海風藤正丁醇提取物抗類風濕作用藥效學(xué)研究

秦 晴，闕金花，張玉琴，李 煌，徐 偉，褚克丹

(福建中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，福建 福州 350122)

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海風藤正丁醇提取物抗類風濕作用藥效學(xué)研究

秦 晴，闕金花，張玉琴，李 煌，徐 偉，褚克丹*

(福建中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，福建 福州 350122)

目的：研究海風藤正丁醇提取物的抗類風濕活性。方法：采用熱板法、棉球肉芽法、耳腫脹法等建立炎癥和疼痛模型，觀察海風藤正丁醇提取物對大鼠、小鼠的抗炎鎮(zhèn)痛作用。結(jié)果：海風藤正丁醇提取物各劑量組均表現(xiàn)出較好的抗炎鎮(zhèn)痛效果，且抗炎作用強于鎮(zhèn)痛作用。結(jié)論：海風藤正丁醇提取物具有較好的抗炎鎮(zhèn)痛作用，可作為抗類風濕關(guān)節(jié)炎的潛在開發(fā)藥物。

海風藤；抗炎鎮(zhèn)痛；類風濕關(guān)節(jié)炎

海風藤為胡椒科植物風藤(Piperkadsura(Choisy) Owchi.)的干燥藤莖，具有祛風濕、通經(jīng)絡(luò)、止痹痛的功效，用于風寒濕痹、肢節(jié)疼痛、筋脈拘攣、屈伸不利等癥的治療[1]。該藥最早記載于清代葉天士的《本草再新》，謂“海風藤行經(jīng)絡(luò)、和血脈、寬中理氣、下濕祛風”，在民間亦廣泛用于風濕痹證的治療。海風藤的主要化學(xué)成分為胡椒堿類生物堿、木脂素、揮發(fā)油，次要化學(xué)成分為黃酮和脂肪酸類化合物[2-3]。

查閱總結(jié)相關(guān)文獻可知，海風藤的藥理作用研究主要集中在腦損傷保護方面[4-6]，對其抗風濕作用研究較少，僅有少數(shù)學(xué)者對其提取物進行了抗炎作用研究[7-8]。類風濕關(guān)節(jié)炎的臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫脹、疼痛，炎癥和疼痛是其兩大主要癥狀，因此臨床治療以抗炎、鎮(zhèn)痛為主。本研究采用熱板法、棉球肉芽法、耳腫脹法等建立炎癥和疼痛模型，觀察海風藤正丁醇提取物對大鼠的抗炎鎮(zhèn)痛作用，為今后進一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 動物

SPF級Wistar大鼠，6周齡，體重(180±20)g，雄性；KM小鼠，4周齡，體重(20±2)g，雌雄各半，均由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，實驗動物合格證號：SCXX(滬)2008-0005。福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供SPF級醫(yī)學(xué)實驗動物環(huán)境設(shè)施，使用許可證號：SYXK(閩)2009-0001。

1.2 儀器與設(shè)備

YLS-Q4耳腫脹打耳器(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)；SE202F型電子天平(奧豪斯儀器(上海)有限公司)；YLS-7B型足趾容積測量儀(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站)；YLS-6A型智能熱板儀(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站)；OS200-PH型光學(xué)顯微鏡(重慶奧特光學(xué)儀器有限責任公司)；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)；TGL-5-A臺式水平離心機(上海安亭科學(xué)器材公司)；MILLI-Q超純水裝置(美國MILIPORE公司)；ELX80O酶標儀(美國BIO-Tek公司)；101C-3電熱鼓風干燥箱(上海實驗儀器總廠)。

1.3 藥物與試劑

海風藤：福州回春中藥飲片廠有限公司，批號：130928；阿司匹林片：浙江醫(yī)藥股份有限公司，批號：185501；消炎痛：臨汾奇林藥業(yè)有限公司，批號：1009041；地塞米松：浙江仙琚制藥有限公司，批號：131189；二甲苯：國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：F20050608；角叉菜膠：美國Sigma公司，批號：073K0052；冰醋酸：南京化學(xué)試劑廠，批號：08260。

2 方法

2.1 藥物制備

取海風藤7kg，用70%乙醇回流提取3次，每次1.5h，合并提取液，得到乙醇提取物。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇，浸膏加水混懸后，依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取，回收溶劑后蒸干得到正丁醇部分377.37g，分別用0.5% CMC-Na溶液配成7.72mg/kg(低)、15.44mg/kg(中)、30.88mg/kg(高)的海風藤提取液。

