海綿體神經(jīng)損傷勃起功能障礙大鼠模型的建立*

齊濤 王博 蔣滿波 陳俊 張濱

男性陰莖勃起是在內(nèi)源性或者外源性刺激誘導(dǎo)下通過神經(jīng)內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)，作用于陰莖海綿體內(nèi)皮細(xì)胞及海綿體血管平滑肌所產(chǎn)生一系列的血流動(dòng)力學(xué)變化而導(dǎo)致的陰莖海綿體充血增大增粗現(xiàn)象。與陰莖勃起密切相關(guān)的外周勃起神經(jīng)為陰莖海綿體神經(jīng)（Cavernous nerve，CN），其為盆腔大神經(jīng)節(jié)（Pelvic major ganglion，MPG）發(fā)出混合性神經(jīng)纖維束，與伴行的血管組成神經(jīng)血管束（Neurovascular bundle，NVB）。CN經(jīng)陰莖腳支配陰莖海綿體前，與盆腔內(nèi)的直腸、膀胱及前列腺緊貼。盆腔手術(shù)及外傷極易損傷CN，特別在男性盆腔惡性腫瘤手術(shù)根治、放療、冷凍消融過程中，為了確保癌患清除徹底，CN損傷難以避免。為進(jìn)一步研究CN損傷導(dǎo)致ED，則需建立一種穩(wěn)定長(zhǎng)久、簡(jiǎn)單易行、省時(shí)節(jié)約CN損傷性ED動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 30只8周齡、體質(zhì)量250~300 g、經(jīng)性交試驗(yàn)明確有正常勃起功能的Sprague-Dawley（SD）雄性成年大鼠（由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），隨機(jī)不等分為兩組，假手術(shù)組（正常對(duì)照組，NC組）5只，海綿體神經(jīng)損傷組（實(shí)驗(yàn)組，CN組25只）。CN組中大鼠分別于術(shù)后1、2、4、8及12周時(shí)間點(diǎn)按照隨機(jī)原則選取5只SD大鼠進(jìn)行CN電刺激下測(cè)壓并頸椎脫臼處死獲取陰莖海綿體組織；NC組大鼠于術(shù)后12周再次手術(shù)進(jìn)行CN電刺激下測(cè)壓后獲取陰莖海綿體組織，所有獲取陰莖海綿體組織經(jīng)石蠟包埋、切片、根據(jù)不同染色后觀察組織結(jié)構(gòu)變化。飼養(yǎng)環(huán)境為：屏蔽系統(tǒng)、溫度25 ℃、濕度50%、周期12 h光照/12 h黑暗、自由獲得食物及飲水、通風(fēng)保持為0.1 m/s。

1.2 監(jiān)測(cè)ICP/MAP 陰莖海綿體內(nèi)壓（Intra-cavernous pressure，ICP）測(cè)定：采用預(yù)先充滿250 IU/mL肝素鈉生理鹽水溶液帶導(dǎo)管22G輸液針經(jīng)陰莖根部穿刺進(jìn)入陰莖海綿體內(nèi)，導(dǎo)管再與壓力換能器相連。平均動(dòng)脈壓（Mean artery pressure，MAP）測(cè)定：對(duì)同一大鼠行頸部正中切口，仔細(xì)分離出左側(cè)頸總動(dòng)脈，向心臟方向插入預(yù)先充滿250 IU/mL肝素鈉生理鹽水溶液帶PE50導(dǎo)管，導(dǎo)管連接壓力換能器。使用泰盟BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)同時(shí)連續(xù)監(jiān)測(cè)ICP、MAP變化。

