金粟蘭在腫瘤內(nèi)科治療中的作用機(jī)制研究

陳 梁，楊志宏

(內(nèi)蒙古烏海市人民醫(yī)院 腫瘤科，內(nèi)蒙古 烏海 016000)

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金粟蘭在腫瘤內(nèi)科治療中的作用機(jī)制研究

陳 梁，楊志宏

(內(nèi)蒙古烏海市人民醫(yī)院 腫瘤科，內(nèi)蒙古 烏海 016000)

目的：探討金粟蘭倍半萜內(nèi)酯類化合物L(fēng)SE-3在腫瘤內(nèi)科治療中的作用機(jī)制。方法：利用蛋白印記法檢測(cè)表皮生長(zhǎng)因子(EGF,25ng/mL)誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)前后及不同LSE-3作用EMT細(xì)胞48h后，間質(zhì)標(biāo)記物Snail、Slug以及LSE-3可能作用的其它靶點(diǎn)如p53等相關(guān)信號(hào)分子蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：蛋白印記對(duì)Snail、Slug、p53蛋白表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果顯示，與EGF誘導(dǎo)組相比，人乳腺癌細(xì)胞中Snail、Slug蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，p53蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，且都與LSE-3呈劑量依賴關(guān)系。結(jié)論：LSE-3能逆轉(zhuǎn)EGF誘導(dǎo)的人乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231、MDA-MB-468)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的產(chǎn)生,降低發(fā)生了EMT的人乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231、MDA-MB-468)的侵襲轉(zhuǎn)移能力。

金粟蘭、LSE-3、乳腺癌細(xì)胞、作用機(jī)制

金粟蘭又名珠蘭、魚(yú)子蘭、茶蘭等，原產(chǎn)我國(guó)南部，喜溫暖、潮濕和通風(fēng)的環(huán)境，多生于山坡、溝谷密林下。半灌木，直立或稍平臥，高30～60cm。金粟蘭生性強(qiáng)健，容易栽培，用分株、扦插和壓條繁殖皆可。全株入藥，有活血驅(qū)蟲(chóng)、祛風(fēng)濕、接筋骨之效。但目前最新研究發(fā)現(xiàn)金粟蘭倍半萜內(nèi)酯類化合物L(fēng)SE-3在抑制腫瘤方面有很好的療效，故本文采用兩株人乳腺癌細(xì)胞作為研究對(duì)象，探討LSE-3在腫瘤內(nèi)科治療中的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器

細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本SANYO公司，MCO-750C02)、倒置熒光顯微鏡(Leica公司)、三蒸水發(fā)生器(上海亞榮生化儀器廠)、液氮生物容器(四川亞西生物容器有限公司，YDS-35-125)、醫(yī)用超凈工作臺(tái)(蘇州馮氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備有限公司)、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Thermo公司)、Western blotting電泳儀、Western Blot電轉(zhuǎn)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)材料與試劑

從本實(shí)驗(yàn)室當(dāng)年收獲的寬葉金粟蘭、多穗金粟、絲穗金粟蘭和植物腫節(jié)風(fēng)這四種金粟蘭科植物中提取得到LSE-3。MDA-MB-231細(xì)胞、MDA-MB-468細(xì)胞(人乳腺癌細(xì)胞株購(gòu)于協(xié)和細(xì)胞庫(kù)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心)，使用Leibovitz's L-15培養(yǎng)基(Gibco,41300-039)；重組人表皮生長(zhǎng)因子EGF( 購(gòu)于美國(guó)PeproTech公司，產(chǎn)品批號(hào)：0212AFC05)；M-PER即Mammalian Protein Extraction Reagent(蛋白提取試劑, Thermo公司：78503)，鼠抗人β-actin單克隆內(nèi)參一抗(anbo生物技術(shù)公司)、HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗(北京全式金生物技術(shù)有限公司)、HRP標(biāo)記山羊抗鼠二抗(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；鼠抗人p53單克隆一抗、兔抗人Snail單克隆一抗、兔抗人Slug單克隆一抗(美國(guó)Cell Signaling公司)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組

設(shè)置含25ng/mL的LSE-3藥組(0.5μg/mL,1μg/mL, 3μg/mL,10μg/mL)；25ng/mL EGF組與空白組(無(wú)EGF)，收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞若干瓶，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞懸液密度為6×106個(gè)/mL；將上述細(xì)胞懸液分別加入六個(gè)直徑為10cm的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，分組培養(yǎng)。

2.2 蛋白樣品制備

按照提取蛋白試劑盒的方法提取細(xì)胞內(nèi)蛋白。

2.3 檢測(cè)Snail、Slug、p53蛋白表達(dá)

使用Western Blot方法檢測(cè)各蛋白的表達(dá)量。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 Snail、Slug在各腫瘤細(xì)胞株內(nèi)的表達(dá)

Western Blot結(jié)果顯示(見(jiàn)圖1)，隨LSE-3給藥濃度的增加，Sanil、Slug在兩株細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)均下調(diào)，與給藥濃度呈現(xiàn)一定的依賴關(guān)系；以β-actin蛋白為內(nèi)參，如圖2顯示，給藥組的Snail、Slug的相對(duì)表達(dá)量與模型組(EGF組)的相對(duì)表達(dá)量比較差異顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 Snail、Slug蛋白在各乳腺癌細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量

圖2 I：Snail的相對(duì)表達(dá)量；II：Slug的相對(duì)表達(dá)量

3.2 p53在各細(xì)胞中的表達(dá)

