基于UPLC指紋圖譜和判別分析鑒別黃芩產(chǎn)地研究

蘇建春，柯華香，趙俊霞，孫彩霞，尹蓉莉*，李 化

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，四川 成都 611137；2.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所，北京 100700； 3.中國中醫(yī)科學(xué)院 道地藥材國家重點實驗室培育基地，北京 100700； 4.西華大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 成都 610039)

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基于UPLC指紋圖譜和判別分析鑒別黃芩產(chǎn)地研究

蘇建春1,2，柯華香2,4，趙俊霞1，孫彩霞1，尹蓉莉1*，李 化2,3*

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，四川 成都 611137；2.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所，北京 100700； 3.中國中醫(yī)科學(xué)院 道地藥材國家重點實驗室培育基地，北京 100700； 4.西華大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 成都 610039)

目的：利用超高效液相色譜(UPLC)指紋圖譜技術(shù)結(jié)合判別分析方法建立黃芩產(chǎn)地快速鑒別方法。方法：色譜柱為Aquity BEH C18(50mm×2.1mm，1.7μm)，流動相為0.1% 甲酸水溶液-乙腈梯度洗脫，流速為0.4mL/min，柱溫為40℃，檢測波長為280nm。采用UPLC法對河南、甘肅、山西、河北、山東5省份64批黃芩樣品進行測定，利用中國藥典委員會頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件》(2004版A)對其進行相似度評價，并結(jié)合Fisher線性判別函數(shù)建立黃芩產(chǎn)地快速鑒別模型。結(jié)果：不同產(chǎn)地黃芩藥材的指紋圖譜相似度大于0.95；判別分析結(jié)果顯示河南、山東、河北3省份的黃芩可被準(zhǔn)確區(qū)分開來，山西、甘肅各有一批次黃芩出現(xiàn)誤判，各模型判斷正確率均大于94.7%。結(jié)論：利用超高效液相色譜(UPLC)指紋圖譜技術(shù)結(jié)合判別分析方法鑒別黃芩產(chǎn)地快速、準(zhǔn)確，值得推廣。

黃芩；UPLC指紋圖譜；相似度評價；判別分析

黃芩為唇形科植物黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi.) 的干燥根，其藥用歷史悠久，歷代本草書籍均有記載，其性苦、味寒，歸肺、膽、脾、大腸、小腸經(jīng)，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎等功效[1]。我國幅源遼闊，黃芩在全國各地均有分布，主產(chǎn)于河北、山西、山東、甘肅、河南等地。不同的地理位置、生態(tài)環(huán)境對黃芩藥材質(zhì)量有很大影響，已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地黃芩在產(chǎn)量、性狀、質(zhì)量上存在較大差異[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，不同產(chǎn)地黃芩的抑菌、抗炎、解熱、鎮(zhèn)靜等活性作用也存在差異[3-6]，可見產(chǎn)地對黃芩質(zhì)量及功效有一定影響。

指紋圖譜在化學(xué)成分類型分析、藥材間差異及質(zhì)量控制方面發(fā)揮著重要作用。肖麗和等[7]采用系統(tǒng)聚類法對15批不同來源不同種屬的黃芩藥材進行了分類判別。肖蓉等[8]采用系統(tǒng)聚類法對承德地區(qū)與其他地區(qū)的黃芩藥材進行了分類判別。目前研究主要集中在對不同產(chǎn)地不同種屬黃芩藥材的小樣本無監(jiān)督系統(tǒng)聚類分析方面，未見采用判別分析方法對不同產(chǎn)地大樣本量正品黃芩進行產(chǎn)地判別的報道。鑒于此，本研究收集了河北、山西、山東、甘肅、河南5個省份 64 批黃芩藥材，建立了黃芩藥材UPLC指紋圖譜分析方法，在數(shù)據(jù)化處理的基礎(chǔ)上進行了相似度評價和判別分析研究，以期為黃芩產(chǎn)地的快速鑒別提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters ACQUITY H-Class UPLCTM 超高效液相色譜儀(包括四元高壓梯度泵、真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器、Empower Ⅱ色譜工作站)；2004 MP6 型半微量電子顯示天平(德國Sartorius公司)；Scout Pro 型電子天平(美國Ohaus公司)；KQ-100DE 型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；超純水儀Milli-Q 型超純水制備儀(法國Millipore公司)。

