24-乙酰澤瀉醇A對Ox-LDL誘導的大鼠血管平滑肌細胞基質(zhì)金屬蛋白酶-9表達的影響

周曉茂，薛偕華

(1．福建中醫(yī)藥大學 康復醫(yī)學院，福建 福州 350003； 2．福建中醫(yī)藥大學附屬康復醫(yī)院 腦病科，福建 福州 350003)

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24-乙酰澤瀉醇A對Ox-LDL誘導的大鼠血管平滑肌細胞基質(zhì)金屬蛋白酶-9表達的影響

周曉茂1，薛偕華2*

(1．福建中醫(yī)藥大學 康復醫(yī)學院，福建 福州 350003； 2．福建中醫(yī)藥大學附屬康復醫(yī)院 腦病科，福建 福州 350003)

目的：探討24-乙酰澤瀉醇A對氧化性低密度脂蛋白(Ox-LDL)誘導的大鼠血管平滑肌細胞基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)表達的影響，闡明其抗動脈粥樣硬化的作用機制。方法：采用酶消化法培養(yǎng)大鼠VSMCs，在Ox-LDL(50mg/L)、24-乙酰澤瀉醇A(10μg/mL)作用下，將所有大鼠分為空白對照組、Ox-LDL組和澤瀉A組三組，采用RT-PCR方法檢測平滑肌細胞MMP-9中mRNA的表達，采用Western blotting法檢測MMP-9蛋白表達的變化。結果：與空白對照組比較，Ox-LDL刺激平滑肌細胞，MMP-9中mRNA和蛋白的表達上調(diào)(P<0.05)；24-乙酰澤瀉醇A(10μg/mL)可抑制Ox-LDL誘導的平滑肌細胞MMP-9中mRNA和蛋白的表達(P<0.05)。結論：24-乙酰澤瀉醇A可抑制Ox-LDL誘導的大鼠平滑肌細胞遷移，抑制其MMP-9表達，為動脈粥樣硬化的臨床治療提供新方法。

24-乙酰澤瀉醇A；血管平滑肌細胞；基質(zhì)金屬蛋白酶-9

動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)為心腦血管疾病的主要病理基礎，研究表明氧化損傷在AS及其并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要作用[1]。氧化性低密度脂蛋白(Ox-LDL)可促進泡沫細胞形成及血管平滑肌細胞的增殖和遷移，導致動脈粥樣硬化[2]。細胞外基質(zhì)(Extracellular matrixc,ECM )和基底膜的降解則是平滑肌細胞(VSMCs)遷移的前提條件。基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)是一個蛋白酶家族，由巨噬細胞、VSMCs等細胞產(chǎn)生，可廣泛降解ECM。其中，MMP-9為MMPs家族的重要成員，在VSMCs遷移至血管內(nèi)膜、新生內(nèi)膜形成、血管重構及不穩(wěn)定性斑塊破裂等過程中發(fā)揮著重要的促進作用[3-4]。澤瀉為利水滲濕之要藥，24-乙酰澤瀉醇A為澤瀉中含有的主要萜類有效成分。研究表明，澤瀉中三萜類化合物具有利尿、降血脂、抗動脈粥樣硬化等作用[5-6]。目前，24-乙酰澤瀉醇A抗As的作用機制尚不清楚，未見其對MMP-9表達影響的相關研究。本研究以Ox-LDL誘導的大鼠VSMCs為模型，觀察24-乙酰澤瀉醇A對VSMCs遷移MMP-9表達的影響，探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM/F-12培養(yǎng)基(Hyclone公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；清潔級SD雄性大鼠4只，購自福建醫(yī)科大學實驗動物中心(許可證號：SCXK(閩)2012-0001)；氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL，1.32mg/L)(北京協(xié)生生物科技公司)；24-乙酰澤瀉醇A(上?？禈擞邢薰?；RT-PCR試劑盒、Trizol(Promega公司)；MMP-9 PCR引物(上海生工生物工程有限公司)；ECL試劑(北京碧云天有限公司)；山羊抗兔二抗(碧云天生物技術研究所)；兔抗大鼠MMP-9、β-actin一抗(CST公司)；Western blot電泳設備(Bio-RAD公司)；細胞培養(yǎng)箱(Therom公司)；Leica DMIL LED倒置顯微鏡。

