補腎醒腦方對血管性癡呆大鼠膽堿能抗炎通路的影響*

胡久略，郅 琳，卞 華，丁吉善，楊淑慧 (.河南省宛西制藥股份有限公司，河南 南陽 474550； .南陽理工學(xué)院張仲景國醫(yī)學(xué)院，河南 南陽 473004 )

·實驗研究·

補腎醒腦方對血管性癡呆大鼠膽堿能抗炎通路的影響*

胡久略1，郅 琳2，卞 華2，丁吉善2，楊淑慧2
(1.河南省宛西制藥股份有限公司，河南 南陽 474550； 2.南陽理工學(xué)院張仲景國醫(yī)學(xué)院，河南 南陽 473004 )

目的：觀察補腎醒腦方對血管性癡呆大鼠膽堿能抗炎通路的影響，探討其對血管性癡呆大鼠腦保護作用機制。方法：將Wistar大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型對照組、補腎醒腦方組、喜德鎮(zhèn)組4組，每組10只。均灌胃給藥，術(shù)前每天1次進行預(yù)防性給藥1周, 術(shù)后24 h繼續(xù)給藥，1 d 1次，連續(xù)7 d，模型對照組和假手術(shù)組給予蒸餾水(5 mL/d)灌胃，補腎醒腦方組給予補腎醒腦方灌胃，喜德鎮(zhèn)組給予喜德鎮(zhèn)灌胃。于術(shù)后的第2天、第4天、第6天測試各組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力；選取腦缺血再灌注24 h后為觀察點，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測大鼠腦組織IL-1β、TNF-a和TGF-β、IL-10含量，采用比色法測定ChAT、AchE活性。結(jié)果：補腎醒腦方治療組IL-1β、TNF-a和IL-10、TGF-β表達較模型對照組降低(P<0.05)，補腎醒腦方治療組AchE活性較模型對照組降低(P<0.05)，補腎醒腦方治療組ChAT的活性較模型對照組明顯提高(P<0.05)；補腎醒腦方治療組IL-1β、TNF-α表達較假手術(shù)組增高(P<0.05)；模型對照組IL-1β,TNF-α表達較假手術(shù)組顯著增高(P<0.01)；在控制其他因素不變的條件下，IL-1β與AchE呈正相關(guān)(r=0.94，P=0.000)，與ChAT呈負相關(guān)(r=-0.93，P=0.002)；TNF-a與AchE呈正相關(guān)(r=0.92，P=0.003)，與ChAT呈負相關(guān)(r=-0.91，P=0.004)。結(jié)論：促炎因子TNF-a、IL-1β和抗炎因子TGF-β、IL-10在缺血性腦損傷中具有重要作用，Ach可抑制致炎細胞因子釋放。補腎醒腦方可作用于膽堿能抗炎通路，能夠緩解血管性癡呆大鼠迷走神經(jīng)受到的阻抑作用，使Ach的合成增加，抑制炎性反應(yīng)，減輕腦組織的損傷。

血管性癡呆；補腎醒腦方；膽堿能抗炎通路；腫瘤壞死因子a；白介素-1β；乙酰膽堿酯酶；膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶；動物；大鼠

血管性癡呆(vascular dementia,VD)是老年人的常見病和多發(fā)病，是老年期癡呆的主要類型之一。中醫(yī)藥對血管性癡呆具有較好的療效優(yōu)勢。補腎醒腦方是臨床治療VD的有效方劑，具有化痰祛瘀、補腎益氣、醒腦開竅之效。前期研究發(fā)現(xiàn)本方對VD 療效肯定，能提高VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，改善腦組織的病理形態(tài)，其機制與改變氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的含量、抑制細胞的凋亡、改善自由基的代謝等有關(guān)[1-7]。本研究采用比色法檢測腦組織AchE、ChAT的活性，研究VD大鼠腦組織AchE和ChAT的變化及其與TNF-a、IL-1β和IL-10、TGF-β相關(guān)性，探討該方對VD大鼠膽堿能抗炎通路(CAP)的影響。

