復(fù)發(fā)性流產(chǎn)與宮頸HPV感染的相關(guān)性分析*

鐘小敏

復(fù) 發(fā) 性 流 產(chǎn)（Recurrent spontaneous abortions，RSA）是指與同一性伴侶連續(xù)發(fā)生2 次或2 次以上的自然流產(chǎn)[1-2]。其病因復(fù)雜，主要包括免疫、感染、遺傳、環(huán)境、內(nèi)分泌、血栓前狀態(tài)等因素，部分患者原因不明[3]。流行病學(xué)資料顯示RSA發(fā)生率約為15-40%，2次或2次以上的流產(chǎn)約占生育期婦女的2%~4%，而3次或3次以上的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)約為1%~2%，且近年來伴隨著生活習(xí)慣、飲食結(jié)構(gòu)的不斷變化，RSA的發(fā)病率逐年增加。近年研究表明，RSA約50%~60%與免疫紊亂有關(guān)，同時(shí)感染因素也占相當(dāng)大比重，但由于各種病原體對胚胎毒性的作用不確切，故感染與RSA的關(guān)系最受爭議[4]。目前國內(nèi)外關(guān)于RSA與HPV感染的關(guān)系報(bào)道較少。盧銀平等[5]對RSA孕婦流產(chǎn)組織的研究發(fā)現(xiàn)，人細(xì)小病毒B19感染可能與RSA發(fā)生密切相關(guān)。姚守珍等[6]對RSA病毒E-鈣黏素及HPV相關(guān)性后發(fā)現(xiàn)RSA患者中E-鈣黏素陽性率顯著低于非RSA患者，HPV感染的陽性率顯著高于RSA感染患者，其認(rèn)為RSA與HPV感染有一定的相關(guān)性。為更好的探討RSA與HPV感染的相關(guān)性，本文選取了較大樣本的RSA患者與非RSA患者進(jìn)行對照研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 將本站婦科門診就診的早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（RSA）98例患者作為實(shí)驗(yàn)組，排除標(biāo)準(zhǔn)：子宮畸形、宮內(nèi)（細(xì)菌、真菌、原蟲等）感染、內(nèi)分泌及夫婦染色體異常，以及既往有自身免疫性疾病史；選取同時(shí)期妊娠的非RSA女性95例為對照組，入選標(biāo)準(zhǔn)為：診斷為早孕、非意愿正常妊娠要求終止妊娠，排除標(biāo)準(zhǔn)同RSA患者。RSA診斷標(biāo)準(zhǔn)為：與同一性伴侶連續(xù)遭遇2次或2次以上在20周妊娠前或胎兒丟失（體重≤500 g）。實(shí)驗(yàn)組患者年齡22~35歲，平均（28.9±4.7）歲，孕周5+2~12+4周，平均（7.1±3.6）周，孕次3~7次，流產(chǎn)2~6次。對照組患者年齡24~37歲，平均（29.2±5.1）歲，孕周4+6~12+2周，平均（6.9±3.7）周，孕次1~5次，流產(chǎn)0~4次。兩組患者的年齡、孕周比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 實(shí)驗(yàn)室取材 觀察組在確認(rèn)胚胎停止發(fā)育，對照組于人工流產(chǎn)時(shí)進(jìn)行取樣，取樣時(shí)采用棉拭子輕輕拭凈宮頸口過多的分泌物，再用宮頸刷，在宮頸管內(nèi)鱗柱上皮交界處采樣，采樣時(shí)稍用力轉(zhuǎn)動(dòng)數(shù)周，取得宮頸脫落細(xì)胞，放入有專用細(xì)胞保存液的試管中采集標(biāo)本密閉，并在2 h內(nèi)保存于4 ℃冰箱中，在48 h內(nèi)進(jìn)行下一步檢查。