陳雁[1]在研究中發(fā)現(xiàn)，p53參與了皮膚腫瘤發(fā)生EMT進(jìn)程，并認(rèn)為p53是一個(gè)調(diào)控EMT的重要“關(guān)卡”。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(見(jiàn)圖3)，LSE-3對(duì)MDA-MB-231、MDA-MB468這兩株腫瘤細(xì)胞作用48h后，細(xì)胞內(nèi)p53的表達(dá)均隨著LSE-3濃度的增加而上調(diào)；如圖4所顯示，以β-actin蛋白表達(dá)量為內(nèi)參，各給藥組與模型組(EGF組)相比，其p53的表達(dá)量具有顯著性差異(P<0.05)。

4 討論

金粟蘭多具有抗菌消炎，散棄活血的功效，通常用于治療跌打損傷、瘀血腫痛、骨折、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等[2]，在民間是治療腫癤，毒蛇咬傷和跌打損傷的良藥。該屬植物的一些化學(xué)成分具有良好的細(xì)胞毒作用和抗菌活性[3]?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)表明金粟蘭屬植物多具有抗菌、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫、抗病毒、抗?jié)?、?zhèn)痛、抗血小板聚集、收縮子宮等活性[4]。金粟蘭屬作為我國(guó)分布較全并且特有存在的種屬，目前其研究與開(kāi)發(fā)尚不深入，仍有很多問(wèn)題有待研究探討，如該屬與其近緣屬草珊瑚屬在化學(xué)成分和藥理作用方面的異同，由金粟蘭科草珊瑚屬植物草珊瑚中分離得到的抗菌抗腫瘤的有效成分等。本文通過(guò)人的乳腺癌細(xì)胞研究了金粟蘭內(nèi)倍半萜內(nèi)酯類化合物L(fēng)SE-3在腫瘤內(nèi)科治療中的作用機(jī)制。

圖3 p53蛋白在各乳腺癌細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量

圖4 p53蛋白在各乳腺癌細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量

Snail、Slug均屬于Snail家族成員，是均含有鋅指結(jié)構(gòu)的DNA結(jié)合蛋白，也是間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志分子。大多研究顯示，雖然誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT化的因素各不相同，這些誘因包括生長(zhǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)、蛋白酶及缺氧等，但是其發(fā)生EMT的過(guò)程是相似的，而Snail轉(zhuǎn)錄因子便是在調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的共同下游靶基因，目前所已知的EMT的過(guò)程中幾乎都與Snail的激活有關(guān)。Snail與Slug在腫瘤細(xì)胞EMT過(guò)程中扮演了至關(guān)重要的角色，被當(dāng)作分子靶向逆轉(zhuǎn)EMT的重要性不容忽視，而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，LSE-3能夠明顯抑制其在人乳腺癌腫瘤細(xì)胞(MDA-MB-231、MDA-MB-468)中的表達(dá)。

p53是調(diào)控細(xì)胞周期的重要蛋白，尤其是在細(xì)胞受到損傷后，能通過(guò)調(diào)控與細(xì)胞周期、凋亡相關(guān)的基因，使細(xì)胞周期發(fā)生阻滯，直到細(xì)胞修復(fù)損傷為止。目前關(guān)于其研究集中在對(duì)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和基因穩(wěn)定性等方面的作用[5]。腫瘤界對(duì)p53與EMT之間關(guān)系的研究才剛剛起步，兩者之間的調(diào)控機(jī)制及關(guān)系還不確切，因此可能是今后尋找逆轉(zhuǎn)腫瘤EMT化作用的一個(gè)全新的靶點(diǎn)，也需要更多的研究與理論來(lái)闡述此問(wèn)題。

LSE-3抗人乳腺癌EMT的機(jī)制是多途徑、多靶點(diǎn)綜合作用的結(jié)果，并且始終貫穿腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及侵襲與轉(zhuǎn)移等多個(gè)過(guò)程。但是這種逆轉(zhuǎn)作用是以蛋白水平為主，還是以轉(zhuǎn)錄水平為主要作用，或者是在EMT發(fā)展的過(guò)程中對(duì)不同發(fā)展階段有著不同的調(diào)控機(jī)制并不清楚，需要采用更豐富的實(shí)驗(yàn)手段和更為嚴(yán)密的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)一步研究和證實(shí)，這也是本課題下一步研究的重點(diǎn)與方向。深入了解與研究其介導(dǎo)的機(jī)制，可為將LSE-3作為抑制腫瘤藥物的開(kāi)發(fā)提供更多的證據(jù)，同時(shí)也為開(kāi)發(fā)更多相關(guān)藥物提供有價(jià)值的參考。

[1] CHAMBERS AF, GROOM AC, MACDONALD IC. Metastasis: Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sitesr[J]. Nature Reviews Cance，2002(2):563-572.

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[3] 吳征銳，周太炎，肖培根.新華本草綱要[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1991：64.

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[5] ZHIVOTOVSKY B, KROEMER G. Apoptosis and genomic instability[J]. Nat Rev Mol Cell Biol,2004,5(9):752-762.

(責(zé)任編輯：魏 曉)

2014-09-02

陳梁(1972-)，男，內(nèi)蒙古烏海市人民醫(yī)院主治醫(yī)師，研究方向?yàn)槟[瘤內(nèi)科放化療。

R246.5

A

1673-2197(2015)01-0009-02

10.11954/ytctyy.201501005