正交優(yōu)化

通過對復(fù)葉耳蕨渣總黃酮提取單因素的考察,確定了總黃酮提取率最高的發(fā)酵工藝,即復(fù)葉耳蕨渣與水比例為5∶6,發(fā)酵時(shí)間1周,三區(qū)接種,25℃培養(yǎng)。通過正交實(shí)驗(yàn)方法,確定影響復(fù)葉耳蕨中總黃酮提取主次因素及相互關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果及統(tǒng)計(jì)分析見表3和表4。由表3可知,各因素顯著性依次為:影響因素順序次序?yàn)?A(料液比)>B(乙醇濃度)>C(超聲時(shí)間),最佳提取工藝為A3B2C2,即料液比1∶30,乙醇濃度70%,時(shí)間40min。由表4方差分析結(jié)果可知,查F分布表得:F0.01(2,2)=99.00,F0.05(2,2)=19.00;因?yàn)镕A=120.333>F0.01(2,2)=99.00,故料液比A有極其顯著的影響;因?yàn)镕B=48.667和FC=31.667>F0.05(2,2)=19.00,故乙醇濃度B、超聲時(shí)間C有顯著的影響。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表Table 3 Results of orthogonal test

表4 正交實(shí)驗(yàn)的方差分析表Table 4 Analysis of variance of orthogonal design

注:標(biāo)有**的說明該因素有極其顯著的影響,標(biāo)有*的說明該因素有顯著的影響,未標(biāo)有*的說明該因素沒有顯著影響。

研究以總黃酮得率變化為主要評價(jià)指標(biāo),考察了復(fù)葉耳蕨渣經(jīng)土壤真菌發(fā)酵后總黃酮的變化,由實(shí)驗(yàn)可知土壤真菌發(fā)酵可顯著提高復(fù)葉耳蕨渣總黃酮得率,說明土壤真菌生物轉(zhuǎn)化對升高有效成分有意義。

2.9 復(fù)葉耳蕨渣F2發(fā)酵前后總黃酮提取驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按A3B2C2條件進(jìn)行F2發(fā)酵前后復(fù)葉耳蕨藥渣3次平行提取實(shí)驗(yàn),從圖7實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明發(fā)酵后復(fù)葉耳蕨渣總黃酮提取得率為0.9177%,比未發(fā)酵處理的黃酮得率提高了30.6%,高于表4中每一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。所以在最佳提取工藝條件A3B2C2下,F2菌株有效地提高了復(fù)葉耳蕨渣中總黃酮含量,有利于復(fù)葉耳蕨總黃酮的合理開發(fā)、利用。復(fù)葉耳蕨渣的再利用不僅解決了復(fù)葉耳蕨資源的浪費(fèi)和環(huán)境污染的問題,又經(jīng)發(fā)酵增加了其總黃酮的含量,有待進(jìn)一步深入探討其作為食品功能和保健成分的生物學(xué)意義。

圖7 發(fā)酵和未發(fā)酵復(fù)葉耳蕨藥渣總黃酮優(yōu)化得率Fig.7 Optimal extraction rate of total flavonoids fromfermented and un-fermented Arachniodes exilis dregs

2.10 復(fù)葉耳蕨渣F2發(fā)酵前后總黃酮對DPPH自由基的清除效果

由圖8可知,在0.01～0.64g/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi),復(fù)葉耳蕨渣F2發(fā)酵前后總黃酮質(zhì)量濃度和DDPH自由基清除率有著良好的量效關(guān)系,清除率隨總黃酮質(zhì)量濃度的增大表現(xiàn)了逐步上升的趨勢。發(fā)酵后總黃酮清除DPPH自由基能力稍有提高,差異無顯著性意義,說明總黃酮得率提高抗氧化能力未見減弱。與VE清除DPPH自由基能力比較,復(fù)葉耳蕨渣F2發(fā)酵前后總黃酮表現(xiàn)出優(yōu)于VE的清除自由基的能力。

圖8 不同質(zhì)量濃度總黃酮對DPPH自由基清除效果Fig.8 Comparison of scavenging effects of total flavonoids and Vit E at various concentrations on DPPH free radical

3 結(jié)論

3.1 研究探索了土壤真菌發(fā)酵輔助復(fù)葉耳蕨渣提取總黃酮的優(yōu)勢菌株。經(jīng)復(fù)葉耳蕨渣作為直接固體發(fā)酵底物,獲得F2菌株是適于處理復(fù)葉耳蕨渣提高其黃酮得率的一株土壤真菌。

