甲醛固定的H22細(xì)胞聯(lián)合IL-2抑制小鼠H22肝癌生長效果觀察

鐘秋明，劉 瑤，曾小斌

(贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，江西贛州341000)

T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答在機(jī)體抗腫瘤免疫中起著關(guān)鍵作用，T細(xì)胞的致敏、激活和擴(kuò)增依賴于抗原呈遞細(xì)胞(APC)提呈相應(yīng)的抗原多肽并提供共刺激信號［1］。然而，由于許多腫瘤細(xì)胞為弱免疫原性，呈現(xiàn)MHC分子與共刺激分子的表達(dá)低下或缺如，致使腫瘤抗原不能得到有效的提呈，因而不能激活體內(nèi)特異性的殺傷機(jī)制及誘導(dǎo)機(jī)體有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答［2，3］。腫瘤細(xì)胞經(jīng)甲醛固定后其抗原性和免疫原性得以保留，但致癌性大為減弱［4～9］，將其注入腫瘤細(xì)胞可有效誘導(dǎo)T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫。IL-2是體內(nèi)功能最強(qiáng)的淋巴細(xì)胞增殖因子，是有效的抗腫瘤細(xì)胞因子［1］。2011年3月～2012年5月，我們建立了小鼠H22細(xì)胞皮下移植瘤模型，并聯(lián)用IL-2和甲醛固定的H22細(xì)胞對其進(jìn)行免疫治療，效果滿意?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型的建立 雌性昆明種小鼠20只，體質(zhì)量15～20 g，4～6周齡，購自贛南醫(yī)學(xué)院。每只小鼠股部皮下接種1×105個(gè)H22肝癌細(xì)胞，待腫瘤平均直徑達(dá)1 cm為模型建立成功。本組20只小鼠均成功造模。隨機(jī)分為A、B、C、D組，各5只。

1.2 主要試劑及材料 小鼠H22肝癌細(xì)胞由贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院臨床科研中心保存，小鼠腹腔傳代。RPMI1640培養(yǎng)液購自Sigma公司，胎牛血清購自杭州四季清生物工程材料研究所。四甲基偶氮唑鹽(MTT)為Amresco公司產(chǎn)品。重組人白介素-2 (rhIL-2)購自廈門特寶生物工程有限公司。兔抗鼠CD8購自eBioscience公司。鏈霉素—卵白素—生物素—過氧化物酶復(fù)合物(SABC)試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。1.3 甲醛固定H22腫瘤細(xì)胞 取對數(shù)生長期的H22細(xì)胞以10%甲醛固定2 h，并分別用70%乙醇和磷酸鹽緩沖液洗滌離心兩次，轉(zhuǎn)速為1 000 r/ min。棄上清沉淀用RPMI1640重懸后，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)以除去殘余的甲醛。48 h后離心，棄上清沉淀用PBS重懸并調(diào)整細(xì)胞濃度至106/mL，儲存于無菌 EP管內(nèi)備用［6］。rhIL-2工作濃度為8×103IU/mL，放于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 給藥及效果觀察方法 A、B、C、D組小鼠瘤內(nèi)分別注射生理鹽水0.5 mL、固定H22細(xì)胞1×103個(gè)(0.5 mL)、IL-2 4×103IU(0.5 mL)、上述量的固定H22細(xì)胞和IL-2(共0.5 mL)。rhIL-2濃度為8× 103IU/mL。3 d后重復(fù)注射，共注射4次。隔天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長、短徑。腫瘤體積按公式V (mm3)=0.4ab2計(jì)算，a代表長徑(mm)，b代表短徑(mm)。治療結(jié)束處死動(dòng)物，取瘤稱重，并計(jì)算抑瘤率抑瘤率計(jì)算公式為［1－(治療組開始平均瘤體積－治療組結(jié)束平均瘤體積)/對照組開始平均瘤體積］×100%。以40 g/L甲醛固定瘤組織，常規(guī)石蠟包埋，切片，采用免疫組化SABC法染色，光鏡下觀察瘤內(nèi)T淋巴細(xì)胞表達(dá)情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