1 材料與方法

1.1 動 物

成年雄性4月齡Wistar大鼠40只，普通級，體質(zhì)量190～250 g，購自鄭州大學(xué)實驗動物中心，合格證號：醫(yī)動字第20-012號。

1.2 藥品、試劑與儀器

補腎醒腦方組成：熟地黃12 g，制首烏12 g，女貞子12 g，人參9 g，丹參9 g，川芎9 g，赤芍9 g，石菖蒲6 g，遠志6 g，天麻6 g等。藥品購入后經(jīng)南陽理工學(xué)院中藥教研室鑒定。制備方法：藥物以總體積的5倍量水冷浸3 h，微沸1 h×2次，合并濾液，文火濃縮成質(zhì)量分數(shù)為3 g/mL的濃縮液，無菌條件下裝瓶，放置4 ℃冰箱備用。喜得鎮(zhèn)(批號140311),天津華津制藥廠產(chǎn)品，用生理鹽水配制成0.03 g/L的藥液備用。 AchE試劑盒(批號20131221)、ChAT試劑盒(批號20130605)、考馬斯亮蘭蛋白試劑盒(批號20130730)，均由深圳晶賽生物技術(shù)有限公司提供。722型可見光分光光度計，上海菁華科技公司產(chǎn)品；400R低溫離心機，北京昊諾斯科技公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機，上海強智生物科技公司產(chǎn)品；DY89-1電動玻璃勻漿機，上海新諾儀器設(shè)備公司產(chǎn)品；Multiskan MK3型酶標(biāo)儀，上海甘薇生物科技公司產(chǎn)品；低溫冰箱，南京伯樂公司產(chǎn)品；顯微照相機，深圳市海量光電公司產(chǎn)品；輪轉(zhuǎn)式切片機，上海之信儀器公司產(chǎn)品；光學(xué)生物顯微鏡，上海長方儀器廠產(chǎn)品。

1.3 動物的篩選

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用穿梭箱主動回避反應(yīng)系統(tǒng)訓(xùn)練篩選。此系統(tǒng)用燈光作為刺激，足底電擊作為非條件刺激。若大鼠在燈光刺激情況下即可完成穿梭動作稱之為主動回避反應(yīng)(AAR)，而經(jīng)電刺激后方能夠完成穿梭動作稱之為被動回避反應(yīng)(PAR)。大鼠的記憶學(xué)習(xí)能力以能夠完成主動回避反應(yīng)(AAR)次數(shù)與測試總次數(shù)(20次)的比值，即被動回避反應(yīng)(PAR)習(xí)得率來表示。大鼠在模型制作前皆要經(jīng)過穿梭箱訓(xùn)練7 d，AAR習(xí)得率大于/等于80%者方能入選。

1.4 VD模型的建立

采用高脂飲食法[8]以及貓嚇鼠法[9]制作腎虛痰瘀模型[10]：將大鼠籠放在貓籠下面，中間用一層鐵絲網(wǎng)隔開，貓有時候可以接觸到大鼠。同時反復(fù)播放兇狠的貓叫聲音錄音磁帶。于每天上午9：00-11：00、下午15：00-17：00恐嚇大鼠，共計1個月。同時喂食大鼠高脂飼料20 g(0.5%膽酸鈉，81.3%普通飼料，0.2%丙基巰氧嘧啶，10%豬油， 3%膽固醇， 5%白糖)，火腿腸14 g，連續(xù)喂養(yǎng)1個月。

腎虛痰瘀模型成功后，制作VD大鼠模型[11-13]：灌胃到第30天，在給藥1 h后，大鼠用100 g/L 的水合氯醛腹腔注射(350 μg/g)麻醉，仰臥固定在手術(shù)臺之上，常規(guī)消毒后，頸正中部切口，快速分離雙側(cè)的頸總動脈，穿線以備用。同時以 3.5 μg/g的劑量經(jīng)腹腔注射硝普鈉用以造成低血壓，然后使用無創(chuàng)動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈10 min，再通10 min，如此反復(fù)操作3次，再通后縫合大鼠傷口，放回到籠中繼續(xù)飼養(yǎng)。第2天繼續(xù)灌胃。假手術(shù)組僅分離頸總動脈，不注射硝普鈉，亦無雙側(cè)頸總動脈反復(fù)夾閉。術(shù)后立即注射青霉素16 U/g預(yù)防感染。