1.3 手術(shù)操作 使用3%戊巴比妥鈉（Sodium Pentobarbital）按照40 mg/kg劑量經(jīng)腹腔注射麻醉，注射后1 min通過觀察到呼吸平穩(wěn)、夾尾反射消失而證實(shí)麻醉成功。刮凈正中下腹部體毛，術(shù)野用碘伏溶液消毒兩遍，自恥骨聯(lián)合上緣向上正中切開腹壁約3 cm，逐層切開打開腹腔。分辨出精囊、膀胱、前列腺、輸精管及直腸等，在10倍外科手術(shù)顯微鏡下充分暴露前列腺的后外側(cè)并找到MPG及CN（圖1）。自MPG向前列腺尖仔細(xì)分離CN后電刺激CN產(chǎn)生陰莖勃起（雙極微電極電刺激參數(shù)：連續(xù)方波刺激、波寬5 ms、頻率20 Hz、電壓5 V，刺激持續(xù)60 s/次），證實(shí)CN解剖正確[1]。電刺激CN過程中觀察陰莖勃起狀態(tài)同時(shí)監(jiān)測(cè)ICP/MAP。CN組給藥每側(cè)海綿體神經(jīng)間隔1 cm雙重鉗夾，第1處位于距CN的MPG起始處0.5 cm，第2處位于第1處遠(yuǎn)端約2.0 cm處，用標(biāo)準(zhǔn)小彎血管鉗夾住CN并閉合至最后咬齒，持續(xù)鉗夾CN 30 s，再把雙極微電極置于CN損傷中段，給予設(shè)定參數(shù)的電刺激，無陰莖勃起反應(yīng)，證實(shí)CN損傷成功；對(duì)照組大鼠行下腹正中切口切開后僅僅暴露CN，不作其他處理，均以5-0 vicryl線連續(xù)縫合關(guān)閉切口，涂抹紅霉素軟膏預(yù)防術(shù)后切口感染。所有手術(shù)在中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物手術(shù)室中進(jìn)行，術(shù)后均送回中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)環(huán)境行標(biāo)準(zhǔn)方法飼養(yǎng)，見圖1。

圖1 海綿體神經(jīng)CN與盆腔大神經(jīng)節(jié)MPG放大圖

1.4 APO試驗(yàn) 阿撲嗎啡（Apomorphine，APO）是一種直接興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)的陰莖勃起誘導(dǎo)劑[2]。在正常勃起功能SD大鼠皮下注射劑量為150 μg/kg的APO，均可誘發(fā)SD大鼠的陰莖勃起，皮下注射后約5 min起效，約30 min作用消失。根據(jù)SD大鼠注射APO其陰莖是否勃起可以評(píng)估活體生理狀態(tài)下CN損傷性ED的大鼠模型建模是否成功。所有大鼠均于處死前1 d行APO試驗(yàn)，具體過程：于大鼠頸部皮下按照150 μg/kg的劑量注射APO，置于自制透明盒內(nèi)觀察30 min，并用攝像機(jī)自下而上記錄陰莖勃起情況。APO皮下注射后，大鼠均有軀體伸直、毛發(fā)豎起、活動(dòng)增加、打呵欠等表現(xiàn)，有陰莖勃起時(shí)大鼠表現(xiàn)為蹲踞位，并舔舐陰莖體末端露出的陰莖頭，同時(shí)臀部出現(xiàn)節(jié)律地抖動(dòng)。以陰莖體末端外露算一次勃起，計(jì)算陰莖勃起次數(shù)并進(jìn)行比較。

1.5 組織結(jié)構(gòu)觀察 大鼠行各項(xiàng)功能學(xué)檢測(cè)后立即脫頸椎處死并切取陰莖中段組織，預(yù)冷PBS漂洗后，放入40 g/L多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋后制作4 μm切片，用于HE染色。每張切片隨機(jī)連續(xù)選取不重疊的5個(gè)高倍視野（×400），觀察海綿體結(jié)構(gòu)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)及單因素方差分析（one-way ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般情況比較 30只大鼠中，CN組中1只手術(shù)后麻醉復(fù)蘇失敗死亡，余24只及NC組5只生長(zhǎng)良好，未見切口感染。

2.2 兩組APO試驗(yàn)結(jié)果比較 CN組術(shù)后第1、2、4、8及12周大鼠頸部皮下注射APO后觀察30 min內(nèi)陰莖勃起率和平均勃起次數(shù)均為0，NC組為100%（5/5）和（3.40±1.14）次。顯示CN組術(shù)后12周內(nèi)CN損傷未恢復(fù)、CN損傷性ED模型穩(wěn)定持久。CN組與NC組間陰莖勃起率、陰莖勃起次數(shù)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 兩組ICP/MAP測(cè)定結(jié)果比較 NC組術(shù)前、術(shù)后第12周ICP/MAP分別為（0.63±0.08）、（0.60±0.09），術(shù)前、術(shù)后比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。CN組術(shù)前，術(shù)后第1、2、4、8及12周電刺激時(shí)ICP/MAP分別為（0.64±0.09）、（0.20±0.03）、（0.21±0.04）、（0.25±0.05）、（0.23±0.04）、（0.24±0.06），CN組術(shù)后兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），CN組術(shù)前與術(shù)后比較ICP/MAP差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.4 海綿體組織結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果 NC組海綿體組織纖維化手術(shù)前后無明顯改變。與術(shù)前相比CN組大鼠海綿體組織纖維化在術(shù)后第1周開始增加，第4~8周最明顯，第12周時(shí)有所減輕。

