甘秀海， 梁志遠(yuǎn)*， 周 欣， 趙 超， 衛(wèi) 鋼

(1. 貴州師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550018；2. 貴州師范大學(xué) 天然藥物質(zhì)量控制研究中心，貴州 貴陽 550001；3. 澳大利亞聯(lián)邦科學(xué)與工業(yè)研究組織材料科學(xué)與工程分部，新南威爾士 2070)

高效液相色譜法同時(shí)測定百尾參中兩種酰胺類化合物的含量*

甘秀海1， 梁志遠(yuǎn)1*， 周 欣2， 趙 超2， 衛(wèi) 鋼3

(1. 貴州師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550018；2. 貴州師范大學(xué) 天然藥物質(zhì)量控制研究中心，貴州 貴陽 550001；3. 澳大利亞聯(lián)邦科學(xué)與工業(yè)研究組織材料科學(xué)與工程分部，新南威爾士 2070)

建立了同時(shí)測定百尾參中obtucarbamate A和obtucarbamate B兩種酰胺類化合物含量的高效液相色譜分析方法，色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，以甲醇-0.2%乙酸水(30∶70)為流動(dòng)相，檢測波長256 nm，流速1 mL·min-1，柱溫30 ℃.結(jié)果表明：obtucarbamate A和obtucarbamate B分別在3～96 μg·mL-1和1～32 μg·mL-1范圍內(nèi)濃度與峰面積呈良好線性關(guān)系，其平均回收率分別為99.23 %和98.94 %，RSD分別為1.11 %和1.57 %.該方法操作簡單，專屬性強(qiáng)，靈敏度高，適用于百尾參中酰胺類化合物的含量測定.

百尾參；高效液相色譜；酰胺類化合物；含量測定

百尾參為百合科(Liliaceae)萬壽竹屬植物(Disporum cantoniense(Lour.)Merr.)的根莖.味甘、淡，性平，具有舒筋活血、清熱祛痰止咳等功效[1]，為苗族習(xí)用藥材，民間廣泛應(yīng)用于祛痰止咳，是咳速停系列止咳藥物中的主藥材之一.

文獻(xiàn)報(bào)道百尾參中含有木犀草素、芹菜素等多種黃酮類化合物[2, 3]，本課題組研究發(fā)現(xiàn)百尾參中還含有較多的酰胺類化合物obtucarbamate A和obtucarbamate B，生物活性顯示其具有明顯的止咳活性，為百尾參藥材止咳活性物質(zhì)基礎(chǔ)[4].而目前未見百尾參藥材止咳活性成分含量測定及有關(guān)質(zhì)量控制方面的報(bào)道.因此，為了保障百尾參藥材的品質(zhì)，進(jìn)而控制咳速停系列止咳藥物的內(nèi)在質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜建立百尾參中obtucarbamate A和obtucarbamate B的含量測定方法，并測定不同產(chǎn)地百尾參藥材中兩種酰胺類化合物的含量，為完善百尾參藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及百尾參藥材和相關(guān)制劑質(zhì)量的控制提供科學(xué)依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試藥

1200型高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；AL204電子分析天平，瑞士梅特勒托利多儀器有限公司；DFY-200 高速萬能粉碎機(jī)，溫嶺市林大機(jī)械有限公司；DZF-6020真空干燥箱，杭州藍(lán)天化驗(yàn)儀器廠；電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；KQ-50B型超聲波清洗器，昆山市超聲波儀器有限公司；obtucarbamate A和obtucarbamate B對(duì)照品，本課題組自制，純度均大于99 %(HPLC歸一化法測定)；百尾參樣品于2012年8～10月采自貴州省境內(nèi)(見表1)；甲醇，色譜純；水為娃哈哈純凈水；其余試劑均為分析純.

表1 百尾參樣品來源

1.2 對(duì)照品溶液的配制

精密稱取恒重后的obtucarbamate A 15 mg、obtucarbamate B 5 mg置于50 mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解并定容得混合對(duì)照品儲(chǔ)備液；再精密量取儲(chǔ)備液溶液0.25、0.5、1、2、4、8 mL，置于25 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，得不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液.

1.3 供試品溶液的制備

百尾參干燥藥材，粉碎，過40目篩，取粉末1.0 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，加入乙酸乙酯30 mL ×2，于40 ℃水浴下超聲提取，每次30 min，濾過，合并有機(jī)相，濃縮，殘?jiān)眉状级ㄈ葜?5 mL，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得.