1.2 試藥

黃芩苷(批號E-0050，純度≥98%)、漢黃芩苷(批號E-0664，純度≥98%)、黃芩素(批號E-0051，純度≥98%)、漢黃芩素(批號E-0103，純度≥98%)均購自上海同田生物技術(shù)股份有限公司；千層紙素 A (批號20120129，純度≥98%)購自上海源葉生物科技有限公司。乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，超純水由Milli-Q純水機制備。

本實驗收集了河南、甘肅、山東、山西、河北 5 省份的黃芩藥材共計 64 份，藥材來源見表1 。全部藥材均經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所李化副研究員鑒定為唇形科植物黃芩S.baicalensisGeorgi.的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Aquity BEH C18(50mm×2.1mm，1.7μm)；流動相A：0.1%甲酸水溶液，流動相B：乙腈，梯度洗脫：0～0.5min (82%A)，0.5～2min (82% ～80%A)，2～6min(80%～70%A)，6～8min(70%A)，8～10min(70%～40%A)，10～12min (40%A)；柱溫：40 ℃；流速：0.4mL/min；檢測波長：280nm；進樣體積：1μL；色譜運行時間：12.5min。

表1 黃芩樣品來源

注：hn 代表河南產(chǎn)黃芩；sd 代表山東產(chǎn)黃芩；hb 代表河北產(chǎn)黃芩；sx 代表山西產(chǎn)黃芩；gs代表甘肅產(chǎn)黃芩。

2.2 對照品溶液制備

取適量黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素對照品，分別配制成質(zhì)量濃度為87.20μg/mL、39.60μg/mL、41.20μg/mL、3.34μg/mL和1.57μg/mL的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

取黃芩粉末約0.05g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加體積分數(shù)70%乙醇50mL，稱定重量，超聲提取60min，放冷，稱重，以體積分數(shù)70%乙醇補足失重，濾過，續(xù)濾液過0.45μm微孔濾膜，即得。

2.4 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.4.1 精密度實驗 取黃芩粉末約0.05g，精密稱定，按“2.3”項下供試品溶液制備方法制樣，連續(xù)進樣 6 次，記錄指紋圖譜。各共有峰相對保留時間和相對峰面積RSD 分別小于0.2%和3.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性實驗 取黃芩粉末約0.05g，共6份，精密稱定，按“2.3”項下供試品溶液制備方法制樣，分別進樣，記錄指紋圖譜。各共有峰相對保留時間和相對峰面積RSD 分別小于0.2%和5.0%，表明該測定方法重現(xiàn)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性實驗 取黃芩粉末約0.05 g，精密稱定，按“2.3”項下供試品溶液制備方法制樣，分別于 0、2、4、6、8、10、12h進樣檢測，記錄指紋圖譜。各共有峰相對保留時間和相對峰面積RSD分別小于0.8%和5.0%，表明供試品溶液在室溫下放置12h穩(wěn)定性良好。

2.5 指紋圖譜建立

2.5.1 黃芩樣品UPLC指紋圖譜樣品測定 分別取 64 批黃芩樣品，按“2.3”項下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，進樣量為1μL，記錄UPLC色譜圖。在相同色譜條件下測定對照品溶液，并對供試品中各峰進行指認。通過對照品指認，3 號、9 號、11 號、12 號、13 號色譜峰分別為黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A。通過質(zhì)譜鑒定，5 號、8 號色譜峰分別為去甲漢黃芩素-7-O-葡萄糖醛酸苷、千層紙素A-7-O-葡萄糖醛酸苷?；旌蠈φ掌泛忘S芩藥材UPLC色譜如圖1所示。

2.5.2 參照峰選擇 漢黃芩苷(9號峰)是黃芩的主要有效成分，在各批次樣品中均能被檢測到，分離度較好，且該色譜峰峰面積和保留時間適中且較穩(wěn)定，故選擇漢黃芩苷色譜峰作為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。

2.5.3 指紋圖譜建立 采用中國藥典委員會頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件》( 2004 版A) 對64批黃芩藥材進行指紋圖譜分析，得到吸收強、特征明顯且穩(wěn)定性較好的14個色譜峰作為共有峰(見圖1)。以第 S14 批(hb-6，河北灤平)藥材圖譜作為參照譜，選取“時間窗寬度”為0.1min，采用中位數(shù)法計算，選定14個共有峰進行多點校正，自動匹配，匹配后的 64 批樣品色譜見圖2 。