1.2 大鼠VSMCs分離及培養(yǎng)

雄性SD大鼠以頸椎脫臼法處死，無菌條件下分離出胸主動脈，刮去內(nèi)、外膜，將組織剪成1mm×1mm大小的組織塊,加入II型膠原酶，37℃下消化30min，加入濃度為20%的胎牛血清DMEM液，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)5～7天，細胞從組織塊周圍爬出并生長融合、傳代，用濃度為10%的胎牛血清DMEM液培養(yǎng)，每隔2～3天換液1次，胰酶消化傳代。3～6代細胞用于實驗研究。

1.3 細胞干預分組

取“1.2”項對數(shù)生長期細胞，接種于6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)24h，換不含血清DMEM液培養(yǎng)24h，使細胞生長同步于G0期。根據(jù)不同處理將細胞分為三組：(1)空白對照組：不加任何干預劑，24h后收集細胞；(2)Ox-LDL組：加Ox-LDL(50mg/L)，24h后收集細胞；(3)澤瀉A組：24-乙酰澤瀉醇A 10μg/mL預孵育1h，然后加Ox-LDL(50mg/L)刺激，24h后收集細胞。每組實驗均重復3次。

1.4 RT-PCR檢測MMP-9 mRNA的表達

用Trizol試劑(Gibco公司)提取總RNA，取1μg各組細胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再各取2μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分別進行PCR。MMP-9的引物序列為：上游引物為5-CAAGGACGGTCGGTATTGGAAG-3，下游引物為5-AAACGAGTAACGCTCTGGGGAT-3，擴增片段長度為348bp；內(nèi)參照GAPDH引物序列為：上游引物為5-GTGGAGTCTACTGGCGTCTTC-3，下游引物為5-CATGCCAGTGAGCTTCCCGTT-3，擴增片段長度為149bp。擴增條件：95℃變性45s；54℃退火45s；72℃延伸1min；30個循環(huán)，72℃延伸2min。取3μL產(chǎn)物，在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳(100 V)18min，紫外燈下拍照，對電泳帶進行吸光度掃描，以MMP-9/GAPDH代表MMP-9中mRNA的相對表達量。實驗獨立重復3次。

1.5 Western blot檢測MMP-9、p-ERK和ERK蛋白的表達

細胞經(jīng)胰酶消化后吹打離心，加100μL裂解緩沖液裂解，充分研磨后離心，吸取上清液，測樣品蛋白變性，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后將PVDF膜取出用封閉液封閉2h，分別加入抗MMP-9、 β-actin(1∶1 000)抗體孵育，4℃下過夜，室溫下加入相應二抗(1∶5 000)60min。將PVDF膜放圖像掃描儀上，避光配置顯色液并覆蓋PVDF膜，反應1min后運用Image-lab軟件進行分析處理。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 大鼠VSMCs培養(yǎng)與鑒定

倒置相差顯微鏡下，單個平滑肌細胞呈梭形或不規(guī)則三角形，有多個細胞突起，胞質(zhì)豐富，密度高，核圓形居中。生長融合后呈典型“峰谷征”。見圖1。

圖1 原代大鼠VSMC細胞形態(tài)學鑒定：普通光鏡下細胞融合后呈“峰谷征”(×100)

2.2 24-乙酰澤瀉醇A對Ox-LDL誘導的VSMCs MMP-9 mRNA表達的影響

空白對照組VSMCs存在著MMP-9 mRNA的基礎表達；加入Ox-LDL(50mg/L)處理24h后，MMP-9 mRNA表達明顯上調(diào)(P<0．05)。24-乙酰澤瀉醇A(10μg/mL)預孵育VSMCs1h，Ox-LDL誘導的VSMCs MMP-9 mRNA表達上調(diào)可部分抑制(P<0．05)。GAPDH作為內(nèi)參。見圖2。

