參地補(bǔ)腎接骨膠囊薄層鑒別及含量測(cè)定研究

韓曉珂，梁朝鋒，祁 俊

(蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院，安徽 蕪湖 241000)

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參地補(bǔ)腎接骨膠囊薄層鑒別及含量測(cè)定研究

韓曉珂，梁朝鋒，祁 俊

(蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院，安徽 蕪湖 241000)

目的：對(duì)參地補(bǔ)腎接骨膠囊薄層鑒別和含量測(cè)定進(jìn)行研究。方法：對(duì)處方中黃芪、當(dāng)歸、枸杞子進(jìn)行定性鑒別；采用UV-HPLC法測(cè)定何首烏中2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷含量。結(jié)果：黃芪、當(dāng)歸、枸杞子斑點(diǎn)清晰，陰性均無干擾，專屬性強(qiáng)。2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷在3.08～30.80μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 6)，平均回收率為100.2%，RSD為1.83%。結(jié)論：該法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，適用于參地補(bǔ)腎接骨膠囊的質(zhì)量控制。

參地補(bǔ)腎接骨膠囊；薄層色譜；UV-HPLC；2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷

由于社會(huì)進(jìn)步，交通發(fā)達(dá)，各種意外導(dǎo)致的骨折患者也逐年增加，在整個(gè)治療過程中，雖然手術(shù)效果顯著，不過對(duì)于輕微的或者是不宜手術(shù)的患者以及手術(shù)前后的治療過程中，中藥制劑發(fā)揮著越來越大的作用。參地補(bǔ)腎接骨膠囊是由生地黃、黃芪、當(dāng)歸、杜仲、枸杞子、丹參、何首烏、骨碎補(bǔ)、續(xù)斷等二十味中藥組成的復(fù)方制劑，為蕪湖市中醫(yī)院院內(nèi)制劑，杜仲[1]主治腰脊痛，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨的作用。枸杞子[2]歸肝、腎、肺經(jīng)，凡肝腎不足及肺腎陰虛者，皆可用之。骨碎補(bǔ)[3]具有補(bǔ)腎壯骨、活血止痛的作用，用于骨折、跌打損傷等疾病。自然銅[4]在我國(guó)用于接骨療傷歷史悠久，具有接骨續(xù)筋、散瘀止痛的作用，治療筋斷骨折、跌打損傷等。它具有骨折愈合所需的多種微量元素。全方藥物具有補(bǔ)腎益精血、續(xù)骨療傷作用，用于外傷導(dǎo)致的骨折患者，特別是陰虛陽亢、血分有熱等癥。為了研究本制劑的質(zhì)量控制方法，我們對(duì)處方中黃芪、當(dāng)歸、枸杞子等藥進(jìn)行了薄層鑒別，對(duì)何首烏中的2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷進(jìn)行了含量測(cè)定，建立了簡(jiǎn)便、有效的質(zhì)量控制方法。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀(Agilent 1200)；梅特勒XP-205電子天平； KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗儀；2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷(批號(hào)：110844-201109，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；黃芪甲苷(批號(hào)：110781-200613，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；當(dāng)歸對(duì)照藥材(批號(hào)：120927-201014，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；枸杞子對(duì)照藥材(批號(hào)：121072-201007，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；參地補(bǔ)腎接骨膠囊(批號(hào)：130501、130504、130507，蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院制劑室)；乙腈 (HPLC/Spectro， TEDIA Company)；水為超純水(自制)；其它試劑如正丁醇、乙醇、甲醇、三氯甲烷、乙醚、環(huán)己烷等均為分析純。

2 薄層鑒別

2.1 黃芪的薄層鑒別

2.1.1 樣品溶液制備 取本品內(nèi)容物5g，加乙醇30mL，置于錐形瓶中，超聲提取30min，濾過，濾液回收濃縮至干，殘?jiān)铀?0mL使溶解(過程中分少量多次加水)，加正丁醇(水飽和過的)振搖提取3次(50mL、30mL、30mL)，合并正丁醇萃取液，用5%氫氧化鈉溶液洗滌2次(30mL/次)，棄去堿液，正丁醇液再用水洗滌2次(30mL/次)，棄去水液，正丁醇液回收濃縮至干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，得樣品溶液。