模型成功標(biāo)準：缺血再灌注術(shù)后2～6 h內(nèi)觀察大鼠的功能及軀體感覺，按照5分制神經(jīng)病學(xué)評分標(biāo)準[14]實施評分。0分：無神經(jīng)方面的損傷癥狀。1分：不能完全伸展開對側(cè)的前爪與后爪。2分：能向手術(shù)對側(cè)進行轉(zhuǎn)圈。3分：能向手術(shù)對側(cè)進行傾倒。4分：喪失意識，不能進行自發(fā)行走。1分及1分 以上者視為模型成功，少于1分者視為未成功。未成功者棄去。

1.5 動物分組與給藥

將篩選合格的40只Wistar大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型對照組、補腎醒腦方組、喜德鎮(zhèn)組4組，每組10只，每籠5只。大鼠自由覓食飲水，在室溫22 ℃～25 ℃、濕度45%左右環(huán)境下喂養(yǎng)。各組均灌胃給藥，術(shù)前每天1次進行預(yù)防性給藥1周, 術(shù)后24 h繼續(xù)給藥。模型對照組和假手術(shù)組給予蒸餾水灌胃， 5 mL/d；補腎醒腦方組給予補腎醒腦方灌胃；喜德鎮(zhèn)組給予喜德鎮(zhèn)灌胃。給藥劑量均按照體質(zhì)量進行換算[15]，1 d 1次，連續(xù)7 d。

1.6 檢測指標(biāo)

1.6.1 學(xué)習(xí)記憶能力測試

使用穿梭箱主動回避反應(yīng)系統(tǒng)，每一組大鼠于術(shù)后的第2天、第4天、第6天進行測試。

1.6.2 腦組織ChAT、AchE活性

采用比色法進行ChAT、AchE活性測定。取大鼠海馬組織的上清液，加入到反應(yīng)體系之中檢測酶的活性。空白管、標(biāo)準管、測定管分別加入試劑，然后混合均勻，以3 500 r/min離心10 min，取其上清液，于520 nm和1 cm光徑進行比色，空白管調(diào)為零，檢測各管的吸光度，根據(jù)顏色的深淺以比色定量。

1.6.3 大鼠腦組織IL-1β、TNF-a和TGF-β、IL-10含量

采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測。于造模成功后第7天將大鼠斷頭，取左側(cè)大腦的半球，在冰臺上快速去掉小腦、腦干和嗅腦，用冰生理鹽水沖洗干凈，吸干后稱取腦組織質(zhì)量并放置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存。將待測的組織樣品從低溫冰箱內(nèi)取出至室溫復(fù)蘇，按組織樣品與生理鹽水9∶1的比例，制備成質(zhì)量分數(shù)為100 g/L的腦組織勻漿，2 200 r/min離心10 min，取上清腦組織勻漿以備待測。將試劑盒在室溫下放置40 min，試劑在使用前輕輕地搖均勻；新鮮的雙蒸水和濃縮洗滌液皆1∶20倍稀釋，混合均勻后于室溫下放置備用。按照試劑盒提供的方法進行檢測。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)(x)±標(biāo)準差(s)表示。每組數(shù)據(jù)先進行方差齊性檢驗和正態(tài)分布，多組間的差異顯著性檢驗采用單因素方差分析，多組間兩兩之間比較采用LSD檢驗。以P<0.05為差別有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠穿梭箱AAR習(xí)得率成績對比