圖1 混合對照品溶液(A)和黃芩樣品溶液(B)UPLC色譜

注：3-黃芩苷，5-去甲漢黃芩素-7-O-葡萄糖醛酸苷，8-千層紙素A-7-O-葡萄糖醛酸苷，9-漢黃芩苷，11-黃芩素，12-漢黃芩素，13-千層紙素 A

圖2 64批不同產(chǎn)地黃芩藥材的UPLC指紋圖譜

3 數(shù)據(jù)分析

3.1 指紋圖譜相似度分析

采用中國藥典委員會頒布的中藥色譜指紋圖譜相似度軟件，以第 S14 批(hb-6，河北灤平)藥材圖譜作為參照譜，對所得UPLC色譜指紋圖譜進行相似度分析，以相關(guān)系數(shù)表征相似度， 64 批不同產(chǎn)地黃芩樣品相似度值均在 0.950 以上，說明不同產(chǎn)地黃芩藥材相似度較高。

3.2 指紋圖譜差異性分析

利用中藥色譜指紋圖譜相似度軟件分別生成河南、山東、河北、山西、甘肅 5 個省份的對照指紋圖譜，得到5個省份的對照指紋圖譜如圖3所示。對所建立的對照指紋圖譜進行分析比較，可知甘肅、山西產(chǎn)黃芩在2號、3號色譜峰間出現(xiàn)的色譜峰數(shù)目較多，河南、山東、河北產(chǎn)黃芩則相對較少。甘肅產(chǎn)黃芩樣品部分未檢測到 a、b、c、d 號色譜峰組分，而河南、山東、河北、山西產(chǎn)黃芩樣品則可同時檢測到1～14號共有峰以及 a、b、c、d 號色譜峰(見圖3)。

以峰面積標(biāo)示含量，比較不同產(chǎn)地黃芩各色譜峰峰面積，結(jié)果顯示不同省份黃芩樣品黃酮苷類成分(1～9號峰)的峰面積按照河南、山東、河北、山西、甘肅的順序依次遞減。黃酮苷元類成分(10～14號峰)峰面積亦按照河南、山東、河北、山西、甘肅的順序依次遞減?？梢姴煌a(chǎn)地黃芩存在一定差異，可用于進一步鑒別其產(chǎn)地。

圖3 產(chǎn)地河南、山東、河北、山西、甘肅黃芩藥材對照指紋圖譜

3.3 黃芩藥材產(chǎn)地判別分析

應(yīng)用IBM SPSS Statistics 19.0 統(tǒng)計學(xué)軟件，采用判別分析方法對64批不同產(chǎn)地的黃芩指紋圖譜數(shù)據(jù)進行判別。將黃芩指紋圖譜中 14 個共有峰的相對峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入 SPSS 軟件中，按照所有達到容許度標(biāo)準(zhǔn)的自變量同時進入判別方程的方法處理變量，進行Bayes判別，可得到河南、甘肅、河北、山東、山西 5 省份黃芩的 Fisher 線性判別函數(shù)，公式如下：

Y山西=-187.92+285.40X1-938.92X2+28.64X3-285.91X4+277.02X5+1607.19X6+504.56X7+286.40 X8-402.10X10+36.33X11+574.99X12-1880.64X13-1150.59X14

Y甘肅=-170.41+346.70X1-1285.50X2+38.03X3-67.54 X4+278.79X5+1252.33X6+325.32X7+246.99 X8-308.75 X10+48.38 X11+588.55X12-2009.23X13-1370.30X14

Y山東=-204.64+353.43X1-1184.66 X2+26.83X3-458.84 X4+219.68X5+2084.52X6+626.54X7+294.56X8-401.32X10+36.92 X11+580.01X12-1986.83X13-1073.28X14

Y河南=-203.40+227.27X1-912.59 X2+17.47X3+110.59 X4+422.45X5+1697.13X6+376.36X7+278.26X8-283.36X10+27.01 X11+623.51X12-1882.00X13-1169.14X14

Y河北=-232.06+328.39X1-1200.62 X2+29.85X3-120.75 X4+376.21X5+1865.62X6+359.33X7+323.41X8-562.60X10+43.69 X11+689.44X12-2239.54X13-1357.42X14

