芍藥籽中幾種單萜苷含量的測定

（信陽農(nóng)林學院生物技術(shù)系，河南 信陽 464300）

摘 要：建立了RP-HPLC法測定芍藥籽中單萜苷類含量的方法。芍藥苷等單萜苷類物質(zhì)具有較好的生物活性，目前，芍藥中的單萜苷目前主要來源于芍藥的根，分析結(jié)果表明，芍藥籽仁中也含有較多的單萜苷，這些單萜苷也可以作為另一個重要的單萜苷來源。

關(guān)鍵詞：RP-HPLC法;單萜苷;含量測定

0 引言

芍藥屬毛茛科，雙子葉植物綱，為灌木或多年生草本植物。芍藥是多年生宿根草本，具紡錘形肉質(zhì)根。芍藥苷是芍藥中提取的主要活性成分，具有解痙鎮(zhèn)痛和改善記憶、抗自由基損傷等功能和抑制細胞內(nèi)鈣超載、抗KA神經(jīng)病變的生理功能。

單萜苷類化合物是天然藥物中一類重要的化學成分，在植物中廣泛分布，是許多常用中藥的有效成分，如芍藥、牡丹、花椒等。主要有無環(huán)、單環(huán)、雙環(huán)、三環(huán)單萜苷和環(huán)烯醚萜苷等多種結(jié)構(gòu)類型。

1 材料與方法

1.1 實驗原料

芍藥（Paeonia lactiflora Pall.）籽：采自河南省孟津縣土橋村花木公司基地，原植物及樣品由該公司總經(jīng)理衛(wèi)志鵬老師鑒定。

1.2 實驗儀器與試劑：

儀器： Agilent1100高效液相色譜儀（安捷倫公司）;SENCO W201恒溫水浴鍋（上海申生科技有限公司）; FA2004電子天平（天津市天分分析儀器廠） ;YXJ-A高速大容量電動離心機（江蘇金壇市環(huán)宇科學儀器廠）; SB-2A型紫外分光光度計（天津市天分分析儀器廠）;100 mL容量瓶、1 mL/5 mL移液管、50 mL/100 mL量筒、40 mL/50 mL/80 mL燒杯、100 mL圓底燒瓶等玻璃儀器均來自四川蜀牛玻璃儀器廠;0-100酒精計（河北省武強縣同輝儀表廠）;試劑：磷酸，分析純;乙腈，色譜純;甲醇，色譜純;磷酸二氫鉀，色譜純;二次蒸餾水，自制;對照品：4′′-羥基白芍苷，氧化芍藥苷，白芍苷，芍藥苷，paeonidanin和白芍苷R1等均為本實驗室自制，經(jīng)NMR和 ESI-MS鑒定了化合物的結(jié)構(gòu)，經(jīng)HPLC測定純度大于98%。

2 實驗條件

2.1 色譜條件

Agilent1100高效液相色譜儀;色譜柱：Zorbax SB-Aq C18色譜柱（4.6×250 mm，5μm）;流動相：乙腈-磷酸（0.05），或乙腈-磷酸二氫鉀緩沖鹽（pH=3.0）;體積流量為1.0 mL· min-1;柱溫：30℃;進樣量：10 μL。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取對照品4′′-羥基白芍苷10.3 mg，氧化芍藥苷10.4 mg，白芍苷10.8 mg，芍藥苷18.6 mg，paeonidanin 14.9 mg，白芍苷R1 8.1 mg，用甲醇定容于50 mL容量瓶中，配成濃度為206 μg·mL-1， 208 μg·mL-1， 216 μg·mL-1， 372 μg·mL-1， 298 μg·mL-1， 161 μg·mL-1的混合溶液，即為對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取采集的芍藥種子，脫殼機脫殼，收集芍藥籽仁和籽殼，將籽仁和籽殼置于100℃的烘箱中烘3h。將經(jīng)過烘干的芍藥籽殼和籽餅粕粉碎，過60目篩，分別精密稱取10.00克樣品，用濾紙包好，加入100mL甲醇為提取溶劑，采用索氏提取器回流提取4h。回收提取液，冷卻后，濾液用0.45μm的微孔濾膜過濾，定容于100mL容量瓶中，即為供試品溶液。