模型對照組大鼠第2天AAR習(xí)得率明顯低于對照組；第4天、第6天時進一步降低，與假手術(shù)組對比，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義均(P<0.01)。中藥治療組各時間點AAR習(xí)得率較模型對照組同時間點顯著增高，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

表1 各組大鼠穿梭箱AAR習(xí)得率成績對比n=10，x±s

注：與假手術(shù)組對比，*P

2.2 各組大鼠腦組織AchE、ChAT活力對比

腦缺血再灌注24 h后,模型對照組大鼠海馬組織AchE活性稍有升高，提示血管性癡呆模型造成了乙酰膽堿代謝異常；兩給藥組皆能顯著抑制血管性癡呆大鼠AchE活性 (P<0.05),但兩組之間對比，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。大鼠腦缺血再灌注24 h后,模型對照組大鼠ChAT的活性顯著降低(P<0.01)；兩給藥組皆能顯著改善血管性癡呆大鼠ChAT的活性，但兩組對比差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。此提示藥物能夠促進乙酰膽堿在腦內(nèi)的合成代謝；見表2。

表2 各組大鼠腦組織AchE、ChAT活力對比 U·mg-1，x±s

注:與假手術(shù)組對比，*P<0.05,**P<0.01；與模型對照組對比, #P<0.05。

2.3 各組大鼠腦組織TNF-α、IL-1β和IL-10、TGF-β含量的影響

腦缺血再灌注7 d后，模型對照組大鼠腦組織中促炎細胞因子IL-1β、TNF-α的含量均明顯增高(P<0.01)。兩治療組均能夠不同程度地降低促炎細胞因子IL-1β、TNF-α的含量，對VD大鼠的炎性反應(yīng)具有顯著的抑制作用，但兩組間對比，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠腦組織IL-1β、TNF-α含量對比 ng·gpr-1，x±s

注：與假手術(shù)組對比，*P<0.05, **P<0.01；與模型對照組對比，#P<0.05#,##P<0.01。

腦缺血再灌注7 d后，模型對照組大鼠腦組織抗炎細胞因子TGF-β、IL-10的含量皆有一定程度地增高。兩治療組均可不同程度地降低抗炎細胞因子TGF-β、IL-10的含量，但兩組間對比，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組大鼠腦組織IL-10、TGF-β含量對比 ng·gpr-1，x±s

注：與假手術(shù)組對比，*P<0.05；與模型對照組對比，#P<0.05。

2.4 ChAT及AchE與IL-1β及TNF-α相關(guān)性分析

在控制其他因素不變化的條件下，IL-1β與AchE呈正相關(guān)(r=0.94，P=0.000)，與ChAT呈負相關(guān)(r=-0.94，P=0.003)；TNF-a與AchE呈正相關(guān)(r=0.92，P=0.003)，與ChAT呈負相關(guān)(r=-0.91，P=0.004)。見表5。

表5 ChAT及AchE與IL-1β及TNF-α相關(guān)性分析

3 討 論

炎性反應(yīng)產(chǎn)生的炎性細胞因子可以通過無血腦屏障的室周器官進入腦，或由孤束核、迷走背核感受后上行進入中樞。研究表明：神經(jīng)系統(tǒng)能夠通過迷走神經(jīng)快速、顯著地抑制巨噬細胞釋放促炎細胞因子，減輕炎性反應(yīng)的發(fā)生，這一作用機制稱之為“膽堿能抗炎通路”[16]，是一種神經(jīng)—免疫調(diào)節(jié)通路，可以高效地反饋調(diào)節(jié)、監(jiān)測炎性反應(yīng)，通過釋放Ach，抑制促炎因子的釋放，具有直接、快速、整合、局限、早期調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)的特點[17-19]。膽堿能抗炎通路的激活可以有效減少諸種促炎細胞因子的釋放，對局部和全身的炎性反應(yīng)均有顯著的阻抑作用。