為驗證該判別函數(shù)的正確性，采用SPSS 19.0 軟件提供的訓(xùn)練樣本回代法對判別函數(shù)進行驗證，結(jié)果見表2。驗證結(jié)果表明不同產(chǎn)地黃芩藥材樣品總判斷正確率為96.9%，其中河南、山東、河北產(chǎn)黃芩判斷正確率均為100%，山西、甘肅產(chǎn)黃芩各有一批出現(xiàn)誤判，判斷正確率分別為96.3%和94.7%，說明該實驗建立的判別函數(shù)基本穩(wěn)定，可用于黃芩產(chǎn)地的快速判別。

表2 不同產(chǎn)地黃芩 Fisher 判別函數(shù)交互驗證結(jié)果

4 討論

本研究選擇的黃芩藥材皆為藥典收載的正品ScutellariabaicalensisGeorgi黃芩，樣品遺傳差異性較小，藥材中化學(xué)成分的差異主要由生長環(huán)境的不同造成。不同產(chǎn)地、氣候條件導(dǎo)致黃芩自身次生代謝產(chǎn)物積累的不同，各省份黃芩化學(xué)成分具有一定地域特征，但以往研究僅以黃芩苷含量作為評價指標(biāo)，具有一定局限性。本實驗結(jié)合黃芩指紋圖譜分析，所建立的判別函數(shù)的回判正確率達 96.9%，可有效對黃芩樣品的產(chǎn)地進行判別。對未知樣品進行判別時，只需按照本實驗的色譜方法測定樣品，然后將相應(yīng)共有峰的相對峰面積值代入上述判別方程，比較判別函數(shù)值的大小，值大者則為該省份的黃芩，該方法簡單、快速。

鑒于目前實驗收集的樣本數(shù)量還相對較少，每個產(chǎn)區(qū)的樣品量不均衡，后續(xù)實驗要進一步增加樣本量，不斷修正判別函數(shù)模型。以期通過本研究提出一種思路，建立一種有效的數(shù)學(xué)模型，為快速準(zhǔn)確鑒別中藥材產(chǎn)地提供參考。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:282-283.

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(責(zé)任編輯：尹晨茹)

Identification of Scutellaria baicalensis from Different habitats Using UPLC Fingerprints in Combination with Discriminant Analysis

Su Jianchun1,2,Ke Huaxiang2,4,Zhao Junxia1,Sun Caixia1,Yin Rongli1*, Li Hua2,3*

(1.Chengdu College of TCM, Chengdu 611137,China;2.Institute of Chinese Materia Medica,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100700,China;3.State Key Laboratory Breeding Base of Daodi Herbs,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100700,China;4.Bio-Engineering College，Xihua University,Chengdu 610039,China)

Objective:To set up the ultra performance liquid chromatography(UPLC)fingerprints of Scutellaria baicalensis Georgi (SBG) collected from different habitats so as that we could quickly and effectively discriminate SBG by UPLC fingerprint and discriminant analysis. Methods:The UPLC separation was performed on a Aquity BEH C18analytical column gradient eluted with acetonitrile -0.1% formic acid at the flow rate of 0.4mL/min .The temperature of column was 40℃. The PDA detection wavelength was 280nm .UPLC fingerprint was adopted to analyze 64 batches of SBG collected from different habitats.The similarity was evaluated according to the software‘Herb Fingerprint Similarity Assessment System’(2004A) ,and Fisher’s linear discriminant functions were established by discriminant analysis.Results:The similarity index of 64 batches SBG is greater than 0.95. The experimental results indicated that the samples collected from Henan, Shangong and Hebei provinces could be distinguished completely. The accuracy of geographical tracing prediction model of every provinces is greater than 94.7%Conclusion:Combining to the discriminant analysis,we could quickly and effectively discriminate SBG by UPLC fingerprint.This method can be used for origin identification of SBG collected from different habitats.

ScutellariabaicalensisGeorgi(SBG);UPLC; Fingerprint Chromatography; Discriminant Analysis

2014-12-08

國家自然科學(xué)基金項目(81202903)；科技部中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(201407003)

蘇建春(1987-)，女，滿族，成都中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生，研究方向為中藥新劑型、新制劑、新技術(shù)研究以及中藥復(fù)方質(zhì)量評價與物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

尹蓉莉，成都中醫(yī)藥大學(xué)教授，研究方向為中藥新劑型、新制劑、新技術(shù)。E-mail:yinronglili@163.com；李化(1976-)，博士，中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所副研究員，研究方向為中藥及其復(fù)方質(zhì)量評價與藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。E-mail:lihua621@hotmail.com

R284.1

A

1673-2197(2015)04-0024-04

10.11954/ytctyy.201504012