響應面法對超聲波—螯合劑輔助提取石榴子多酚的優(yōu)化

摘要：以石榴（Punica granatum L.）子為研究對象，以多酚得率為評價指標，通過單因素試驗和響應面法分析，確定超聲波-螯合劑輔助提取石榴子多酚的最佳工藝條件為乙醇體積分數(shù)50%、提取溫度60 ℃、提取時間60 min、料液比1∶31（m ： v）、螯合劑六偏磷酸鈉添加量0.15%。在此條件下，石榴子多酚得率可達9.375 mg/g。通過響應面法優(yōu)化得出的回歸方程具有一定的實踐指導意義，為石榴子資源的開發(fā)提供了參考。

關(guān)鍵詞：石榴（Punica granatum L.）子；多酚；提??；響應面分析

中圖分類號：S665.4+S 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）05-1159-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.05.033

Abstract： Using pomegranate（Punica granatum L.） seeds as material and polyphenols yield as evaluation indicator， the conditions of extracting polyphenols from pomegranate seeds were optimized and confirmed with single factor experiment and response surface analysis. The optimal conditions was the concentration of ethanol 50%， extraction temperature 60 ℃， extraction time 60 min， solid-liquid ratio 1∶31（m∶v）， chelating agent six sodium metaphosphate additive amount 0.15%. Under these conditions， the yield of polyphenols was 9.375 mg/g. Regression equation derived from response surface optimization was of some practical significance， which will provide a reference for developing pomegranate seed resources.

Key words： pomegranate（Punica granatum L.） seeds； polyphenols； extraction； response surface analysis

石榴（Punica granatum L.）為石榴科石榴屬，石榴果實的各部分均含有豐富的生物活性物質(zhì)[1]，是食品、藥品、保健品等天然活性成分的可靠來源[2]。石榴子是石榴的重要部位，研究表明石榴子多酚在預防和治療心腦血管疾病、腫瘤等方面有顯著效果[3]。近年來，多酚在保健品行業(yè)受到關(guān)注[4]，石榴子多酚提取物的抗氧化作用強于維生素E[5]，因此石榴子多酚的開發(fā)具有十分重要的意義[6]。

目前，對石榴子多酚提取的研究中，多種輔助提取技術(shù)得以采用[7-10]，但鮮見超聲波-螯合劑聯(lián)合輔助提取石榴子多酚的報道。本試驗采用超聲波-螯合劑聯(lián)合輔助提取石榴子多酚，以提高石榴子多酚提取率，通過響應面分析法對提取工藝條件進行優(yōu)化，以期為石榴子資源的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石榴子：御莊生態(tài)綠色產(chǎn)業(yè)有限責任公司提供。

沒食子酸標準品（上海源葉生物科技有限公司）；碳酸鈉、無水乙醇、六偏磷酸鈉、福林酚試劑等均為分析純（成都科龍化工試劑廠）。

410HT型超聲清洗機（深圳科利爾電子科技有限公司）；ESJ210-4A型電子天平（沈陽龍騰電子有限公司）；UV-2000型紫外可見分光光度計[尤尼柯（上海）儀器有限公司]；LD-Y300A型粉碎機（永康頂帥五金制品有限公司）；LD4-2A型離心機（北京醫(yī)用離心機廠）；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海市青浦滬西儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 石榴子多酚提取工藝流程 原料→烘干→粉碎（過40目篩）→加入提取溶劑→超聲波處理→離心（4 000 r/min，10 min）→抽濾→減壓蒸餾濃縮至原體積的1/4→蒸餾水定容至100 mL→多酚提取液。