3 討論

前列腺癌是最常見的男性泌尿生殖系腫瘤，在美國(guó)男性新發(fā)癌癥中列于第1位，男性癌癥中死亡率位于第2位[3]。上個(gè)世紀(jì)局限性前列腺癌的常用治療方法是前列腺癌根治術(shù)（RP），但術(shù)后常伴有ED，極大影響患者及其配偶的生活質(zhì)量[4]。Walsh等[5]最先開展保留神經(jīng)的前列腺癌根治術(shù)，但患者術(shù)后總體勃起功能恢復(fù)率仍不理想，ED最終發(fā)生率仍約為40%。尤其是對(duì)臨床T2b期以上、PSA>20 ng/mL、Gleason評(píng)分≥7分的前列腺癌患者而言，保留神經(jīng)會(huì)增加切緣腫瘤殘留的幾率，因而不得不切斷單側(cè)或雙側(cè)CN最終不可避免導(dǎo)致術(shù)后ED的出現(xiàn)[6-8]。

因勃起的神經(jīng)傳導(dǎo)通路損害導(dǎo)致勃起功能障礙，稱為神經(jīng)性ED。海綿體神經(jīng)（CN）又稱為勃起神經(jīng)，是調(diào)控勃起的最重要的周圍神經(jīng)，因此也成為制作神經(jīng)性ED的首選神經(jīng)[9-12]。在人體上直接進(jìn)行CN損傷性ED的探索性研究存在倫理、重復(fù)性等多方面因素的限制，許多治療必須先在ED動(dòng)物模型反復(fù)研究后才能運(yùn)用于臨床。手術(shù)、骨盆骨折合并尿道外傷、前列腺癌根治術(shù)等都極易損傷CN導(dǎo)致ED，因此可通過切斷、冷凍或擠壓損傷海綿體神經(jīng)制作CN損傷性ED模型[11]。

1989年Quinlan等[13]采用大鼠建立了陰莖海綿體神經(jīng)損傷模型，研究中發(fā)現(xiàn)大鼠的CN與人類的盆腔神經(jīng)血管束具有相似的結(jié)構(gòu)，且價(jià)格便宜，容易飼養(yǎng)，成為建立CN損傷模型的首選實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。El-Sakka等[14]用干冰冷凍單側(cè)海綿體神經(jīng)的方法制作神經(jīng)性ED模型，發(fā)現(xiàn)1個(gè)月冷凍所造成的海綿體神經(jīng)損傷的顯著病理生理改變?cè)诘?個(gè)月時(shí)有所恢復(fù)，并且伴隨著NOS的相應(yīng)變化。Zhang等[15]在國(guó)內(nèi)首次建立海綿體神經(jīng)離斷后ED大鼠模型，他們對(duì)大鼠海綿體神經(jīng)進(jìn)行解剖，在10倍外科顯微鏡下仔細(xì)找出并游離海綿體神經(jīng)，使用電刺激誘發(fā)陰莖勃起證實(shí)其解剖學(xué)走行后，進(jìn)行雙側(cè)海綿體神經(jīng)離斷術(shù)，術(shù)后第3周行APO均無勃起反應(yīng)。孫磊等[16]也使用這種方法成功建立了神經(jīng)性ED大鼠模型，并用ICP評(píng)估模型是否成功建立。王飛翔等[17]用血管鉗雙側(cè)鉗夾海綿體神經(jīng)1 min制作海綿體神經(jīng)損傷模型，造模1個(gè)月后，用電刺激試驗(yàn)證實(shí)，海綿體未見明顯腫脹、充血，提示勃起功能喪失。本研究將采用雙側(cè)海綿體神經(jīng)CN鉗夾損傷法制作海綿體神經(jīng)損傷性ED大鼠模型可以完全滿足研究需要。相對(duì)于切斷CN的方法，鉗夾法也能導(dǎo)致神經(jīng)性ED發(fā)生，同時(shí)不破壞CN固有結(jié)構(gòu)的破壞，可以方便觀察干預(yù)治療CN損傷效果[18]。Yamashita等[19]通過比較雙側(cè)CN橫斷與CN游離ED大鼠模型，認(rèn)為游離鉗夾損傷更加類似盆腔手術(shù)后ED。另有研究表明在陰莖腳處CN（自主神經(jīng)）、陰莖背神經(jīng)（感覺神經(jīng)）和陰部神經(jīng)（軀體神經(jīng)）有豐富的交通支[20]。為了避免單一鉗夾CN后因交通支而導(dǎo)致?lián)p傷過早恢復(fù)，本研究采用CN序貫間隔雙重鉗夾法增強(qiáng)了CN損傷性ED模型穩(wěn)定性，為CN損傷后ED的研究提供更加適合的動(dòng)物模型。

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