2.2 二甲苯所致小鼠耳腫脹模型[9-10]

將50只KM小鼠隨機分為五組，分別為模型對照組、陽性對照組(地塞米松)、海風藤正丁醇提取物高、中、低劑量組。各實驗組小鼠每天按設(shè)定劑量連續(xù)灌胃給藥1周，每天1次，模型對照組小鼠給予等量溶媒。

末次給藥后30min于每只小鼠左耳兩面涂抹適量(0.05mL)純二甲苯，以右耳為對照，建立炎癥小鼠模型。1h后，將小鼠頸椎脫臼處死，沿耳廓基線取下兩耳，用打孔器分別在兩耳同一部位取下圓耳片，分別稱重，以左右耳片重量之差作為耳廓腫脹度，評價藥物的抗炎效應(yīng)，并計算其抑制率。耳廓腫脹抑制率=(左耳重量-右耳重量)/左耳重量×100%。

2.3 棉球所致大鼠肉芽腫模型[9-10]

取大鼠50只，體重180～220g，雄性，隨機分為五組，每組10只，分別為模型對照組、陽性對照組(地塞米松)、海風藤正丁醇提取物高、中、低劑量組。實驗前所有大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(30mg/kg)麻醉，背部剃毛。采用手術(shù)法于大鼠背部皮下植入已消毒稱重的棉球，縫合皮膚，外部消毒。于手術(shù)當日開始給藥，各實驗組大鼠每天按設(shè)定劑量連續(xù)灌胃給藥1周，每天1次，模型對照組大鼠給予等量溶媒。于末次給藥后處死大鼠，取出植入的棉球，仔細剝離附著組織，放置烘箱60℃烘干，稱重，減去原棉球重，即為肉芽組織重量，計算抑制率。抑制率=(給藥組肉芽腫重量-模型對照組肉芽腫重量)/模型對照組肉芽腫重量×100%。

2.4 角叉菜膠所致大鼠足腫脹模型[9-10]

取大鼠60只，隨機均分為六組，分別為空白對照組、模型對照組、陽性對照組(消炎痛)和海風藤正丁醇提取物高、中、低劑量組，各實驗組大鼠每天按設(shè)定劑量連續(xù)灌胃給藥14天，空白對照組、模型對照組大鼠給予等量溶媒。

末次給藥后1h于大鼠右后足踝關(guān)節(jié)處作標記，按足容積法測定2次，取平均值作為給藥前正常足容積(mL)。然后將1%角叉菜膠生理鹽水0.1mL注入大鼠左后肢足趾皮下制造炎癥模型，分別于注入后l、2、4、6h測定大鼠足容積，以足腫脹度評價海風藤提取物的抗炎效應(yīng)。

2.5 熱刺激所致小鼠疼痛反應(yīng)模型[9-10]

實驗前，將小鼠置于熱板儀(55.0±0.5℃)上，立刻計時，記錄小鼠從置于熱板上到出現(xiàn)舔后足現(xiàn)象的時間(s)，作為小鼠的正常痛閾值。凡舔后足時間小于5s或大于30s以及跳躍不安者，均棄之不用。

取小鼠50只，雌雄各半，隨機分為空白組、陽性對照組(消炎痛)、海風藤正丁醇提取物高、中、低劑量組，各實驗組小鼠每天按設(shè)定劑量連續(xù)灌胃給藥14天，每天1次，空白組小鼠給予等體積溶媒。末次給藥lh后將各組小鼠分別放入熱板儀內(nèi)，以舔后足作為疼痛反應(yīng)的指標，記錄小鼠自投入熱板至出現(xiàn)舔后足反應(yīng)的時間。60s內(nèi)無反應(yīng)的小鼠應(yīng)立即取出，以免燙傷，其痛閾值按60s計算，以痛閾值評價海風藤提取物的鎮(zhèn)痛作用。

2.6 醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)模型[9-10]

取小鼠50只，雌雄各半，隨機分為模型組、陽性對照組(阿司匹林)、海風藤正丁醇提取物高、中、低劑量組，各實驗組小鼠每天按設(shè)定劑量連續(xù)灌胃給藥3天，每天1次，模型對照組小鼠給予等體積溶媒。末次給藥lh后將0.6%醋酸溶液注射于小鼠腹腔內(nèi)，以引起深部、大面積而持久的疼痛刺激，致使小鼠產(chǎn)生扭體反應(yīng)。以小鼠腹部凹陷、雙后肢伸展為扭體反應(yīng)的指標，觀察各組小鼠出現(xiàn)扭體反應(yīng)的時間(潛伏期)及15min內(nèi)扭體反應(yīng)的次數(shù)。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響