2.1.2 對(duì)照品溶液制備 另取黃芪甲苷對(duì)照品，加甲醇制成1mg/mL的溶液，即得對(duì)照品溶液。

2.1.3 陰性樣品溶液制備 除黃芪藥味的其余藥材按照原工藝制成缺黃芪制劑，照樣品溶液的制備方法制成陰性溶液。吸取上述樣品溶液和陰性樣品溶液各5μL，對(duì)照品溶液2μL，點(diǎn)于同一薄層板(硅膠G)上，展開劑為三氯甲烷-甲醇-水(17∶7∶2)的下層溶液(10℃放置過夜)，展開后晾干，噴以10%硫酸溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。見圖1。

圖1 黃芪TLC色譜

2.2 當(dāng)歸的薄層鑒別

2.2.1 樣品溶液制備 取本品內(nèi)容物3g，加乙醚30mL，置于錐形瓶中，超聲提取10min，濾過，濾液回收濃縮至干，殘?jiān)右宜嵋阴?mL使溶解，即得供試品溶液。

2.2.2 對(duì)照藥材溶液制備 另取當(dāng)歸對(duì)照藥材1g，同法制成對(duì)照藥材溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液制備 除當(dāng)歸藥味的其余藥材按照原工藝制成缺當(dāng)歸制劑，照樣品溶液的制備方法制成陰性溶液。吸取上述3種溶液各2μL，分別點(diǎn)于同一薄層板(硅膠G)上，展開劑為環(huán)己烷-乙酸乙酯(9∶1)，展開后晾干，置于波長(zhǎng)為365nm的紫外燈下檢視。見圖2。

圖1 當(dāng)歸TLC色譜

2.3 枸杞子的薄層鑒別

2.3.1 樣品溶液的制備 取本品內(nèi)容物3g，置于200mL燒杯中，加水35mL，加熱煮沸15min(煮沸過程中注意補(bǔ)充水量)，濾過，濾液置分液漏斗中，用乙醚(15mL)振搖提取一次，提取液回收濃縮至1mL，作為樣品溶液。

2.3.2 對(duì)照藥材溶液制備 另取枸杞子對(duì)照藥材1g，同法制成對(duì)照藥材溶液。

2.3.3 陰性樣品溶液制備 除枸杞子藥味的其余藥材按照原工藝制成缺枸杞子制劑，照樣品溶液的制備方法制成陰性溶液。吸取上述兩種溶液各4μL，分別點(diǎn)于同一薄層板(硅膠G)上，展開劑為三氯甲烷-乙醚(2:1)，展開后晾干，置于波長(zhǎng)為365nm的紫外燈下檢視。見圖3。

圖3 枸杞子TLC色譜

3 含量測(cè)定

3.1 色譜條件

色譜柱：安捷倫(Zorbax SB-C18，4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈-水=21∶79；流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：320nm；柱溫：30℃。進(jìn)樣量：10μL。理論塔板數(shù)按2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

3.2 對(duì)照品溶液制備

取2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷對(duì)照品適量，精密稱定，加稀乙醇制成15μg/mL的溶液，即得。

3.3 供試品溶液制備

取裝量差異項(xiàng)下的本品內(nèi)容物，約1g，精密稱定，置100mL具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25mL，密塞后精密稱定重量，超聲處理(功率為350W，頻率為40kHz)30min，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.4 陰性對(duì)照溶液制備

除何首烏藥味的其余藥材按照原工藝制成缺何首烏制劑，按“3.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照溶液。

3.5 專屬性試驗(yàn)

分別吸取2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各10μL，注入Agilent 1200高效液相色譜儀，依法測(cè)定，從圖4可以看出，陰性對(duì)照溶液在2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷保留時(shí)間處未出現(xiàn)相應(yīng)色譜峰，表明本方法專屬性好，測(cè)定無干擾。見圖4。

圖4 參地補(bǔ)腎接骨膠囊HPLC色譜

3.6 線性關(guān)系考察

取2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷約15mg，精密稱定，置于50mL量瓶中，用稀乙醇溶解定容至刻度，搖勻，即得對(duì)照品母液(濃度為0.308mg/mL)，精密移取母液5mL，置25mL量瓶中，用稀乙醇稀釋定容至刻度，搖勻，即得濃度為61.6μg/mL的對(duì)照品溶液。精密吸取濃度為61.6μg/mL的對(duì)照品溶液各0.5mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL，分別置10mL量瓶中，用稀乙醇稀釋并定容至刻度，搖勻，配成濃度為3.08μg/mL、6.16μg/mL、12.32μg/mL、18.48μg/mL、24.64μg/mL、30.80μg/mL的對(duì)照品溶液，搖勻后過微孔濾膜(0.45μm)，各取10μL注入Agilent 1200高效液相色譜儀，各平行進(jìn)樣2次，取各個(gè)峰面積的平均值作為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)樣的濃度作為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷的回歸方程為Y=29.981X-38.249，r=0.999 6。