1.3 基因檢測 采用導(dǎo)流雜交基因芯片技術(shù)，進(jìn)行23種（18種高危型和5種低危型）HPV基因型的檢測。主要步驟：（1）樣本處理及HPV-DNA提取和富集：將選取的細(xì)胞樣本加入預(yù)先配置的細(xì)胞消化液釋放細(xì)胞DNA。（2）HPV-PCR擴(kuò)增：選擇HPVl基因區(qū)共有引物GP5+/GP6+和β-globin基因引物Glob-F/Glob-R對所有標(biāo)本進(jìn)行PCR 檢測，后選用改進(jìn)MY09/11共有引物（PGMY09/11）對所有β-Globin陽性而HPV陰性的標(biāo)本進(jìn)行二次擴(kuò)增，檢測HPV-611，16，18，30，31，33，35，45，51和52，采用目的基因的量/內(nèi)參基因的量消除樣本間的擴(kuò)增效率差異，每管樣本重復(fù)測量3次。PCR擴(kuò)增程序設(shè)定，溫度變化設(shè)定：95 ℃ 10 s， 95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，75 ℃ 10 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，溫度變化速率20 ℃/s。

1.4 觀察指標(biāo) （1）比較兩組人群的HPV各亞型分布情況；（2）將HPV16、HPV18作為HPV感染的高危組，HPV33、HPV58、HPV31作為低危組[7]，比較兩組人群的高危及低危比例；（3）將HPV感染與RSA進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，采用 字2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman方法，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV感染情況 實(shí)驗(yàn)組中HPV陽性34例（34.7%），對照組HPV陽性12例（12.6%），實(shí)驗(yàn)組HPV陽性率顯著高于對照組（ 字2=16.186，P<0.001）。實(shí)驗(yàn)組HPV陽性中HPV33、HPV58、HPV31、HPV18亞型所占例與對照組HPV陽性占各亞型比例比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），HPV16亞型在實(shí)驗(yàn)組比例顯著高于對照組（P<0.05）。見表1。

表1 兩組人群HPV亞型的分布情況 例（%）

2.2 HPV低危與HPV高危感染情況 實(shí)驗(yàn)組中HPV高危比例顯著高于對照組（P<0.001）。見表2。

表2 RSA感染的HPV低危與HPV高危的感染情況 例

2.3 HPV感染與RSA相關(guān)性分析 HPV陽性與RSA發(fā)生呈正相關(guān)性（r=0.259，P<0.001）。

3 討論

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的治療可謂醫(yī)學(xué)界的一大“難題”，其病因復(fù)雜，部分患者病因不清。其中約50%~60%與免疫紊亂有關(guān)，同時(shí)感染因素也占相當(dāng)大比重，但由于各種病原體對胚胎毒性的作用不確切，故感染與RSA的關(guān)系最受爭議。HPV是目前已明確的與宮頸病變有關(guān)的病原體，最近報(bào)道，城市醫(yī)院門診患者HPV感染率高達(dá)21.82%，但僅少數(shù)轉(zhuǎn)變?yōu)槌掷m(xù)性感染，發(fā)展為CIN，甚至進(jìn)展為浸潤癌，在這一過程中，宿主的免疫反應(yīng)對HPV感染的轉(zhuǎn)歸起著決定性作用。有關(guān)HPV感染與RSA的關(guān)系，國內(nèi)僅1例報(bào)道HPV可能參與了復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的過程，國外研究結(jié)果尚存爭議。故對妊娠早期RSA女性HPV感染的發(fā)生率和基因型的分布與非RSA者進(jìn)行比較分析，探討HPV感染與RSA的關(guān)聯(lián)性，對于RSA患者的診斷及預(yù)防提供新的方向，提升RSA患者的預(yù)后有重要的價(jià)值。

研究資料顯示，HPV的主要易感因素為：性伴侶多且不固定、過早性生活、遺傳、激素、生活環(huán)境等，其中宿主的免疫功能狀況起著十分重要的作用。在年輕婦女中，HPV感染普遍存在，多可自然緩解，僅少數(shù)轉(zhuǎn)變?yōu)槌掷m(xù)性感染，發(fā)展為CIN，甚至進(jìn)展為浸潤癌[8]。王莉等[9]認(rèn)為，宿主免疫反應(yīng)對HPV感染的轉(zhuǎn)歸起著決定性作用。基于RSA和HPV感染均與免疫功能狀態(tài)密切相關(guān)性，以及感染因素在RSA發(fā)生中所占的重要比重，RSA與HPV的可能相關(guān)性受到更多學(xué)者的關(guān)注。Hermonat等[10]首先發(fā)現(xiàn)，在自然流產(chǎn)組織中HPV感染率明顯高于人工流產(chǎn)者，認(rèn)為自然流產(chǎn)的發(fā)生可能與HPV感染有關(guān)。而Skoczyński等[11]報(bào)道，在RSA 的流產(chǎn)組織中與足月分娩胎盤中，HPV感染率并沒有顯著差異，但需要大樣本研究進(jìn)一步證實(shí)。Weyn等[12]發(fā)現(xiàn)了HPV存在于胎盤組織中的證據(jù)，認(rèn)為HPV可以通過宮頸或受感染的精液而上行性感染，間接推測宮頸HPV感染者自然流產(chǎn)率可能高于非感染者。