1.4 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.2 %乙酸水(30∶70)，柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min；檢測波長：256 nm；進(jìn)樣量10 μL.

1.5 樣品分析

在1.4項(xiàng)液相色譜條件下，分別將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試品溶液注入高效液相色譜儀中分析，以保留時(shí)間定性，以峰面積定量.

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié) 果

2.1.1 線性關(guān)系的考察 取1.2項(xiàng)下不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.4項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄各濃度下的峰面積，以濃度(C)為橫坐標(biāo)、峰面積(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸分析，分別得到回歸方程Aobtucarbamate A= 198.12C+ 10.215，r= 0.999 8，Aobtucarbamate B=61.352C-6.891，r= 0.999 9.結(jié)果表明obtucarbamate A和obtucarbamate B分別在3～96 μg·mL-1、1～32 μg·mL-1范圍內(nèi)濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系.

2.1.2 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取1.2項(xiàng)下obtucarbamate A和obtucarbamate B濃度為24 μg·mL-1和8 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL，按1.4項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，其RSD分別為1.6 %和1.3 %，表明儀器精密度良好.

2.1.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取1.2項(xiàng)下obtucarbamate A和obtucarbamate B濃度為24 μg·mL-1和8 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL，按1.4項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測定，記錄obtucarbamate A和obtucarbamate B的峰面積，其RSD分別為1.2 %和1.1 %，表明混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定.

2.1.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取同一批百尾參樣品6份，按1.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按1.4項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣10 μL，測定兩種酰胺類化合物的峰面積并計(jì)算其含量，其RSD分別為1.3 %和1.5 %，表明該方法重復(fù)性良好.

2.1.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱定6份已知obtucarbamate A和obtucarbamate B含量的百尾參樣品約1.0 g，分別精密加入約等量的obtucarbamate A和obtucarbamate B混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，按1.3項(xiàng)中的方法制備樣品溶液，按1.4項(xiàng)中色譜條件進(jìn)行測定并計(jì)算回收率，結(jié)果表明兩者的平均回收率為99.23 %和98.94 %，其RSD分別為1.11 %和1.57 %，結(jié)果見表2.

表2 obtucarbamate A和obtucarbamate B加樣回收率測定結(jié)果(n=6)

2.1.6 樣品含量測定 分別精密稱取10批不同產(chǎn)地的百尾參樣品1.0 g各三份，按1.3項(xiàng)下方法制得樣品溶液，按1.4項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算各樣品中兩種酰胺類化合物的平均含量.百尾參樣品色譜圖見圖1，含量測定結(jié)果見表3.

表3 百尾參樣品中obtucarbamate A和obtucarbamate B的含量(n=3)

Tab.3 The contents of obtucarbamate A and obtucarbamate B of Disporum cantoniense(n=3)

編號(hào)產(chǎn)地含量/(mg·g-1)obtucarbamateAobtucarbamateBS1S2S3S4S5S6S7S8S9S10貴州思南貴州貴陽貴州安順貴州獨(dú)山貴州關(guān)嶺貴州雷山貴州龍里貴州盤縣貴州習(xí)水貴州玉屏0．4360．2180．9780．3900．6140．4460．4020．4280．3950．3670．1820．0980．3820．1150．2530．1910．1870．1930．1760．185

2.2 討 論

2.2.1 色譜柱的選用 在色譜柱考察試驗(yàn)中，分別比較了樣品在Hypersil ODS2(250 mm×4.6 mm, 5 μm)、Phenomen kromasil C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)、Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)等色譜柱中的色譜圖.結(jié)果表明在Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)柱上供試品溶液及對(duì)照品溶液中兩種酰胺類化合物的分離效果最好，吸收峰面積最大，基線平穩(wěn)，且峰型對(duì)稱性較高，故選擇色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18進(jìn)行含量測定.

2.2.2 提取方法的選擇 在供試品溶液的制備中，考察了甲醇、乙醇及乙酸乙酯等為溶劑提取供試品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇、乙醇及不同濃度的甲醇與乙醇以加熱回流和超聲所得供試品溶液中均含有較多的雜質(zhì)峰，在相應(yīng)的色譜條件下兩種酰胺類化合物與其他峰很難達(dá)到有效分離，且峰高低，對(duì)稱性差.乙酸乙酯加熱回流所得樣品溶液中，雜質(zhì)峰較多；乙酸乙酯超聲提取所得供試品溶液中各色譜峰分離較好，且峰高最大，對(duì)稱性好.因此，以乙酸乙酯超聲提取的方法來制備供試品溶液.