3.2 實(shí)驗(yàn)采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選得出F2菌株發(fā)酵復(fù)葉耳蕨渣前后總黃酮提取的最佳工藝條件:料液比1∶30(g/mL)、乙醇濃度70%、超聲提取時(shí)間40min,得到發(fā)酵后復(fù)葉耳蕨渣總黃酮最佳提取率較發(fā)酵前提高了30.6%。復(fù)葉耳蕨渣F2發(fā)酵前后總黃酮均表現(xiàn)出優(yōu)于VE的良好量效關(guān)系的清除DDPH自由基能力,但發(fā)酵前后總黃酮清除DPPH自由基能力無顯著性差異。

3.3 因復(fù)葉耳蕨總黃酮含量較少,實(shí)驗(yàn)所得發(fā)酵復(fù)葉耳蕨渣總黃酮粗品中黃酮含量較低,如何利用微生物轉(zhuǎn)化技術(shù),進(jìn)一步提高產(chǎn)品得率和純度,仍有待多方面深入研究。研究也表明,復(fù)葉耳蕨渣經(jīng)土壤真菌F2發(fā)酵后,總黃酮的得率顯著提高,說明利用微生物發(fā)酵能夠?qū)崿F(xiàn)復(fù)葉耳蕨渣總黃酮的選擇性分離?？梢?利用土壤真菌發(fā)酵復(fù)葉耳蕨渣輔助提取總黃酮工藝具有總黃酮得率高、穩(wěn)定性好、操作簡單和生產(chǎn)成本較低等優(yōu)點(diǎn),有利于開發(fā)工業(yè)生產(chǎn)[24-25]。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn),發(fā)酵時(shí)間超過一定天數(shù)后,總黃酮得率出現(xiàn)下降。因此,控制好合適的發(fā)酵時(shí)間尤為重要。除發(fā)酵時(shí)間外,總黃酮得率還受發(fā)酵溫度、氮源和發(fā)酵基質(zhì)含水率等因素影響,表明實(shí)驗(yàn)所用F2菌株在復(fù)葉耳蕨藥渣總黃酮的微生物發(fā)酵提取領(lǐng)域中進(jìn)一步研究有較好的應(yīng)用前景。

[1]秦仁昌.關(guān)于復(fù)葉耳蕨的命名問題[J].植物學(xué)報(bào),1962,10(3):253-263.

[2]Libor E,Renata H,Pavel T,et al. Species boundaries and frequency of hybridization in the Dryopteris carthusiana(Dryopteridaceae)complex:A taxonomic puzzle resolved using genome size data[J]. American Journal of Botany,2010,97(7):1208-1219.

[3]Nakaike T. A synoptical study on theFernGenusArachniodesBlume(Dryopteridaceae)[J]. Journal of phytogeography and taxonomy ,2001,49(1):7-30.

[4]何海.復(fù)葉耳蕨屬分類研究綜述[J].重慶師范學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2003,20(2):42-47.

[5]姚果原,譚愛理,汪又奇,等.復(fù)葉耳蕨抗生育實(shí)驗(yàn)研究[J].中藥通報(bào),1985,10(9):40-41.

[6]Zhou D N,Ruan J L,Cai Y L,et al. Antioxidant and hepatoprotective activity of ethanol extract ofArachniodesexilis(Hance)Ching[J]. Journal of Ethnopharmacology，2010,129(2):232-237.

[7]Li H M,Chen J,Xiong C M,et al. Apoptosis induction by the total flavonoids fromArachniodesexilisin HepG2 cells through reactive oxygen species-mediated mitochondrial dysfunction involving MAPK activation[J].Evidence-based complementary and alternative medicine,2014,(2):1-11.

[8]李輝敏,殷嫦嫦,吳家忠,等.刺頭復(fù)葉耳蕨不同提取部位體外抗HIV-1蛋白酶活性的研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2013,24(1):3-4.

[9]梁廣勝,殷嫦嫦,殷明,等.復(fù)葉耳蕨總黃酮對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和成骨分化的影響[J].中成藥,2014,36(3):456-461.

[10]張磊,李輝敏.AB-8樹脂分離提取復(fù)葉耳蕨中總黃酮含量的測定[J].九江醫(yī)學(xué),2003,18(4):193-194.

[11]Zhou D N,Ruan J L,Cai Y L,et al. Three new polyphenols from the rhizomes ofArachniodesexilis[J]. Journal of asian natural product research，2008,10(6):559-563.

[12]方偉,阮金蘭,王仲,等. 斜方復(fù)葉耳蕨的化學(xué)成分研究[J].中國中藥雜志,2008,33(6):649-650.

