小型動物實驗性肝纖維及肝硬化動物模型的研究進(jìn)展

肝纖維化是由于慢性肝病所致的持續(xù)或反復(fù)的肝實質(zhì)炎癥壞死而引起纖維結(jié)締組織大量增生， 其降解失衡導(dǎo)致肝內(nèi)過多膠原沉積形成肝纖維化，肝纖維化為肝硬化早期階段。因此，慢性肝損傷動物模型的制備具有重要的研究意義。肝纖維化的防治是國內(nèi)外研究的熱點，國內(nèi)外對該模型的研究較多，為此筆者對幾種常用的肝纖維化模型復(fù)制方法、機(jī)制及該模型的優(yōu)缺點加以綜述。

1 化學(xué)性肝損傷動物模型

1.1 四氯化碳中毒模型 該模型是國內(nèi)外最廣泛應(yīng)用的肝纖維化和肝損傷模型。將其溶于橄欖油、花生油等油溶液中，用濃度40% CCl4 ，按2ml/kg體重給予大鼠腹腔注射，2次/w，共8w～4個月不等。單純CCl4，一般采用30%～60%CCl4油劑皮下注射，劑量因動物種類而不同。小鼠采用1～3ml/kg體重，2次/w，肝硬化可在12～15w形成。該實驗病理學(xué)改變8w出現(xiàn)早期纖維化癥狀， 12w時肝小葉結(jié)構(gòu)破壞， 間質(zhì)纖維組織增生， 有明顯肝纖維化癥狀明顯增多， 出現(xiàn)由再生肝細(xì)胞形成的假小葉。但皮下注射過快，吸收入全身循環(huán)系統(tǒng)，腦腎毒性大，注射位置易發(fā)生浸潤性膿腫和潰瘍，故死亡率可高達(dá)30%～40%，降低CCl4濃度可降低死亡率，趙秋等[1]采用20%的CCl4死亡率為11%。亦用腹腔注射、灌胃、蒸汽吸入或拌于食物中快速口服的方法。呂明德等[2]采用飲食控制下，腹腔注射CCl4的方法制備犬肝硬變模型，也取得了滿意的結(jié)果。灌胃法優(yōu)點在CCl4直接經(jīng)門靜脈到達(dá)肝臟，1.5h后肝內(nèi)即可達(dá)最高水平，采用此法者較多，皮下注射CCl4形成時間比較慢，不如灌胃法好，灌胃的缺點仍然是死亡率較高，有的高達(dá)到52.9%。許建明等[3]也采用CCl4和花生油混合液皮下注射，誘發(fā)小鼠肝纖維化模型，對不同期肝組織病理變化分析和肝臟生化指標(biāo)的分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨造模時間延長，肝纖維化程度有逐漸增加的趨勢。至造模后期，模型組動物的血清白蛋白比例明顯下降，可能系肝纖維化進(jìn)行發(fā)展的后果，亦說明該模型后期可導(dǎo)致肝功能失代償。

1.2 二甲基亞硝胺致大鼠肝纖維化模型 二甲基亞硝胺（DMNA）是利用它所具有的肝毒性、基因毒性和免疫毒性，在動物體內(nèi)的主要代謝為一種高反應(yīng)活性化合物乙醛，可與體內(nèi)生物大分子反應(yīng)，破壞這些大分子的完整結(jié)構(gòu)。低劑量長期應(yīng)用可誘發(fā)肝腫瘤，大劑量可引起肝壞死和纖維化，常用二甲基亞硝胺，進(jìn)入肝細(xì)胞經(jīng)微粒體代謝生成乙醛損害肝細(xì)胞，同時產(chǎn)生活化的甲基，核酸與蛋白質(zhì)甲基化致肝細(xì)胞壞死。大鼠按10mg/kg體重給予10g/L二甲基亞硝胺生理鹽水稀釋液， 腹腔注射共10次。用藥8w大鼠可引起肝纖維化。該模型可用于研究肝硬化向肝癌轉(zhuǎn)化機(jī)理。但由于是致癌物，實驗中慎用，同時這一模型死亡率較高。

1.3 硫代乙酰胺（thioacetamide， TAA） TAA具有直接肝毒性作用， 長期給藥可引起肝細(xì)胞的變性壞死甚至癌變。TAA常用于制作急性肝損傷、肝纖維化和肝性腦病模型。王春妍等采用皮下注射TAA600mg/kg制作大鼠急性肝損傷動物模型[4]。TAA可作用在肝細(xì)胞DNA、RNA和蛋白合成酶上產(chǎn)生毒性作用， 還可誘肝的代謝紊亂， 而致肝壞死王鶴樺等[5]用5%硫代乙酰胺（生理鹽水配制， 過濾除菌）皮下注射， 2次/w， 共12w， 誘導(dǎo)肝纖維化。此模型具有良好的可行性和重復(fù)性、肝纖維化組織接近人類，制備成功率高等優(yōu)點， 常用于制作肝纖維化和急性肝功能衰竭模型。