1.2.2 單因素試驗 各單因素試驗均稱取1.00 g石榴子粉末。①在料液比1∶25（石榴子粉末質(zhì)量與乙醇溶液體積比，下同）、溫度50 ℃、提取時間40 min且不添加螯合劑六偏磷酸鈉的條件下，選取不同乙醇體積分數(shù)（20%、30%、40%、50%、60%、70%）進行單因素試驗；②在乙醇體積分數(shù)50%、料液比1∶25、提取時間40 min且不添加螯合劑的條件下，選取不同提取溫度（20、30、40、50、60、70 ℃）進行單因素試驗； ③在乙醇體積分數(shù)50%、溫度50 ℃、提取時間40 min且不添加螯合劑的條件下，選取不同料液比 （1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35）進行單因素試驗；④在乙醇體積分數(shù)50%、料液比1∶25、溫度50 ℃且不添加螯合劑的條件下，選取不同提取時間（20、30、40、50、60、70 min）進行單因素試驗；⑤在乙醇體積分數(shù)50%、料液比1∶25、溫度50 ℃且提取時間60 min的條件下，選取不同螯合劑添加量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%）進行單因素試驗。通過單因素試驗，研究各單因素對石榴子多酚得率的影響。

1.2.3 響應面優(yōu)化試驗 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取對石榴子多酚得率影響較大的3個因素（料液比、提取時間、螯合劑添加量）進行響應面優(yōu)化試驗[11]，以石榴子多酚得率為評價指標，確定超聲波-螯合劑輔助提取石榴子多酚的最佳工藝條件，試驗因素及水平見表1。

1.2.4 標準曲線的繪制 分別量取標樣沒食子酸溶液（100 ？滋g/mL）0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL于10 mL棕色容量瓶中，加入5.0 mL 10%福林酚試劑，反應5 min后加入4.0 mL 7.5%的Na2CO3溶液，定容后搖勻，室溫放置1 h后，測定溶液在765 nm處的吸光度[12]。沒食子酸標準曲線的回歸方程為Y=0.082X+0.001，R2=0.999，式中Y為吸光度，X為沒食子酸含量（？滋g/mL）。

1.2.5 石榴子提取液中多酚得率的測定 吸取1 mL已稀釋的提取液于10 mL棕色容量瓶中，按照上述標準曲線繪制中的方法反應后，測定溶液在765 nm處的吸光度。將吸光度代入標準曲線方程并按以下公式計算樣品中的多酚得率。

ω=（C×V×N）/（1 000×M）

式中，ω為多酚得率（mg/g）；C為沒食子酸含量（g/mL）；V為提取液體積（mL）；N為稀釋倍數(shù)；M為樣品質(zhì)量（g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇體積分數(shù)對石榴子多酚得率的影響

乙醇體積分數(shù)對石榴子多酚得率的影響結(jié)果見圖1。從圖1中可以看出，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，石榴子多酚得率先增加后逐漸降低，當乙醇體積分數(shù)為50%時多酚得率最大，達到9.01 mg/g，提取效果最好。根據(jù)相似相溶原理，提取溶劑的極性與多酚的極性越接近，對多酚的提取效果就越好，故選用50%為最佳的乙醇體積分數(shù)。

2.2 提取溫度對石榴子多酚得率的影響

提取溫度對石榴子多酚得率的影響結(jié)果見圖2。由圖2可知，隨著提取溫度的升高，石榴子多酚得率逐漸升高，當提取溫度為60 ℃時，石榴子多酚得率達到9.11 mg/g，高于60 ℃后多酚得率趨于不變。可能是適宜的溫度可以降低提取溶劑的粘度，促進多酚在提取液中的擴散，但是隨著提取溫度的升高，會對多酚物質(zhì)中熱敏性的活性成分產(chǎn)生影響，且能耗也會增加。綜合考慮，確定60 ℃為最佳提取溫度。

2.3 料液比對石榴子多酚得率的影響

料液比對石榴子多酚得率的影響結(jié)果見圖3。圖3表明，隨著溶劑用量的增大，石榴子多酚得率逐漸提高，當料液比為1∶25時，石榴子多酚得率達到8.48 mg/g，低于1∶25后多酚得率提高不明顯。這是因為在料液比達到1∶25后，石榴子中的多酚大部分已被提取出來，此后隨著溶劑用量的增加，多酚得率變化趨于平緩。隨著溶劑使用量的增加，后續(xù)分離提純的成本也逐漸增加。綜合考慮，以料液比1∶25、1∶30、1∶35繼續(xù)對多酚的提取做響應面分析，以確定最佳料液比。