[13]Triantafyllou A,Mylonis I,Simos G,et al. Flavonoids induce HIF-1α but impair its nuclear accumulation and activity[J].Free Radical Biology and Medicine,2008,44(4):657-670.

[14]Fang Y Z,Yang S,Wu G Y. Free radicals,antioxidants,and nutrition[J]. Nutrition,2002,18(10):872-879.

[15]Wang S Y,Feng R T,Bowman L ,et al. Antioxidant activity in lingonberries(Vaccinium vitis-idaea L.)and its inhibitory effect on activator protein-1,nuclear factor-κB,and mitogen-activated protein kinases activation[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2005,53(2):3156-3166.

[16]Sana M,Ines B,Imen H,et al. Antioxidant Potential of Ulva rigida Extracts:Protection of HeLa Cells Against H2O2Cytotoxicity[J].The Biology Bulletin,2013,225(1):1-7.

[17]Cvoro A,Paruthiyil S,Jones J,et al. Selective activation of estrogen receptor-beta transcriptional pathways by an herbal extract[J]. Endocrinology,2007,148(2):538-547.

[18]Mersereau J,Levy N,Staub R,et al. Liquiritigenin is a plant-derived highly selective estrogen receptor β agonist[J]. Molecular and Cellular Endocrinology,2008,283(1):49-57.

[19]李輝敏,石向群.復(fù)葉耳蕨根中微量元素鋅鐵銅錳含量測定[J]. 中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué),2010,27(4):333-335.

[20]朱靈峰,張召躍,王海燕,等.真菌傳統(tǒng)分離方法及應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(30):16717-16719,16741.

[21]梁晨,呂國忠.土壤真菌分離和計(jì)數(shù)方法的探討[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2000,31(5):515-518.

[22]李艷賓,張琴,陶呈宇,等. 微生物發(fā)酵提高甘草渣中黃酮類物質(zhì)提取率的研究[J].食品研究與開發(fā),2010,31(9):156-159.

[23]喬仲和,胡自如.甘草渣中大量黃酮類化合物的分離及甘草的綜合開發(fā)研究[J].中草藥,1997(9):522-524.

[24]劉學(xué)湘,陳建偉.中藥有效成分生物轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2008,27(2):14-18.

[25]潘明,徐軼婷,王世寬,等.利用生物轉(zhuǎn)化技術(shù)改良中藥材品質(zhì)[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(9):4589-4591,4609.

Extraction of total flavonoids inArachniodesexilisdregs assisted by soil fungi

ZHANG Yi-ping,HU Yue-ping,WU Ya-hua,SUN Wei-jun,ZHOU Xu-feng,CAO Jun,WANG Li-li,YIN Chang-chang

(School of Basic Medical Science,Jiujiang University,Jiujiang 332000,China)

The soil fungi-assisted extraction of total flavonoids fromArachniodesdregsand its DPPH scavenging capacity was studied in the paper. Soil fungi were separated and puritied by the gradient dilution method. TheArachniodesdregswere fermented by them,and single factor test and orthogonal test L9(34)were employed to optimize the best condition of extracting their total flavonoids by ultrasonic assistant. The antioxidant activities of total flavonoids were studied by DPPH scavenging test. The yield of the flavonoids was 0.893%±0.035% by the method. Comparing with ultrasonic extraction,the extraction ratio of total flavonoids inArachniodesdregsfermented by F2were 27.0% higher than without fermentation. Under optimized extraction conditions of flavonoids with orthogonal test,which were solid to liquid ratio 1∶30(g/mL),ethanol concentration 70%(v/v)and ultrasonic extract 40min,the yield of the flavonoids was 30.6% higher than without fermentation. The total flavonoids extracted fromArachniodesdregsbefore and after fermentation possessed stronger scavenging effect on DPPH thanVE. The results showed that compared to ethanol extracting method,soil fungi fermentation could promote the yield of flavonoids significantly,total flavonoids inArachniodesdregsfermented by F2are effective as natural antioxidants,which provided the basis of recycling the resources ofArachniodesdregsfor future.

Arachniodesexilis;soil fungi;solid state fermentation;DPPH scavenging

2014-08-08

張義平(1971-),男,碩士,副教授,研究方向:微生物轉(zhuǎn)化天然植物的食藥用產(chǎn)品開發(fā)和分子機(jī)制研究。

國家自然科學(xué)基金(81360364)。

TS284.2

A

1002-0306(2015)11-0100-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.012