1.4 D-氨基半乳糖（D-galactosamine， D-Galn） 半乳糖胺致肝損傷的機(jī)制主要是干擾核酸及蛋白質(zhì)的合成， 造成內(nèi)毒素血癥， 產(chǎn)生氧自由基及脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致膜機(jī)能障礙， 損傷線粒體致氧化磷酸化受損， 最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[6]。此外，D-GalN 也可通過破壞細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)而起作用。給藥方式有皮下、腹腔內(nèi)和靜脈注射。病理學(xué)特點是似小結(jié)節(jié)性，結(jié)節(jié)為再生肝細(xì)胞團(tuán)，由結(jié)締組織包圍，為多層網(wǎng)狀纖維，可見膠原及彈性纖維。此種模型的癥狀、生化、組織學(xué)表現(xiàn)接近于人，重復(fù)性好，對肝纖維化、肝癌、肝衰竭、肝性腦病等研究有重要價值。但此法因 D-GalN 價格較高而使其應(yīng)用受到限制。

2 免疫性肝損傷動物模型

2.1 腹腔注射異種血清 早在60年代就證明了免疫反應(yīng)能引起肝損傷，異種動物血清或異體蛋白反復(fù)注入動物體內(nèi)后，刺激動物形成過量的免疫復(fù)合物，抗原可用豬、牛、馬血清、豬白蛋白、血清球蛋白，人γ球蛋白等反復(fù)注射，5w引起肝纖維化，10w引起肝硬化。國內(nèi)王寶恩等[7]于1989年創(chuàng)立了良好的免疫性肝硬化模型，采用不同方法通過人血清白蛋白來制備鼠肝纖維化模型。該模型在發(fā)病機(jī)理上歸屬免疫損傷，與人類慢性肝炎所致的肝纖維化較相似，因此適合免疫方面肝纖維化發(fā)病機(jī)制的研究，但仍與人類病毒性肝炎免疫損傷所致的肝硬化有差距，因其沒有病毒持續(xù)復(fù)制及肝實質(zhì)持續(xù)損傷過程。

2.2 通過腹部皮膚感染血吸蟲法 動物如兔、小鼠感染血吸蟲后所致肝纖維化與人類肝纖維化較為接近。通過腹部皮膚使動物感染血吸蟲尾蚴，特別是小鼠被認(rèn)為是研究纖維化因子剌激下膠原代謝等問題的最好模型。小鼠皮下注射曼氏血吸蟲尾蚴后6～8w，肝臟形成肉芽腫， 肝超聲顯像檢查，門脈區(qū)寄生蟲卵的免疫反應(yīng)引起的炎癥，確定達(dá)到肝纖維化。此模型病變特殊，可用于研究血吸蟲病性肝硬化，但不適于研究其它類型的人類肝纖維化。

2.3 卡介苗（bacillus calmet te-guerin vaccine， BCG）和加脂多糖（lipopoly- saccha ride， LPS） BCG的損傷機(jī)制可能是小鼠注射BCG后導(dǎo)致多核中性粒細(xì)胞或巨噬細(xì)胞（肝內(nèi)庫普弗細(xì)胞）聚集于肝臟并被致敏， 繼而用低劑量LPS攻擊， 促進(jìn)其釋放大量對肝細(xì)胞有毒性作用的細(xì)胞因子，如白三烯、TNF、IL-1和NO等， NO作為自由基， 可以與O2- 反應(yīng)生成超氧化亞硝酸陰離子（ONOO-） 以及其他自由基引起脂質(zhì)過氧化造成肝細(xì)胞損害[8]。