2.2.3 流動(dòng)相的選擇 流動(dòng)相的選擇中，分別考察了以乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.2 %乙酸水溶液、甲醇-0.2 %乙酸水溶液和乙腈-0.05 % 磷酸水溶液等為流動(dòng)相對(duì)色譜圖的影響，其中乙腈-水的體系，對(duì)照品出峰太快，很難與其他峰分開，只有在甲醇-0.2 %乙酸水溶液為流動(dòng)相時(shí)，保留時(shí)間及分離度較滿意，隨后又考察了不同的比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇-0.2%乙酸水溶液(30∶70)所得色譜圖最佳.因此，確定了最佳的流動(dòng)相為甲醇-0.2 %乙酸水(30∶70).

2.2.4 兩種酰胺含量的差異 由表3可知，不同產(chǎn)地百尾參中兩種酰胺的含量差異較大，如貴州安順產(chǎn)的百尾參中obtucarbamate A和obtucarbamate B的含量分別為0.978 mg·g-1和0.382 mg·g-1，而貴州貴陽產(chǎn)的百尾參中相應(yīng)的含量分別為0.218 mg·g-1和0.098 mg·g-1，兩者相差約4倍，這可能與不同地域的土壤及氣候條件差異有關(guān).因此，在選擇藥材時(shí)，必須考慮不同地域間的環(huán)境差異對(duì)品質(zhì)的影響，以確保藥材及相應(yīng)制劑的內(nèi)在質(zhì)量.

3 結(jié) 論

建立了百尾參中酰胺類化合物的高效液相色譜含量測定方法，并以此測定了不同產(chǎn)地百尾參藥材中兩種酰胺的含量.該方法操作簡便、靈敏度高、專屬性強(qiáng)，是百尾參中酰胺類化合物含量測定的一種有效方法，為今后該藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善及相關(guān)制劑的質(zhì)量控制奠定了基礎(chǔ).

[1] 貴州省藥品監(jiān)督管理局.貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[M]．貴陽：貴州科技出版社, 2003: 162.

[2] CHEN L, SU Y F, YIN Z Y, et al. Flavonoids from Disporum cantoniense(Liliaceae)[J]. Biochem Syst Ecol, 2009, 37(5): 609.

[3] 甘秀海，周欣，梁志遠(yuǎn)，等．百尾參根的化學(xué)成分研究[J]．中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013, 19(23): 140-142.

[4] 甘秀海，趙超，梁志遠(yuǎn)，等．百尾參止咳活性成分研究[J]．中國中藥雜志，2013, 38(23): 4 099-4 102.

責(zé)任編輯：朱美香

Simultaneous Determination of Two Amides of Disporum Cantoniense by HPLC

GANXiu-hai1,LIANGZhi-yuan1*,ZHOUXin2,ZHAOChao2,WEIGang3

(1. School of Chemistry and Life Science, Guizhou Normal College, Guiyang 550018;2. Research Center for Quality Control of Natural Medicine, Guizhou Normal University,Guiyang 550001 China;3. CSIRO Materials Science and Engineering, NSW 2070 Australia)

An ananlytic method using high-performance liquid chromatograph(HPLC) for determination obtucarbamate A and obtucarbamate B of Disporum cantoniense was established. The determinination was performed on Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm) column, methanol-0.2% acetic acid aqueous solution(30∶70) as mobile phases at a flow rate 1.0 mL·min-1. The detection wavelength was 256 nm and the column temperature was 30 ℃. The results showed that the calibration curves of obtucarbamate A and obtucarbamate B had good linearity in the range of 3～96μg·mL-1and 1～32μg·mL-1, respectively. The average recoveries were 99.23 % (RSD=1.11 %) and 98.94 %(RSD=1.57 %), respectively. The method is simple, good specialization, high sensitive, and could be used to simultaneously determine amides of Disporum cantoniense.

Disporum cantoniense; HPLC; amides; content detemination

2015-02-17

教育部春暉計(jì)劃項(xiàng)目(Z2011041)；貴州特色生物資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(2012009)

梁志遠(yuǎn)(1959— )，女，福建 南安人，教授.E-mail:gzwh24000@sina.com

R917

A

1000-5900(2015)02-0086-05