本文的研究中采用的DNA分析方法為熒光定量PCR方法，其是指在PCR的反應(yīng)體系中通過添加熒光，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)的實(shí)現(xiàn)監(jiān)測整個(gè)PCR的進(jìn)程，目前臨床上包含有2種熒光體系，其一為在反應(yīng)中通過使用插入性熒光材料如，SYBR Green，加入該染料后，DNA模板可結(jié)合到雙鏈DNA上并出現(xiàn)熒光，未結(jié)合的SYBR Green則不能發(fā)出熒光，另一種方法為使用熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針，通過探針結(jié)合到靶向序列上，通過探針與靶序列作用發(fā)出熒光。本研究即通過該種方法實(shí)現(xiàn)HPV分型診斷的目的。本文的研究中對RSA患者與非RSA患者的HPV感染情況進(jìn)行基因檢測后發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組中HPV陽性34例，占比34.7%，非RSA組HPV陽性12例，占比12.6%，實(shí)驗(yàn)組HPV陽性率顯著高于對照組（ 字2=16.186，P<0.001）。提示RSA患者HPV的感染率顯著高于非RSA患者，RSA的發(fā)生與HPV感染可能有密切關(guān)聯(lián)。在對RSA與非RSA患者HPV感染各亞型占HPV感染陽性比例進(jìn)行對比后發(fā)現(xiàn)，RSA患者的HPV陽性中各HPV33、HPV58、HPV31、HPV18例與非RSA患者HPV陽性占各亞型比例比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），HPV16亞型在RSA患者中比例顯著高于非RSA患者（P<0.05），提示HPV16感染亞型可能為引發(fā)RSA的高危型。吳意等[13]在對HPV引發(fā)宮頸癌病理進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，宮頸癌患者中HPV病變率高達(dá)18.29%，其中HPV16占比高達(dá)44.3%，且HPV16在低度宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變（LSIL）、高度宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變（HSIL）宮頸癌的檢出率均為最高，依次為25.29%、57.14%、75.00%，提示HPV16感染可能在高危型子宮病變的發(fā)生及發(fā)展中起重要作用。目前關(guān)于HPV感染引發(fā)RSA的確切病理機(jī)制尚不明確，Boulenouar等[14]對HPV16 E5、E6、E7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的絨毛癌BeWo細(xì)胞證，HPV16可有效抑制BeWo、E-cadherin基因的表達(dá)。姚守珍等[6]研究發(fā)現(xiàn)，HPV1感染陽性的孕婦E-鈣黏素陽性率研究組為35.71%，非RSA患者陽性表達(dá)率為100%，E-鈣黏素的陽性表達(dá)被認(rèn)為是妊娠期滋養(yǎng)細(xì)胞合成的重要物質(zhì)，E-鈣黏素表達(dá)抑制常引發(fā)流產(chǎn)[15]。本文的研究還發(fā)現(xiàn)HPV感染與RSA存在正相關(guān)性（r=0.259，P<0.001），但相關(guān)強(qiáng)度較低，分析原因可能與RSA發(fā)病的其他因素，如生活環(huán)境、不良生活習(xí)慣、遺傳等因素有關(guān)。

總之，RSA與HPV感染關(guān)聯(lián)密切，RSA患者中宮頸HPV感染比例顯著高于非RSA患者，但關(guān)于RSA與HPV感染的確切關(guān)系有待于臨床大樣本、多中心對照研究及基礎(chǔ)病理學(xué)進(jìn)行深入探討。

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