3 實驗結(jié)果

3.1 吸收紫外波長的選擇

采用紫外可見分光光度計對制備的6個單萜苷標樣溶液在波長200～400 nm間掃描進行全波長掃描?？梢钥闯?′′-羥基白芍苷和氧化芍藥苷在260 nm處有明顯的吸收峰，白芍苷，芍藥苷，paeonidanin和白芍苷R1在232 nm處有最大吸收峰。因此，本測定方法的吸收波長采用變波長法測定，根據(jù)保留時間，測定4′′-羥基白芍苷和氧化芍藥苷時選擇260 nm波長，測試白芍苷，芍藥苷，paeonidanin和白芍苷R1等時選擇測定波長為232 nm。所以HPLC的檢測波長為（0～7.5 min） 260 nm， （7.5～22 min） 232 nm。

3.2 洗脫流動相的選擇

由于單萜苷類化合物含有較多的羥基，這些羥基與固定相作用較強，會導致拖尾。所以文獻報道分離芍藥苷等單萜苷類的流動相多為乙腈-磷酸水體系[1-3]。本文優(yōu)化了乙腈-磷酸水體系作為分離流動相的分離效果。發(fā)現(xiàn)僅僅乙腈-磷酸水體系難以實現(xiàn)對4′′-羥基白芍苷和氧化芍藥苷兩種單萜苷的分離。我們參考苷類分離方法的文獻[4]報道，對乙腈-磷酸二氫鉀緩沖鹽體系對單萜苷類的分離體系進行了優(yōu)化，最終選擇乙腈-磷酸二氫鉀緩沖鹽（pH=3.0）為本實驗的流動相。分離洗脫條件為：梯度洗脫，梯度為0 min（A， 15%）→10min（A， 15%）→22min（A， 25%）。在此條件下，各個單萜苷都得到很好的分離，并且分析時間較短。

3.3 供試品的制備方法的選擇

本實驗比較了甲醇、乙醇和乙腈等溶劑提取單萜苷的效率，同時對不同的提取方法（超聲、索氏回流、冷浸，回流）、提取時間、料液比及溶劑濃度進行了優(yōu)化，以其中主要成分芍藥苷的含量作為衡量標準。結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用10倍量的甲醇和乙腈用索氏提取器回流4h時芍藥苷的得率比較接近，大于用其它提取方法得到的得率。但乙腈毒性較大，綜合評價得率和安全性等因素，最后選擇甲醇作為提取溶劑。

3.4 線性關(guān)系考察

精密吸取混合對照品儲備液1 mL加入到10 mL容量瓶中，用甲醇定容。然后吸取0.75 μL、1.5 μL、3 μL、6 μL、12 μL注入色譜儀，按照2.1項下的色譜條件進行測定，記錄峰面積。以對照品的峰面積（Y）為縱坐標，進樣量（X）為橫坐標進行線性回歸，得4′′-羥基白芍苷，氧化芍藥苷，白芍苷，芍藥苷，paeonidanin和白芍苷R1的線性回歸方程見表1。

3.5 樣品含量的測定

將經(jīng)過烘干的芍藥籽仁和籽殼用高速粉碎機粉碎，過60目篩。按照“1.6”項下的方法制備供試品溶液。精密吸取對照品混合物和供試品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，照上述色譜條件分別測定，外標法計算不同部位中各個組分的含量，結(jié)果見表2。

4 試驗結(jié)論

建立了RP-HPLC法測定芍藥籽中單萜苷類含量的方法，分析結(jié)果表明，芍藥籽中的單萜苷類成分具有較好的生物活性，其在芍藥籽殼中含量相對較少，主要存在于芍藥籽仁中。以后芍藥籽仁可以作為除了芍藥的根以外的另一個重要的單萜苷來源。

另外，分析測試結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在芍藥籽餅粕中還有其它的一些單萜苷類化合物存在，這些物質(zhì)目前并沒有被分離得到，進一步研究這些化合物的結(jié)構(gòu)對于芍藥籽餅粕深入研究開發(fā)具有重要意義。

參考文獻：

[1]李偉銘，趙月然，楊燕云. HPLC波長切換法同時測定白芍飲品中9種成分的含量[J].藥物分析雜志，2011，31（12）：2208-2212.

[2]劉普，李亮，鄧瑞雪. 鳳丹籽餅粕單萜苷類成分的研究[J].中國藥學雜志，2013，48（17）：1445-1448.

作者簡介：羅婧（1983-），女，碩士，講師，研究方向：食品油脂化學。