圖2 平滑肌細胞MMP-9 mRNA表達

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與Ox-LDL組比較，#P<0.05。

2.3 24-乙酰澤瀉醇A對Ox-LDL誘導的VSMCs MMP-9 蛋白表達的影響

與空白對照組比較，Ox-LDL(50mg/L)刺激下VSMCs的MMP-9蛋白水平顯著升高(P<0.05)。24-乙酰澤瀉醇A(10μg/mL)預孵育VSMCs 1h亦可明顯抑制Ox-LDL誘導的VSMCs MMP-9的蛋白表達上調(diào)(P<0．01)。β-actin作為內(nèi)參。見圖3。

圖3 平滑肌細胞MMP-9蛋白表達

注：與空白對照組比較，*P<0．05；與Ox-LDL組比較，##P<0．05。

3 討論

澤瀉為澤瀉科植物澤瀉(Alismaorientalis(Sam．)Juzep．)的干燥塊莖，具有利水滲濕、化濁降脂功能。澤瀉中含有的主要三萜類成分為澤瀉醇A、24-乙酰澤瀉醇A、澤瀉醇B及23-乙酰化物等。從澤瀉脂溶性部分中分離得到的三萜類化合物被認為是降血脂的有效成分，其中以24-乙酰澤瀉醇A作用最強[7]。以往研究主要集中于24-乙酰澤瀉醇A的降脂作用,而關于抑制血管平滑肌細胞遷移方面的研究較少。

平滑肌細胞(VSMC)位于血管中膜，是血管中層唯一的細胞成分。生理條件下，VSMC通過收縮和舒張調(diào)節(jié)血管張力，通過分泌和釋放血管調(diào)節(jié)因子維持血管正常功能。VSMC由中膜遷移到內(nèi)膜下間隙并異常增殖是動脈粥樣硬化、高血壓和血管再狹窄等疾病的共同細胞病理基礎。而細胞外基質(zhì)尤其是基底膜為VSMCs遷移必須克服的生理屏障，基質(zhì)金屬蛋白酶是降解VSMCs基底膜基質(zhì)的主要酶類。MMPs可降解ECM，其中MMP-2(明膠酶A)和MMP-9(明膠酶B)是降解基底膜Ⅳ型膠原最主要的MMPs[8]。曹冠群等[9]研究表明：鋅指蛋白A20通過下調(diào)MMP-9的表達，抑制Ox-LDL介導VSMCs的遷移作用。研究表明干擾MMP-9基因表達，能有效抑制VSMCs的遷移[10-11]。本實驗發(fā)現(xiàn)：Ox-LDL組的MMP-9表達水平較空白對照組有所升高，而澤瀉醇A(10μg/mL)組MMP-9的mRNA和蛋白表達水平較Ox-LDL組降低，且MMP-9 蛋白表達水平下降較mRNA顯著，可能由于MMP-9為分泌型蛋白，除檢測細胞內(nèi)的MMP-9蛋白，細胞培養(yǎng)基中還有分泌型MMP-9蛋白，表明MMP-9表達的增高可能促進血管平滑肌細胞遷移；24-乙酰澤瀉醇A可抑制VSMCs遷移，其作用可能與抑制MMP-9的表達相關。

綜上所述，24-乙酰澤瀉醇A可抑制Ox-LDL誘導的大鼠平滑肌細胞遷移，抑制其MMP-9表達，為24-乙酰澤瀉醇A防治動脈粥樣硬化提供重要的理論和實踐依據(jù)。

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(責任編輯：李嵐春)

2014-11-21

福建省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研項目(WZSY201304)；福建省衛(wèi)生系統(tǒng)中青年骨干人才培養(yǎng)項目(2013-ZQN-20-28)；國家自然科學基金項目(81473744)

周曉茂(1988-)，女，福建中醫(yī)藥大學碩士研究生，研究方向為腦血管病的基礎和康復研究。

薛偕華(1978-)，男，福建中醫(yī)藥大學附屬康復醫(yī)院副主任醫(yī)師，研究方向為動脈粥樣硬化的基礎和臨床研究。E-mail：465356738@qq.com

R285.5

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1673-2197(2015)04-0007-03

10.11954/ytctyy.201504005