2.4 尾靜脈注射血清蛋白 該方法通過大鼠尾靜脈注射人血清蛋白造成肝纖維化模型。2次/w，劑量從2.5mg開始，以后以0.5mg/w增加，直至增加到4mg，復(fù)制模型時間為2個月。該模型復(fù)制成功率高、重復(fù)性好、自然恢復(fù)慢、不易自發(fā)逆轉(zhuǎn)，且病理過程和形態(tài)學(xué)變化與人類肝纖維化及肝硬化相似，可用于篩選抗肝纖維化的藥物。但該模型尾靜脈注射操作要求高，反復(fù)注射可造成靜脈炎癥。以BCG漿液每只0.2ml（含>5×106菌）注射小鼠尾靜脈，致敏后10d，再尾靜脈注射LPS每只7.5μg，成功誘導(dǎo)小鼠肝損傷模型。確定BCG菌數(shù) 5.0×107+ LPS 劑量30μg/kg聯(lián)合最佳，能夠充分造成大鼠急性肝損傷[9]。BCG和LPS肝損傷動物模型簡便易行，且造成的大鼠急性肝損傷與病毒性肝炎發(fā)病機(jī)制有較大相似，可用于對病毒性爆發(fā)性肝炎的研究。

3 酒精誘導(dǎo)大鼠肝纖維化的模型

過度飲酒是人類肝纖維化的重要原因之一，其發(fā)病機(jī)理和治療方面的研究也被大家所廣泛關(guān)注采用，大鼠飲用40%乙醇[10]持續(xù)29w。結(jié)果表明，肝細(xì)胞壞死，肝脂肪變性，肝內(nèi)形成中心性纖維化。乙醇能增加機(jī)體對膽堿需要量，因此有人認(rèn)為乙醇在伴有營養(yǎng)缺乏時才能進(jìn)而形成肝硬化，近年來采用液體食物按熱量配制，蛋白18%、脂肪21%、糖61%，其中糖的50%熱量由乙醇代替。實驗1～3年，1/3動物發(fā)生肝硬化。液體食物可完全控制食物與酒精的攝入量。缺點為因大鼠天生厭酒，對酒的代謝也較快，劑量過低模型不易成功，劑量過高死亡又增加，死亡率為30%～40%左右，實驗周期長，可造成大鼠急性酒精性肝損傷。

4 膽汁性肝硬化模型

通過結(jié)扎、切斷動物的膽總管， 造成膽管完全梗阻、膽汁排出受阻、膽管壓力增高、肝內(nèi)膽汁淤積， 從而引起肝細(xì)胞分泌功能障礙， 導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死、增生，肝硬化形成，已在大鼠、兔等動物上取得成功。造模方法簡單，操作安全無毒，周期短，大鼠6w左右即形成肝硬化門靜脈高壓。觀察其膽道系統(tǒng)變化情況， 膽總管自狹窄以上呈不同程度擴(kuò)張， 有的呈現(xiàn)串珠樣擴(kuò)張。實驗性膽汁性肝纖維化、肝硬化模型， 被認(rèn)為是一種能模擬人肝纖維化的較理想動物模型。

5 多因素造模

5.1 CCl4加苯巴比妥 1969年首先由Mclean[11]使用于飲水中加入苯巴比妥（350mg/L），加CCl4蒸氣吸入，以后有人改為CCl4灌胃，在飲用苯巴比妥2w后，灌胃，開始劑量為0.04ml，以后按體重增減調(diào)整CCl4用量，用此方法縮短了肝硬化形成時間，早期肝纖維化4～6w形成，8～10w形成肝硬化，死亡率仍在40%左右。此模型對可用于研究慢性肝硬化疾病代謝、免疫和生物學(xué)方面改變的進(jìn)展。與單一運(yùn)用CCl4相比，其方法簡單，縮短建模時間，成模率高且死亡率低。出現(xiàn)病變分期明顯，有助于研究外在因素對肝纖維化進(jìn)程的干預(yù)作用。能造成持續(xù)性肝損傷，又不易引起急性肝功能衰竭。

5.2 CCl4加乙醇 乙醇與聯(lián)合應(yīng)用造模已有較多成功報道。兩者相輔相成，乙醇能誘導(dǎo)P450活性從而增加CCl4的肝毒性，在乙醇的致肝脂肪變作用下使用能加速肝細(xì)胞壞死，造模時間明顯縮短，同時可減小兩者劑量以降低藥物副反應(yīng)與動物的不耐受現(xiàn)象。吳孟超[12]報道在大鼠腹腔注射5%起始濃度CCl4色拉油溶液，按0.1ml/kg劑量， 前2w1次/w，第3w開始3d/次，從第3w開始藥物濃度每2次提高2%，劑量維持在0.1ml/kg～0.2ml/kg，將10%乙醇水溶液為唯一飲用水。與乙醇合用使造模時間縮短，藥物劑量減少，降低藥物不良作用。此模型具有動物死亡率低、肝硬化成功率高和造模時間短等優(yōu)點， 可較成功的模擬人酒精性肝硬化的小結(jié)節(jié)硬變。

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編輯/成森