涂抹二甲苯后，與右耳比較，小鼠左耳產(chǎn)生明顯腫脹。與模型對照組小鼠比較，各給藥組小鼠左耳腫脹程度均有所減輕，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。表明海風藤正丁醇提取物能明顯抑制二甲苯所致小鼠耳腫脹，抑制率均大于35%，且隨著劑量的增加抑制作用增強。結(jié)果見表1。

表1 海風藤正丁醇提取物對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響 (±s)

注：與模型組比較，**P<0.01。

3.2 棉球所致大鼠肉芽腫模型

大鼠背部皮下植入滅菌棉球后可形成慢性肉芽腫，以此模擬慢性炎癥反應(yīng)。與模型組大鼠比較，中、高劑量組大鼠肉芽腫重量顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)，且低劑量組也有抑制趨勢，但與模型組大鼠比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。海風藤正丁醇提取物對慢性炎癥有較強抑制作用，且以高劑量組作用最為顯著。詳見表2。

表2 海風藤正丁醇提取物對大鼠棉球肉芽腫的影響 (±s)

注：與空白對照組比較，**P<0.01，*P<0.05。

3.3 對角叉菜膠致大鼠足腫脹的影響

大鼠左后足注射1%角叉菜膠后，足爪出現(xiàn)明顯腫脹。各組大鼠給予相應(yīng)藥物后，空白對照組、海風藤正丁醇提取物高、中、低劑量組大鼠足腫脹值均低于模型組；高劑量組大鼠致炎后2、4、6h足腫脹值與模型組比較差異具有極顯著性意義(P<0.01)，但中、低劑量組大鼠足腫脹值與模型組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，提示高劑量海風藤正丁醇提取物能有效抑制角叉菜膠所致足腫脹。詳見表3。

表3 海風藤正丁醇提取物對角叉菜膠致大鼠足腫脹影響 (±s)

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與空白組比較，##P<0.01。

3.4 對熱刺激所致小鼠疼痛反應(yīng)的影響

與空白組比較，海風藤正丁醇提取物各劑量組小鼠疼痛反應(yīng)出現(xiàn)時間均延長，其中高劑量組延長作用最明顯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表4。

表4 海風藤正丁醇提取物對熱刺激致小鼠疼痛反應(yīng)影響 (±s,s)

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.5 對小鼠化學(xué)刺激法疼痛反應(yīng)的影響

與模型組比較，海風藤正丁醇提取物高、中劑量組小鼠疼痛反應(yīng)出現(xiàn)時間稍延長，15min內(nèi)扭體次數(shù)明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。說明海風藤正丁醇提取物對化學(xué)刺激法引起的小鼠疼痛反應(yīng)有明顯抑制作用，且作用強度與藥物劑量有一定關(guān)系。詳見表5。

表5 海風藤正丁醇提取物對小鼠化學(xué)刺激法疼痛反應(yīng)影響 (±s,s)

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

4 討論

本研究采用熱板法、棉球肉芽法、耳腫脹法等建立炎癥和疼痛模型，觀察海風藤正丁醇提取物對大鼠、小鼠的抗炎鎮(zhèn)痛作用。從炎癥模型實驗中可以看出，海風藤正丁醇提取物低、中、高劑量都有較好的抗炎效果，但在鎮(zhèn)痛實驗中，低劑量海風藤正丁醇提取物未顯示出明顯鎮(zhèn)痛效果。表明海風藤正丁醇提取物各劑量組均表現(xiàn)出較好的抗炎鎮(zhèn)痛效果，且抗炎作用強于鎮(zhèn)痛作用，為進一步研究其抗風濕活性奠定了基礎(chǔ)。

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(責任編輯：尹晨茹)

2014-10-20

國家自然科學(xué)基金項目(81001624)；福建中醫(yī)藥大學(xué)校管課題(XB2011006)

秦晴(1984-)，福建中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生，研究方向為中藥制劑及質(zhì)量標準。

褚克丹(1963-)，女，福建中醫(yī)藥大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為中藥藥劑及質(zhì)量標準控制。

R285.5

A

1673-2197(2015)04-0013-03

10.11954/ytctyy.201504007