細胞因子是腦缺血/再灌注炎性反應(yīng)中非常重要的炎性免疫因子。根據(jù)在炎性反應(yīng)中的作用將其分為抗炎因子(IL-1ra、TGF-β、IL-6 、IL-10等)和促炎因子(IL-1β、IL-8 、TNF-α等)兩大類。研究表明：在腦缺血/再灌注應(yīng)激狀況下，炎性細胞因子會率先誘導(dǎo)產(chǎn)生，其中主要是促炎因子IL-1β和TNF-α，然后會引發(fā)局灶性的內(nèi)皮細胞、星形膠質(zhì)細胞血管周圍細胞與神經(jīng)元發(fā)生炎性反應(yīng)，并會刺激其他細胞因子和炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，誘導(dǎo)損傷區(qū)白細胞浸潤，以及小膠質(zhì)細胞的激活。細胞因子能刺激白細胞與內(nèi)皮細胞的粘附、細胞粘附分子的產(chǎn)生，最終能夠使內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)化為血栓前或炎癥前的狀態(tài)，白細胞則向炎癥性病灶區(qū)域聚集；炎性免疫細胞與細胞因子亦可相互激活，通過錯綜的“細胞因子網(wǎng)絡(luò)”系統(tǒng)調(diào)節(jié)諸多細胞的功能，產(chǎn)生過量的炎性反應(yīng)，如此不僅可以影響及局部的血液供應(yīng)，而且可直接破壞細胞組織的結(jié)構(gòu)，進一步加重缺血區(qū)的腦組織的損傷[20]。

腦缺血再灌注常伴有炎性反應(yīng)，在炎性細胞反應(yīng)發(fā)生之前有介導(dǎo)炎性反應(yīng)的細胞因子的表達。IL-1β、TNF-α是腦缺血性/再灌注損傷所誘發(fā)的起始調(diào)節(jié)因子，可以引發(fā)諸多反應(yīng)通路，在缺血/再灌注腦損傷過程中具有非常重要的作用； IL-10、TGF-β作為抗炎因子在腦缺血/再灌注損傷中亦具有重要作用。

目前已知，AchE為Ach之水解酶，ChAT為Ach之合成酶，其血清或腦組織含量能夠反映Ach的含量。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與假手術(shù)組對比，模型對照組腦組織中IL-1β、TNF-α、TGF-β、IL-10和AchE均顯著升高，腦組織中ChAT明顯降低；其相關(guān)性分析則提示IL-1β與ChAT呈負相關(guān)，與AchE和TNF-α與呈正相關(guān)。此則表明VD發(fā)生后Ach的合成明顯減少，迷走神經(jīng)被抑制，炎性反應(yīng)進一步加重。

補腎醒腦方由地黃飲子加減化裁而來，具有化痰祛瘀、補腎益氣、醒腦開竅之功。該實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：補腎醒腦方組腦組織AchE較模型對照組低，ChAT較模型對照組高，TNF-α、IL-1β和IL-10、TGF-β較模型對照組低，提示該方作用于迷走神經(jīng)—膽堿能抗炎通路，對血管性癡呆大鼠迷走神經(jīng)起到了抑制作用，使Ach的合成增加，減輕了炎性反應(yīng)，從而能夠減少缺血/再灌注后腦組織的損傷。

綜上所述， 膽堿能抗炎通路在VD模型大鼠的生理病理中有著非常重要作用。補腎醒腦方可以通過調(diào)節(jié)其功能，顯著減輕炎性反應(yīng)，抑制腦組織的損傷，但其深入的作用機制仍待進一步研究。

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(編輯 陶 珠)

1001-6910(2015)12-0066-05

R749.1+3

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.12.31

胡久略(1977-)，男(漢族)，河南信陽人，副教授，中醫(yī)學(xué)博士，河南省宛西制藥股份有限公司在站博士后，在南陽理工學(xué)院張仲景國醫(yī)學(xué)院主要從事方劑學(xué)教學(xué)與臨床工作，主要研究方向：方劑配伍規(guī)律、療效機理及中醫(yī)藥防治腦病的研究。

河南省科技廳科技公關(guān)計劃項目(152102310224)

2015-06-12;

2015-10-08