3.7 精密度試驗(yàn)

按照“3.1”項(xiàng)色譜條件，取供試品溶液10μL注入HPLC色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷峰面積積分值的RSD為1.91%。

3.7 精密度試驗(yàn)

按照“3.1”項(xiàng)色譜條件，取供試品溶液10μL注入HPLC色譜儀，進(jìn)樣時(shí)間分別為0，2，4，6，8，10 h，結(jié)果2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷峰面積積分值的RSD為1.47%。該結(jié)果說明供試品溶液在10h內(nèi)是穩(wěn)定的。

3.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取相同批號(hào)(批號(hào)：130501)的樣品，按“3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，按照“3.1”色譜條件，分別進(jìn)樣測(cè)定含量。結(jié)果供試品中2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷含量的平均值為0.31mg/g，RSD為1.26 %。該結(jié)果說明此方法重復(fù)性良好。

3.10 加樣回收試驗(yàn)

精密稱取已測(cè)定含量的樣品(批號(hào)：130501)0.5g，共6份，分別加入2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷適量，按“3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“3.1”項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣測(cè)定含量，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，用本法測(cè)定樣品中2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷的回收率良好。

3.11 三批樣品含量測(cè)定

取三批樣品各約1g，分別按“3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“3.1”項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定結(jié)果并計(jì)算含量，結(jié)果見表2。

4 討論

地黃的化學(xué)成分有環(huán)烯醚萜類、糖類、氨基酸類、揮發(fā)油等，其中環(huán)烯醚萜類主要是梓醇、二氫梓醇、乙酰梓醇等[5]。但目前一般認(rèn)為梓醇對(duì)熱不穩(wěn)定，無論是干燥或是煎煮過程均會(huì)對(duì)其含量產(chǎn)生影響，所以在制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)未考慮測(cè)定地黃中梓醇的含量[6]?！侗静菥V目》記載何首烏“養(yǎng)血益肝、固精益腎、健筋骨”，其[7]含有的卵磷脂和鐵，有促進(jìn)紅細(xì)胞的生成、補(bǔ)血功能，能全面作用于造血系統(tǒng)，促進(jìn)骨髓造血及細(xì)胞增殖，而2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷是何首烏中特有的生物活性成分，故對(duì)何首烏進(jìn)行了定量分析。

在定量分析過程中，采用不同比例乙腈與水溶液進(jìn)行洗脫實(shí)驗(yàn)研究[8-13]，以分離度及洗脫時(shí)間為指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：乙腈-水(21∶79) 效果最為理想，最終確定乙腈-水(21∶79)為最佳流動(dòng)相。

表2 三批樣品含量測(cè)定結(jié)果

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(責(zé)任編輯：宋勇剛)

Study on TLC and Quantitative Determination by UV-HPLC for Shendi Bushenjiegu Capsules

Han Xiaoke,Liang Chaofeng , Qi Jun

(Wuhu Hospital of TCM,Anhui 241000,China)

Objective:To study the TLC Identification and Content Determination of Shendi Bushenjiegu Capsules. Methods:Radix astragalus,angelica and lycium barbarum were identified by TLC. The content of 2,3,5,4 '-tetera-hydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside was determined by UV-HPLC. Results:The spots were clear without interference in the blank reference. The response of 2,3,5,4 '-tetera-hydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside was linear in the ranges of 3.08 ～30.80μg·mL-1(r = 0.9996) ,the average recovery was 100.2 % , RSD = 1.83%.Conclusion:The method is simple, accurate,reproducible and can be used for the quality control of Shendi Bushenjiegu Capsules.

Shendi Bushenjiegu Capsules; TLC;UV-HPLC;2,3,5,4 '-tetera-hydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside

2014-08-17

韓曉珂(1981-)，女，安徽省蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院主管中藥師，研究方向?yàn)橹兴幹苿╅_發(fā)。

R284.1

A

1673-2197(2015)01-0033-03

10.11954/ytctyy.201501016