2.4 提取時間對石榴子多酚得率的影響

提取時間對石榴子多酚得率的影響結(jié)果見圖4。如圖4所示，隨著提取時間的延長，石榴子多酚得率逐漸提高，當提取時間為50 min時石榴子多酚得率達到8.57 mg/g，高于50 min后多酚得率趨于不變。這是因為在提取時間達到50 min后，石榴子中的多酚大部分已被提取出來，此后隨著提取時間的延長，多酚得率變化趨于平緩。隨著提取時間的延長，提取效率降低，成本也逐漸增加。綜合考慮，以提取時間50、60、70 min繼續(xù)對多酚的提取做響應面分析，以確定最佳提取時間。

2.5 螯合劑添加量對石榴子多酚得率的影響

螯合劑添加量對石榴子多酚得率的影響結(jié)果見圖5。從圖5中可以看出，螯合劑六偏磷酸鈉添加后，石榴子多酚得率有所提高，添加量為0.1%時多酚得率已達到9.30 mg/g；但是隨著螯合劑添加量的增大，多酚得率逐漸降低。這是因為螯合劑六偏磷酸鈉能與多價金屬離子絡(luò)合形成可溶性金屬絡(luò)合物，能與有機大分子競爭金屬離子，從而使有機大分子游離出來，有利于多酚的提?。坏侨绻蟿┨砑恿窟^大，會結(jié)合提取液中的水分，使提取液極性降低，導致多酚在提取液中溶解度降低。綜合考慮，以螯合劑添加量為0.1%、0.2%、0.3%繼續(xù)對多酚的提取做響應面分析，以確定最佳螯合劑添加量。

2.6 響應面優(yōu)化試驗結(jié)果

Box-Behnken試驗結(jié)果見表2。使用Design Expert 8.0軟件對表2的數(shù)據(jù)進行處理，得到表3回歸分析結(jié)果，利用軟件進行非線性回歸的二次多項式擬合，得到預測模型為Y=0.513 875A+0.934 75B+10.725C-0.000 05AB-0.035AC-0.04BC-0.004 2125A2-0.015 25B2-24.375C2-21.075。

回歸方差分析顯著性檢驗表明，該模型回歸極顯著（P<0.000 1），失擬項不顯著，說明該模型與實際試驗擬合較好，自變量與響應值之間線性關(guān)系顯著，可用于石榴子多酚提取工藝試驗的預測。方程的一次項中B、C對響應值的影響達顯著和極顯著，二次項對響應值影響均達極顯著水平，表明各因素對響應值的影響不是簡單的線性關(guān)系。方差分析中，F(xiàn)A=0.005 477，F(xiàn)B=6.709 703，F(xiàn)C=189.493，即各因素對多酚得率的影響程度大小順序為螯合劑添加量、料液比、提取時間。

根據(jù)回歸方程得到各因素交互作用響應面分析圖（圖6、圖7、圖8）。在模型濃度范圍內(nèi)選擇出發(fā)點，使用快速上升法進行優(yōu)化，得到的石榴子多酚提取的最佳方案為提取時間59.68 min，料液比1∶30.80，螯合劑添加量0.15%，多酚得率9.383 mg/g?？紤]到實際操作，將提取工藝參數(shù)修正為提取時間60 min、料液比1∶31、螯合劑添加量0.15%。以上述條件進行3次驗證試驗，石榴子多酚得率的平均值為9.375 mg/g，與理論預測值相比，其相對誤差約為0.09%，表明得出的回歸方程具有一定的實踐指導意義。

3 小結(jié)

采用超聲波-螯合劑輔助提取的方法對石榴子中多酚進行提取，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過響應面分析對其提取工藝進行優(yōu)化，擬合出合理的回歸模型，可較好地預測石榴子中多酚得率。確定超聲波-螯合劑輔助提取石榴子多酚的最佳工藝條件為乙醇體積分數(shù)50%、提取溫度60 ℃、提取時間60 min、料液比1∶31、螯合劑六偏磷酸鈉添加量0.15%。在此條件下，石榴子多酚得率可達9.375 mg/g。通過響應面優(yōu)化得出的回歸方程具有一定的實踐指導意義，可以為石榴子資源的開發(fā)提供參考。

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