A、B、C、D組腹部移植腫瘤治療后質(zhì)量分別為(6.683±1.102)、(2.851±0.223)、(2.282± 0.443)、(1.052±0.225)g，B、C、D組與A組相比明顯降低，D組與 B、C組相比明顯降低(P均 ＜0.05)。B、C、D組抑瘤率分別為51.58%、60.54%、80.96%。D組小鼠瘤體內(nèi)大量腫瘤細(xì)胞變性和壞死，且瘤內(nèi)有大量T淋巴細(xì)胞浸潤，陽性產(chǎn)物主要呈現(xiàn)在細(xì)胞膜上并被染成棕褐色。B、C組瘤內(nèi)T淋巴細(xì)胞浸潤數(shù)量明顯少于D組，A組瘤內(nèi)未見T淋巴細(xì)胞浸潤。

3 討論

肝細(xì)胞癌作為一種常見的惡性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展與肝癌細(xì)胞抗原提呈功能低下有很大關(guān)系［10～12］。目前已有多種方法經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)可以打破抗腫瘤免疫缺陷，增強(qiáng)抗原提呈細(xì)胞的活性，激發(fā)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答達(dá)到預(yù)防腫瘤生成的目的，但由于安全性和倫理原因未能大規(guī)模應(yīng)用于臨床［13］。

如何發(fā)現(xiàn)更多的腫瘤特異性抗原及有效的提呈該抗原是激活體內(nèi)抗腫瘤免疫的關(guān)鍵所在。樹突細(xì)胞(DCs)是體內(nèi)最主要的抗原提呈細(xì)胞［13］。有學(xué)者對部分HCC患者外周血進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)患者體內(nèi)DC多伴有成熟障礙及功能受損，不能有效提呈抗原激活免疫［10，11］。體外試驗(yàn)表明用各種方法制備的腫瘤抗原致敏的DC疫苗有引發(fā)自身免疫性疾病的可能，其安全性限制了以DC為主的腫瘤免疫療法在臨床工作中的應(yīng)用。

腫瘤細(xì)胞經(jīng)甲醛固定后其抗原性和免疫原性得以保留，但致癌性大為減弱［4～9］，將其注入腫瘤細(xì)胞可有效誘導(dǎo)T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫。固定的腫瘤細(xì)胞能提供特異性顆粒性抗原［4，6］?？乖蔬f細(xì)胞，尤其是未成熟DC吞噬顆粒性抗原后將特異性腫瘤抗原遞呈到MHC I分子，從而激發(fā)MHC I限制性CTL反應(yīng)，特異性殺傷腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤生長。

IL-2是體內(nèi)功能最強(qiáng)的淋巴細(xì)胞增殖因子，它能作用于T細(xì)胞、大顆粒淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和B細(xì)胞，進(jìn)細(xì)胞增殖和分泌細(xì)胞因子，增強(qiáng)CTL細(xì)胞毒活性、促進(jìn)細(xì)胞移動(dòng)，增強(qiáng)細(xì)胞間接觸和誘導(dǎo)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子(IFN2α、IL-2、TNF和CSF等)?？紤]全身給予重組IL-2會導(dǎo)致較多的全身反應(yīng)，本研究采取瘤內(nèi)直接注射的方法，既能提高局部藥物濃度，又能避免引起不良反應(yīng)。

本研究結(jié)果證實(shí)了甲醛固定H22細(xì)胞聯(lián)合IL-2能顯著激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，明顯抑制小鼠皮下移植H22瘤的生長。但人體體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果并不令人滿意:①提取腫瘤抗原需大量癌組織，限制了其臨床應(yīng)用;②腫瘤細(xì)胞或其粗提取物及凋亡小體純度不高，含有自身抗原和其它外源性抗原成份，干擾免疫反應(yīng)，還可引起免疫耐受或自身免疫性疾病等。盡管目前腫瘤疫苗種類多樣，基本點(diǎn)還是建立在增強(qiáng)疫苗原性，最大限度地提高機(jī)體主動(dòng)免疫功能，從而達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞目的。雖然應(yīng)用DC腫瘤疫苗對肝癌患者進(jìn)行免疫治療剛剛起步，可以預(yù)見肝癌疫苗在不遠(yuǎn)的將來能成為肝癌治療的重要手段之一。

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